Extracción secuencial y caracterización fisicoquímica de ácidos húmicos en diferentes compost y el efecto sobre trigo*

Sequential extraction and physicochemical characterization of humic acids in different compost and the effect on wheat

María Dolores Rodríguez Torres^1§, José Venegas González², M. V. Angoa P.² y José Luis Montañez Soto²

¹ Programa de Producción Agrícola Sustentable. Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) del Instituto Politécnico Nacional (IPN). Justo Sierra 28. Jiquilpan, Michoacán. C. P. 59510. ^§Autor(a) para correspondencia: april_8110@hotmail.com.

* Recibido: junio de 2009
Aceptado: febrero de 2010

Resumen

Las características fisicoquímicas de las sustancias húmicas contenidas en el compost, son responsables de las propiedades del suelo y de la respuesta de los cultivos a sus aplicaciones. La extracción de sustancias húmicas con una sola agitación deja cantidades considerables de compuestos en el sustrato, por lo que las extracciones secuenciales con diferentes reactivos, separan las sustancias húmicas residuales, que resulta en una estimación real de calidad del compost en el manejo agrícola. Los objetivos de este trabajo fueron: a) extraer secuencialmente las sustancias húmicas de cuatro compost de seis meses de humificación con tres soluciones; b) determinar los grupos funcionales carboxílicos, fenólicos y oxidrílicos de ácidos húmicos contenidos en el compost; c) determinar los parámetros fisicoquímicos C/N, CIC, pH, ΔpH y E₄/E₆; y d) evaluar los efectos agronómicos de sustancias húmicas sobre el crecimiento del trigo. Se emplearon compost de 6 meses de humificación de rastrojo de maíz, paja de trigo, residuos de frutas y estiércol de bovino; se realizó la extracción secuencial con NaOH 0.5M, Na₄P₂O₇ 0.1M y NaF 0.1M y se evaluaron sus propiedades fisicoquímicas. Se obtuvieron rendimientos de 21.73% para rastrojo de maíz, 15.3% con paja de trigo, 19.62% para estiércol de bobino y 16.89% con residuos de frutas. Las sustancias húmicas de los compost estudiadas, manifestaron diferencias significativas en sus propiedades, que indican moléculas distintas. Los rendimientos de la biomasa seca total no se vieron afectados por las diferentes dosis de ácidos húmicos aplicados al suelo (Tukey, a= 0.05) bajo condiciones de invernadero, ya que el tiempo del trigo bajo el efecto de ácidos húmicos, tanto en el suelo como en el follaje, no fue suficiente para obtener un efecto significativo en relación al crecimiento.

Palabras clave: compost, extracción secuencial, sustancias húmicas, trigo.

Abstract

Key words: compost, humic substances, sequential extraction, wheat.

INTRODUCCIÓN

Los residuos sólidos orgánicos generados por el hombre, se transforman en un foco de contaminación ambiental a través de la emisión de gases tipo invernadero (CO₂, CH₄ y N₂O), que llegan a ocasionar el cambio climático. El compostaje es un proceso bio-oxidativo de los residuos orgánicos en condiciones controladas de temperatura, humedad y aireación, donde participan diferentes grupos de microorganismos entre bacterias y hongos (Fortuna et al., 2003).

Estos compost suministran nutrimentos y grandes cantidades de sustancias húmicas al suelo (Roinila, 1997; Chen y De Nobili, 2004). Por lo tanto, el llevar a cabo un proceso de compostaje ayuda a la reducción de la contaminación ocasionada por los residuos sólidos orgánicos, y la importancia de llevar a cabo la extracción de las sustancias húmicas reducirá el uso de fertilizantes químicos sintéticos y por lo tanto la emisión de gases tipo invernadero.

