Actividad antioxidante de extractos metanólicos y acuosos de distintas variedades de maíz mexicano

Antioxidant activity of methanolic and aqueous extracts of different varierties of mexican maize

L. Xóchitl López-Martínez¹ y H. Sergio García-Galindo²

¹ Universidad del Papaloapan, Loma Bonita, Oaxaca. México.

Leticia Xóchitl López Martínez. Dirección postal. E-mail: llopez@naxoloxa.unca.edu.mx

Recepción: 09-08-09 
Aceptación: 12-10-09

Resumen

En este estudio se determinó la actividad antioxidante y capacidad de inhibir la formación y acción de radicales libres, y contenido de compuestos fenólicos totales y antocianinas de extractos acuosos y metanólicos de distintas variedades de maíz mexicano. El contenido de compuestos fenólicos varió de entre 65.75 a 3400 mg/100 g y las antocianinas entre 1.5 a 2052.75 mg/100 g de harina de maíz. Las variedades "AREQ516540TL" y "Veracruz 42" fueron las que mostraron la mayor capacidad de inhibir la oxidación de ABTS⁺ (2-2'azino-bis-etilbenziatoline-6-acido sulfónico) mediada por persulfato de sodio y la inhibición del blanqueamiento del β-caroteno acoplado a ácido linoléico, los mismos extractos fueron los más eficientes para reducir el radical catión DDPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil).

Palabras clave: Antioxidante, compuestos fenólicos, antocianinas, maíz pigmentado.

Abstract

Free-radical scavenging, reducing activities, total phenolics and total anthocyanins of extract aqueous, methanolic and ethanolic of eigthteen varieties of Mexican maize were determinated. The total phenolic content varied from 65.75 to 3400 mg/100 g and the total anthocyanin from 1.5 to 2052.75 mg/100 g of fresh corn kernels. Methanolic and ethanolic extract of varieties "AREQ516540TL" and "Veracruz 42" were the most capable of inhibiting sodium persulfate/O₂ mediated oxidation of ABTS⁺ (2-2-azino-bis-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) and inhibition of the β-carotene bleaching coupled to linoleic acid. These same extracts were also most efficient to reducing DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil) radical cation.

Keywords: Antioxidant, phenolic compounds, anthocyanins, pigmented corn.

Introducción

El maíz (Zea mays L.) es un cereal ampliamente consumido en México y Centro América principalmente en forma de productos tales como tortillas, tamales, y totopos,(1) así como en forma de bebidas como chicha morada la cual ha sido relacionada con beneficios a la salud en Perú (2). Los maíces pigmentados contienen compuestos fenólicos, los cuales han despertado interés por sus propiedades antioxidantes y bioactivas (1). Diversos estudios han reportado actividades antioxidantes y anticarcinogénicas de compuestos fenólicos como ácido ferúlico y cumárico y sus derivativos (3). También se ha encontrado que los extractos etanólicos de maíz morado y azul poseen actividades antimutagénicas, anticarcinogénicas y actividades contra los radicales libres; estas actividades fueron asociadas con las antocianinas presentes en los granos de maíz.

La actividad antioxidante y el contenido de compuestos fenólicos torales de algunos variedades de maíz mexicano han sido reportados (1), sin embargo, no ha sido estudiado extensivamente la capacidad antioxidante presente en la diversidad del germoplasma del maíz mexicano.

Métodos

El origen de las variedades y la pigmentación de las mismas utilizadas en este estudio se encuentran en la Tabla 1. Las muestras fueron propagadas utilizando los métodos convencionales de cultivo en México. Los granos obtenidos fueron secados al sol hasta un contenido de agua de aproximadamente 20%. Las muestras fueron molidas, mezcladas y almacenadas a -20 °C hasta el momento del análisis.

Preparación de los extractos acuosos

Cinco gramos de harina de maíz fueron mezclados con 25 ml de agua destilada y homogenizados con agitación constante en un agitador orbital (Lab-Line Orbiton Environ, Modelo 3527, Melrose Plaza, IL) a 50 °C durante 10 min. Los homogenizados fueron filtrados a través de papel filtro Whatman No. 4 y el residuo fue reextraído con 15 ml de agua destilada por 10 min más. Los filtrados fueron congelados a -18 °C y posteriormente liofilizados (12-L Free zone Freeze drier, Labcono, Kansas City, MO) por 72 h a 13.3 Pa. Los liofilizados fueron almacenados en frascos de color ámbar a 4 °C, hasta el momento de ser analizados.