Las sustancias húmicas (SH) tienen profundos efectos físicos, químicos y biológicos sobre el suelo, especialmente sobre aquellos que presentan malas condiciones físicas, que dificultan la producción de cultivos. Tienen un efecto estimulante para el crecimiento de las plantas; además, influyen en la movilidad de compuestos orgánicos no iónicos como pesticidas y contaminantes, removiéndolos de las soluciones acuosas. Son una reserva y a la vez fuente de N, P, S y micronutrimentos para las plantas, proporcionan energía a los microorganismos, liberan CO₂, forman y mantienen la estructura del suelo, reducen los efectos de compactación y costras superficiales, reducen la erosión, mejoran la percolación y retención de agua del suelo, amortiguan cambios de pH y salinidad en el suelo, retienen los nutrimentos por sus propiedades de intercambio catiónico, incrementan la temperatura del suelo por optimizar los regímenes hídrico, eólico y térmico; incrementan la disponibilidad de algunos nutrimentos que de otro modo formarían compuestos escasamente solubles, incrementan el almacén de nutrimentos, protegen al ambiente de la acción de metales tóxicos y algunos pesticidas (Hayes y Swift, 1978; Stevenson, 1994; Popov, 2008).

Las sustancias húmicas contienen una variedad de grupos funcionales incluyendo COOH, OH fenólicos, OH enólicos, OH alcohólicos, quinonas, hidroxiquinonas, lactosas, entre otros (Stevenson, 1994).

El estudio de la composición y estructura química de las sustancias húmicas, ha representado un problema que surge como consecuencia de la gran complejidad y heterogeneidad en la naturaleza; así como de gran diversidad molecular. En un intento por explicar o elucidar la composición y estructura de las sustancias húmicas, se han aplicado técnicas de resonancia magnética nuclear del estado sólido (NMR), espectroscopia de transformación fourier de reflectancia infrarroja difusa (DRIFTS) y espectrometría de masas de ionización suave (Peña-Méndez et al., 2007).

Los objetivos de esta investigación fueron: extraer secuencialmente las sustancias húmicas de cuatro compost mediante el uso de tres soluciones extractantes, para determinar los grupos funcionales de los ácidos húmicos contenidos en los compost; además medir los parámetros fisicoquímicos C/N, CIC, pH, ΔpH y E₄/E₆ y evaluar los efectos agronómicos de las sustancias húmicas sobre el crecimiento del trigo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Los materiales sólidos orgánicos sujetos de investigación fueron: a) rastrojo de maíz (RM) que se colectó en la finca de Cumuatillo, municipio Venustiano Carranza, Michoacán; b) paja de trigo, colectada en el predio de Jiquilpan, Michoacán; c) estiércol de bovino, se colectó del establo la periferia, Jiquilpan, Michoacán; y d) restos de fruta, fueron colectados en el mercado municipal de Jiquilpan, Michoacán.

Estos materiales se sometieron a un proceso de compostaje durante un periodo de 180 días, mediante una técnica de aireación pasiva con volteos periódicos, para airearlos, enfriarlos y humedecerlos. Este proceso se repitió periódicamente hasta obtener los compost maduros para la extracción de las sustancias húmicas.

Extracción secuencial

La extracción se llevó a cabo con soluciones extractantes a base de NaOH 0.5N, Na₄P₂O₇ 0.1N y NaF 0.1N empleando el método propuesto por Kononova et al. (1966), secuenciado cada una de las soluciones. La primera extracción se llevó a cabo con NaOH al 0.5M empleando 2 g de compost seco, molido y tamizado por una malla de 1 mm. Se agregaron 40 mL de solución extractante; la mezcla se agitó durante 24 h en un agitador eléctrico a velocidad de 180 oscilaciones por min; posteriormente se centrifugó a 3 000 rpm durante 20 min; después se decantó y el sobrenadante se conservó para su posterior análisis.

La segunda extracción se realizó agregando 50 mL de Na₄P₂O₇ 0.1N, dejando el sedimento restante en agitación durante 24 h, después se centrifugó a 3 000 rpm durante 20 min. La tercera extracción se realizó agregando 50 mL de NaF 0.1N, se dejó el sedimento restante en agitación durante 24 h, después se centrifugó a 3 000 rpm durante 20 min.

Las tres muestras sobrenadantes se mezclaron y se acidificaron hasta un pH= 2 con HCl 2N, la mezcla se dejó en reposo durante 24 h a temperatura ambiente, después se centrifugó a 3 000 rpm durante 10 min. Posteriormente se procedió a la separación de ácidos húmicos de los fúlvicos.