Preparación de los extractos metanólicos

Cinco gramos de harina de maíz fueron molidos con 25 ml de metanol acuoso (20:80 v/v, agua: metanol) en matraces de 50 ml, en ausencia de luz a 50 °C por 2 h con agitación constante en un agitador orbital. La mezcla resultante fue filtrada a través de papel filtro Whatman No. 4 y los filtrados fueron sujetos a evaporación (Rotavapor model R110, Büchi Flawil, Suiza) a 40 °C para remover el metanol y posteriormente fueron liofilizados por 72 h a13.3 Pa. El concentrado metanólico fue almacenado a -20 °C hasta el momento de ser analizado.

Determinación de compuestos fenólicos

Los compuestos fenólicos totales en los extractos se determinaron utilizando el método de Folin-ciocalteu (1) determinaron en base a una curva estándar a una absorbancia a 765 nm. 100 μl de los extractos fueron diluidos con 500 μl de gua, posteriormente se agregaron 700 µl de una solución 0.2N del reactivo de Folin-ciocalteu, se agitó manualmente la muestra y se le permitió reposar por 3 min a temperatura ambiente antes de agregar 900 μl de una solución de Na₂CO₃ 1N y se dejó en reposo por 90 min a 25 °C en ausencia de luz, después de los cuales se determinó la absorbancia a 765 nm. Los resultados fueron expresados como mg de ácido gálico por cada 100 gr de harina de maíz.

Para el análisis de las antocianinas totales se adaptó la técnica espectrofotométrica de Abdel-Aaal y Hucl (6) por la medición de absorbancia de los extractos del maíz a pH 1.0. Un gramo de harina de maíz fue homogenizado con 5.0 ml de una solución (HCl 0.225N en etanol acuoso al 95%), colocados en viales color ámbar con agitación constante por 24 h a 4 °C; posteriormente, los extractos fueron centrifugados a 3000 xg durante 5 min y se colectó el sobrenadante. Se determinaron absorbancias a 535 nm y 700 nm. Los resultados fueron expresados como mg de cianidina 3-glucósido por cada 100 g de harina de maíz.

Actividad antiradical

La medición de la actividad antiradical de los extractos fue adaptada de Brand-Williams et al., (7). La reacción anti-radical se llevo al cabo en tubos de propileno de 15 ml a 25 °C, donde se adicionaron los extractos los cuales fueron probados a una concentración de 0.1 mM de compuestos fenólicos, se adicionaron 2.8 ml de DDPH 98.8 μM y se agitaron manualmente por 15 s. Se midió el decremento en la absorbancia a 515 nm cada 10 minutos hasta que no se presentaran cambios en la misma. Se utilizó Trolox 0.20 mM como control antioxidante y DPPH en metanol como testigo. La actividad antiradical fue expresada como porciento de cambio de absorbancia.

Potencia total de reducción

El ensayo de la potencia total de reducción fue adaptado de Pellegrini et al., (8) y se encuentra basado en la generación de una cromóforo del radical ABTS^.+ y la capacidad del antioxidante para blanquear este radical. La actividad antioxidante se definió como la concentración de trolox con actividad antioxidante equivalente a 1 mM. Se preparó el radical ABTS^.+ mezclando 5 ml de una solución ABTS 7 mM y 88 μl de una solución de persulfato de potasio 140 mM, esta mezcla reposó por 12 h en ausencia de luz o hasta que se desarrolle un color verde oscuro. Los extractos fueron probados a una concentración de 0.1 mM de compuestos fenólicos. Se transfirieron 190 μl de metanol a una celda de cuarzo y el ensayo se inició cuando se le adicionó a la celda 1 ml de la solución de ABTS preformado y se determinó la absorbancia a 734 nm después de 10 min de reacción. El porcentaje de inhibición se calculó como: % Inhibición: (Absorbancia _testigo-Absorbancia _muestra/Absorbancia_testigo) x 100.