Purificación de los ácidos húmicos

La purificación de los ácidos húmicos fue llevada a cabo de acuerdo al método descrito por Sánchez-Monedero et al. (2002). Los ácidos húmicos (AH) fueron tratados con una solución de HCl-HF al 0.5% (5 mL de HCl y 5 mL de HF por 1 L) durante 36 h. La suspensión fue centrifugada por 15 min a 2 350 rpm y el sólido se lavó dos veces con HCl 0.1M, después se lavó con agua destilada hasta quedar libre de cloruros (prueba de AgNO₃) y finalmente los ácidos húmicos se liofilizaron para su caracterización fisicoquímica.

Para obtener las relaciones ópticas E₄/E₆, la absorbancia a 465 nm y 665 nm (Chen et al., 1977) fue medido usando un espectrofotómetro Perkin Elmer UV/Vis Lambda 2. Se determinó pH en una suspensión acuosa y con KCl 1M, el ΔpH se calculó con la diferencia de ambas lecturas. El contenido de carbono (C) fue hecho por el método de Walkley y Black (Bremner y Jenkinson, 1964). Se determinó el contenido total de grupos funcionales (grupos carboxílicos, OH fenólicos y C= O totales) y la acidez total (Kononova et al., 1966). La CIC se estimó con solución de acetato de bario 1N, por la técnica de Harada e Inoko (1980). El N total se determinó mediante el método Kjeldahl (Bremner, 1996).

Trabajo en invernadero

Para el montaje del experimento en invernadero, se emplearon contenedores con 3 kg de suelo colectado en el municipio de Jiquilpan, Michoacán, con pH 6.9, textura arcillosa, materia orgánica 2.4%, N 0.1%, P Olsen 16.4 ppm y CIC 38.6 cmol_c kg^–1.

Como cultivo indicador de la respuesta de los tratamientos con ácidos húmicos se utilizó el trigo variedad Salamanca S75, sembrándose 10 semillas por maceta. Los tratamientos se generaron con AH extractados de cada uno de los compost, con dosis de 100, 200, 400 y 800 mg kg^–1 de suelo respectivamente. La aplicación de los tratamientos al suelo se llevó a cabo al momento de la siembra. La primera y segunda aplicaciones foliares se realizaron a los 35 y 53 días después de la siembra respectivamente.

Durante el montaje del experimento se fertilizó con 100N-60P-200K, empleando como fuentes de nitrógeno la urea (46% N), de fósforo el superfosfato triple de calcio (46% P₂O₅) y potasio el sulfato de potasio (50% K₂O). El experimento se condujo por 64 días durante los cuales se realizó el riego cada tercer día a capacidad de campo; las macetas fueron cambiadas de lugar semanalmente de forma aleatorizada. Finalmente se evaluó la biomasa seca y el contenido de N (Kjeldahl Bremner, 1996).

Análisis estadístico

Los datos obtenidos se analizaron estadísticamente empleando el análisis de varianza y las pruebas de comparación de medias (Tukey, α= 0.05) correspondientes. El contenido de SH, C, N, el análisis de los grupos funcionales, E₄/E₆, ΔpH y CIC, son presentadas como el promedio de las muestras por triplicado. La altura de la planta, días de espigamiento, longitud de la raíz, producción de materia seca y contenido de N se les realizó análisis de varianza (ANOVA).

RESULTADOS

Los porcentajes de ácidos húmicos obtenidos mediante la extracción secuencial fueron: 15.3% para el compost de paja de trigo (PT), 16.89% para residuo de fruta (RF), 19.62% para estiércol de bovino (EB) y 21.73% para rastrojo de maíz (RM). La solución con NaOH 0.5N extrajo una mayor cantidad de AH de los compost de paja de trigo, residuos de frutas y estiércol de bovino respecto a las otras soluciones; únicamente en el caso del compost de rastrojo de maíz, a pesar que la solución de Na₄P₂O₇ 0.1N se utilizó en la segunda extracción superó a NaOH 0.5N. La solución de NaF 0.1N tuvo los menores rendimientos (Cuadro 1).

Los AH de los compost de estiércol de bovino y paja de trigo tuvieron el mayor contenido de C, presentando diferencias estadísticas significativas con respecto a los AH del compost de residuos de frutas y rastrojo de maíz. En cuanto al contenido de N los AH del compost de residuos de frutas y estiércol de bovino fueron diferentes estadísticamente contra el contenido de N de los AH de paja de trigo y rastrojo de maíz. La acidez total de los AH del compost de residuos de frutas, fue ligeramente mayor a los AH del compost de estiércol de bovino; estos últimos no muestran diferencias estadísticas con la acidez total de los AH del compost de paja de trigo, mientras que la menor acidez fue para los AH del compost de rastrojo de maíz.

El contenido de grupos COOH fue diferente entre los AH del compost de estiércol de bovino y el contenido de grupos COOH de AH de los compost de residuos de frutas, paja de trigo y rastrojo de maíz. El menor contenido de OH fenólicos fue para los AH del compost de rastrojo de maíz y el mayor para los ácidos húmicos del compost de residuos de frutas. En cuanto al contenido de grupos C= O los AH del compost de rastrojo de maíz y restos de frutas fueron similares, mientras que hubo diferencias estadísticas significativas entre los mencionados anteriormente y los AH de paja de trigo y AH del compost de estiércol de bovino (Cuadro 2).

Los AH del compost de rastrojo de maíz tuvieron el mayor pH obtenido en solución acuosa y mostraron diferencias estadísticas significativas entre AH de los compost de residuos de frutas, estiércol de bovino y paja de trigo. El pH en solución de KCl 1N en los cuatro AH no tuvieron la misma tendencia como lo mostró el pH en agua, ya que el pH mayor fue obtenido con los AH del compost de residuos de frutas, siguiéndole en forma descendente la paja de trigo, rastrojo de maíz y estiércol de bovino. El ΔpH de mayor intensidad corresponde a AH del compost de residuos de frutas (-0.041), seguido por los AH de paja de trigo (-0.08), rastrojo de maíz (-0.321) y estiércol de bovino (-0.34).

Por otra parte, los valores de las relaciones ópticas E₄/E₆ de AH de los compost de diferente origen fueron bajos, especialmente para AH de los compost de paja de trigo y estiércol de bovino. En cuanto a la CIC de AH del compost de paja de trigo, resultaron ser de mayor intensidad, en tanto que la CIC de AH del rastrojo de maíz fue mínima (Cuadro 3).

Resultados de invernadero

Los datos obtenidos mostraron que la aplicación de los diferentes tratamientos de AH aplicados al follaje, no produjo diferencias significativas en la producción de materia seca, altura de la planta, longitud de la raíz y días a espigamiento de las plantas de trigo (Cuadro 4).

DISCUSIÓN

En el ámbito científico se conoce que la solución acuosa de NaOH constituye un reactivo muy efectivo, por lo que extrae la mayor cantidad de SH (80%); es tanta la fuerza química que es capaz de transformar a las moléculas húmicas y generar nuevas que no llegan a producirse en forma natural (artefactos) (Stevenson, 1994). Por otro lado, también se dice que la solución de Na₄P₂O₇ es un reactivo poco efectivo, por lo que extrae un mínimo porcentaje de SH (30%); consecuentemente, no modifica las moléculas húmicas, siendo preferido por muchos investigadores(as) para estudiar de una manera objetiva las características fisicoquímicas de estos materiales (Kononova et al., 1966).

En la presente investigación se observó que la efectividad de ambos reactivos depende más del material del que provienen las SH, que de las características fisicoquímicas y del manejo de todo el proceso humificativo; lo anterior se justifica al analizar las cantidades obtenidas con ambas soluciones: en el caso de los AH provenientes del compost de rastrojo de maíz, se observó que la efectividad de la solución de Na₄P₂O₇ fue superior a la mostrada por el NaOH.