Blanqueamiento de la solución de Β-caroteno

Este ensayo se basa en el blanqueamiento de la solución de β-caroteno y de la habilidad de los antioxidantes para inhibir la decoloración de la solución propiciada por la oxidación del ácido linoléico. Se adaptó del método de Miller et al., (9). 1 ml de una solución de β-caroteno (0.2 mg/ml en cloroformo) fue adicionada a un matraz de fondo plano de 50 ml que contenía una solución de 0.2 ml de Tween 20 y 0.02 ml de ácido linoléico, se agitó la mezcla y se le agregaron los extractos en una concentración de 0.1 mM de compuestos fenólicos. La mezcla se agitó manualmente y se evaporó hasta sequedad bajo vacío a 25 °C, posteriormente se le agregaron 50 ml de una solución de H₂O₂ al 3% y se agitó vigorosamente por 45 s hasta formar un liposoma. Las muestras fueron incubadas a 50 °C, se tomaron lecturas de absorbancia a 470 nm cada 10 min hasta 2 h a partir del momento de la adición del H₂O₂. Los extractos fueron probados a una concentración de 0.1 mM de compuestos fenólicos. La actividad antioxidante fue expresada como porcentaje de retención de β-caroteno relacionado al testigo. Se utilizó tocoferol a una concentración de 0.20 Mm como testigo.

Todos los análisis fueron realizados por triplicado.

Análisis estadístico

En todos los experimentos se utilizó un diseño de bloques totalmente al azar y una significancia de (P< de 0.05) de las diferencias entre los tratamientos y será establecida usando ANOVA de una vía utilizando el software MINITAB v.10.

Resultados y discusión

Las concentraciones de compuestos fenólicos totales y antocianinas de las variedades de maíz utilizadas en este estudio se muestran en la Tabla 2. Como puede observarse las concentraciones estuvieron comprendidas entre 170-3400 mg de ácido gálico/ 100 g para el extracto metanólico y 65.8-786 mg de ácido gálico/ 100 g para el extracto acuoso. Las diferencias entre los compuestos fenólicos extraíbles en medio acuoso y medio metanólico refleja la polaridad de los mismos y el grado en el cual puedan estar esterificados y/o glicosilados. Muchas de las variedades examinadas contuvieron niveles de compuestos fenólicos extraíbles en agua del 12-44% referido a los compuestos extraíbles por metanol. Sin embargo las variedades "rojo", "naranja", "azul" y "RO", contuvieron del 50-82% de compuestos fenólicos extraíbles con agua relativo al metanol y la variedad "blanco" exhibió la mayor cantidad de compuestos fenólicos extraíbles por agua. Estos resultados pueden indicar que el perfil de compuestos fenólicos varía considerablemente entre diferentes tipos de maíz aunque posean la misma pigmentación. Entre los grupos pigmentados se examinaron muestras de la misma coloración y los rangos de contenido de compuestos fenólicos extraíbles por metanol y agua fueron respectivamente por 100 g de harina de maíz: morado (n=5): 465-3400 mg y 145-786 mg; negro (n=4) 475-565 mg y 66-197 mg, rojo (n=4) 406-617 mg y 82-266 mg. Entre las variedades de coloración morada, "AREQ516540TL" presentó la mayor concentración de compuestos fenólicos, mientras que "Pinto" y "Nn04c1 " mostraron la mayor concentración de compuestos fenólicos entre los rojos y negro respectivamente.

El contenido de antocianinas se encontró entre 1.50 a 2050 mg de cianidina 3-glucósido/ 100 g de harina de maíz, para todos las examinados (Tabla 2). Las variedades "blanco", "amarillo" y "naranja" contuvieron el menor contenido de antocianinas, lo cual es esperado en esas coloraciones ya que los carotenoides principalmente en forma de luteína y zeaxantina, son los pigmentos más abundantes en ese tipo de muestras (10). Para las diferentes variedades examinadas se encontró que el contenido de antocianinas fue: morado: 261-2050, negro, 237529; rojo 127-431. "AREQ516540TL" y "Veracruz 42" mostraron la mayor cantidad de antocianinas entre los fenotipos color morado y "Pinto" y "Nc04c1 " mostraron la mayor cantidad de antocianinas entre los rojos y negros examinados respectivamente. Así, para las variedades examinadas, aquellas que mostraron la mayor cantidad de compuestos fenólicos, también tuvieron la mayor concentración de antocianinas (las cuales contribuyen a los niveles de compuestos fenólicos totales). En estudios realizados por De la Parra et al., (1), se determinó el contenido de antocianinas totales en variedades de maíz de coloraciones blanco, amarillo, rojo y azul, encontrando concentraciones de estos compuestos de 1.33, 0.56, 9.57 y 38.8 mg/ 100g de harina de maíz, los autores utilizaron la misma técnica de extracción que la utilizada en el presente estudio, por lo que las diferencias en los resultados pueden deberse a la variabilidad genética y el origen de cada una de las variedades utilizadas en los diferentes estudios, al igual que en el caso de los compuestos fenólicos totales (las antocianinas son parte de estos).