Respecto a la cantidad de AH, aquella extraída por los reactivos en este trabajo es relativamente alta (15.31% de AH extraídos del compost de paja de trigo, 16.91% de AH del compost de residuos de fruta, 19.63% de AH del compost de estiércol de bovino y 21.72% de AH del compost de rastrojo de maíz) comparada con las obtenidas por Pal y Sengupta (1985); Huang et al. (2006); López et al. (2008); Shirshova et al. (2006), quienes extrajeron cantidades que variaron de 0.43% a 8.3% al emplear diferentes técnicas para ello; sin embargo, la riqueza de SH depende del grado de humificación y de la composición de los materiales orgánicos originales, pues aquellos ricos en lignina, a través del proceso humificativo generarán mayor cantidad de ellas (Stevenson, 1994).

En cuanto a la composición elemental de AH de diferentes materiales hay muchos trabajos realizados (Kuwatsuka et al., 1978; Celi et al., 1997; Canellas et al., 2002; Campitelli et al., 2006, Shirshova et al., 2006; Loffredo et al., 2008). De acuerdo con los datos obtenidos por Steelink (1983), el contenido de carbono de los AH varía de 53.8% a 58.7% y el nitrógeno de 0.8% a 4.3%. Sin embargo, los resultados obtenidos en este trabajo muestran que en dos compost obtuvieron valores de carbono mayores PT_AH= 69.68% y EB_AH= 72.66% respectivamente; por otro lado, el contenido de N de ambos compost estuvieron en el rango 1.57% y 3.32%, respectivamente.

Pal y Sengupta (1985), concluyeron que el ácido fórmico extrae mayor porcentaje de carbono en los AH (63.72%), mientras que el pirofosfato y la acetilacetona sólo 53.87% y 50.58%, respectivamente. Por lo tanto, las variaciones en carbono podrían ser atribuidas a lo siguiente: a) a los tres extractantes usados; b) a la naturaleza del compost; y c) al grado de humificación. Los contenidos de C y N son superiores aunque con relaciones C/N menores en los AH de los compost en sus diferentes calidades (34.21 para los AH de los compost de rastrojo de maíz, 44.38 para el compost de paja de trigo, 15.8 para los AH de residuos de frutas y 21.88 para los AH del compost de estiércol de bovino).

La reactividad de las sustancias húmicas, es debida en gran medida a su alto contenido de grupos funcionales conteniendo oxigeno, incluyendo COOH, OH fenolicos o enolicos, y posiblemente a, ß cetonas insaturadas. Dsiadowiec (1994) indica que la maduración de los AH está acompañada por el aumento en la carboxílación y D'Orazio et al. (2008) mencionan que un mayor contenido de grupos carboxílicos probablemente está correlacionado a una gran oxidación.

Los materiales fueron tratados el mismo periodo de tiempo; por lo tanto, el contenido de los grupos carboxílicos es similar entre los AH de RM, PT y RF, aunque ligeramente con mayor contenido fueron los AH de EB, esto indica que el material más rápidamente transformado a AH sean los componentes del EB.

Por otro lado, la carga superficial de los coloides húmicos (ΔpH) determina su actividad en los complejos órgano-mineral (Bratskaya et al., 2008); adsorción en las superficies minerales (Jada et al., 2006) e interacciones con polielectrolitos cargados opuestamente (Kam y Gregory, 2001). El ΔpH de los AH fue negativo, esta situación probablemente sea la consecuencia de los grupos funcionales COOH que son las fuentes de sitios cargados negativamente a pH < 7 (Stevenson, 1994).

De acuerdo a Jiménez y García (1992), el aumento de los grupos funcionales aumenta la CIC; estos aumentos únicamente fueron en las fracciones obtenidas de los compost de rastrojo de maíz y estiércol de bovino (334.61 cmol_c kg^–1 y 365 cmol_c kg^–1 en los AH de RM y EB, respectivamente). Pal y Sengupta (1985), obtuvieron valores de CIC de 400 a 598.6 cmol_c kg^–1 de AH y atribuyeron estas variaciones a la acción del extractante.

En cuanto a las relaciones ópticas E₄/E₆, Kononova et al. (1966) y Stevenson (1994), indican que la absorción de luz de los AH depende directamente del grado de condensación de sus anillos aromáticos. Una baja relación E₄/E₆ indica alto grado de condensación de constituyentes húmicos aromáticos; inversamente, alta relación indica bajo grado de condensación aromática; además, ellos señalan que frecuentemente son usadas para la caracterización de materiales húmicos, relaciones menores de cinco son correspondientes a los AH. Por lo tanto, con este parámetro se puede indicar la madurez del compost (Stevenson, 1994; Wong et al., 2001).

Senesi et al. (1989); Conte et al. (2006) mencionan que las relaciones ópticas E₄/E₆ son variables espectroscópicas usadas como una función directa del peso molecular de las SH. Los resultados de este trabajo muestran que los AH de la PT y el EB con relaciones E₄/E₆ de 0.382 y 0.381, respectivamente, indican que contienen moléculas con un alto grado de polimerización; además, sus pesos moleculares y grado de aromaticidad son altos.

En cambio, los AH derivados del RM y RF con relaciones ópticas de 0.434 y 0.501 indican que contienen moléculas de menor complejidad y mayor grado de alifaticidad, aunque la diferencia entre cada uno de ellos no debería ser muy alta, debido que tienen un grado de humificación semejante. Con aumento en el tiempo de compostaje las relaciones ópticas E₄/E₆ de los AH disminuyen, de tal modo que los carbohidratos y las quinonas son mineralizados, y los compuestos fenólicos, oxidados y enlazados a grupos metoxil a los sitios de cadenas alifáticas de las SH. Al final del compostaje hay un grado adecuado de madurez y estabilidad, adquiriendo relaciones ópticas bajas (Huang et al. 2006; Sellami et al., 2008).

Con respecto al efecto de los AH de diferentes compost en la producción de trigo, los resultados mostraron que en la producción de materia seca, no encontramos diferencias estadísticas significativas, similares resultados fueron encontrados por Mackowiak et al. (2001) en plantas de trigo, ellos lo atribuyeron a que las plantas no tratadas desarrollaron retoños.

De acuerdo a Pinton et al. (1999); Eyheraguibel et al. (2008), reportaron que el efecto benéfico de las sustancias húmicas en la nutrición de plantas ha sido atribuido a la promoción de desarrollo de las raíces. Por su parte Canellas et al. (2002 y 2008) indican que hay un aumento en el crecimiento y densidad de raíces laterales. Contrario a lo mencionado por estos autores, los resultados de esta investigación muestran que hubo menor elongación de las raíces.

Por lo tanto, las diferencias entre los resultados mostrados en éste y otros trabajos puede deberse a la concentración de sustancias húmicas aplicadas. Por ejemplo, Figliolia et al. (1994); Chen et al. (1994); Eyheraguibel et al. (2008), trabajaron con concentraciones de sustancias húmicas de 16 a 27.5 mg kg^–1 de suelo, notaron los siguientes efectos al producir una acción fisiológica: i) estimularon la actividad de los microorganismos del suelo; ii) aumentó la disponibilidad en la dinámica de los nutrimentos; y iii) aumentó la actividad enzimática y fotosintética de las plantas.

Por otra parte, de acuerdo a Chang et al. (2006), la presencia de SH derivadas de compost afectan significativamente la movilidad y biodisponibilidad de metales, gracias a sus grupos carboxílicos y OH fenólicos. Nardi et al. (1999) encontraron que las fracciones húmicas que exhibían mayor cantidad de grupos fenólicos y carboxílicos mostraban el mejor efecto metabólico en Pinus sylvestris y Picea abies.

Por tal motivo, la variabilidad en los resultados obtenidos en la producción de materia seca, elongación de la raíz, longitud de la planta, días a espigamiento y concentraciones foliares de nitrógeno en el trigo se debe al carbono de los AH, al contenido de grupos COOH, OH fenólicos, las dosis de AH, CIC y ΔpH; y por lo tanto, no se puede adjudicar que propiedad o característica los AH relacionan su comportamiento.

CONCLUSIONES

La efectividad de las soluciones extractantes, está en función de los materiales originales, de su composición y del manejo del proceso de compostaje.

Las sustancias húmicas de los compost estudiados, manifestaron diferencias significativas en sus propiedades, lo que indica que las moléculas son distintas.

El tiempo que estuvo el trigo bajo el efecto de los ácidos húmicos tanto en el suelo como en el follaje, no fue suficiente para obtener un efecto más significativo en cuanto a su crecimiento.

LITERATURA CITADA

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