Capacidad anti-radical

En general lo compuestos fenólicos derivados de los extractos metanólicos fueron más efectivos para inhibir la formación de los radicales DPPH^. que sus equivalentes derivados del extracto acuoso (Figura 1 A, B). Los compuestos fenólicos libres más abundantes en el maíz son el ácido benzóico, el ácido ferúlico, el ácido cumárico y sus derivativos (3) y la actividad inhibidora de la formación de radicales de los extractos acuosos y metanólicos puede ser debida a esa porción de compuestos, así como a las antocianinas presentes en los extractos. Aunque no existe una relación significativa entre la actividad anti-radical y el contenido de compuestos fenólicos en los extractos, las variedades "ARQTL516540TL" y "Veracruz 42" fueron las más efectivos en la capacidad antiradical de las variedades examinadas. Las variedades "NO04c2" y "Nn04c1 " de coloración negra también poseen actividades inhibidoras altas comparadas con las demás variedades examinadas. Así, aquellas variedades que exhiben alta actividad inhibidora, son aquellas que poseen las más altas concentraciones de compuestos fenólicos y antocianinas. Se ha encontrado que en pruebas como ORAC las antocianinas han demostrado tener mayor capacidad antiradical que los ácidos fenólicos (11).

Potencia reductora

Los resultados del ensayo de la reducción del radical ABTS⁺ preformado, mostraron que los extractos metanólicos fueron más efectivos como agentes anti-radicales que los extractos acuosos. (Figura 2 A, B), un comportamiento similar al presentado en la actividad inhibidora (Figura 1 A, B) de los mismos extractos. Los extractos que muestran grandes actividades para inhibir la formación del radical DPPH^. fueron también aquellas con mayor actividad reductora del radical ABTS⁺, los extractos de las variedades moradas "AREQ5165OTL", "Veracruz 42" y las variedades negras "NO04c2" y "Nn04c1 ", además de los extractos de la variedad amarilla (especialmente el metanólico) y la variedad roja llamada "Pinto" fueron las preparaciones más efectivas para reducir ABTS^+. Así, las variedades con mayor concentración de antocianinas están nuevamente asociadas con altas propiedades anti-radicales, con la única excepción de la variedad "Amarillo". En un estudio previo donde se analizaron las propiedades reductoras de extractos acuosos de maíz, se encontró que a una concentración de 0.1 mM de compuestos fenólicos puede reducir aproximadamente 0.3 equivalente Trolox (12). En el presente estudio el extracto acuoso de la variedad "Amarillo"" tuvo una efectividad de reducción del radical ABTS^.+ equivalente a aproximadamente 0.35 equivalentes Trolox, este efecto puede ser explicado como que el maíz utilizado en cada estudio procede de distintos orígenes además de la variabilidad genética de los mismos.

La inhibición de las cadenas de reacción por los radicales libres en una emulsión de ácido linoléico catalizada por H₂O₂ es comúnmente derivado del efecto barredor de los oxy-radicales. En este sistema los extractos acuosos exhibieron mayor actividad antiradical que los extractos metanólicos al mismo nivel de compuestos fenólicos (Figura 3 A, B). Este efecto puede ser explicado por la polaridad de los extractos que tienen mayor capacidad de reducir los radicales oxy formados. Los extractos de las variedades moradas "AREQ5165OTL" y "Veracruz 42" y la variedad negra "N0O4c2" fueron los más efectivos para prevenir la co-oxidación de β-caroteno en este sistema. Sin embargo, también existe menor habilidad para distinguir entre la actividad antiradical de los extractos acuosos y metanólicos. La actividad anti-radical en este ensayo, entre las variedades utilizadas no se encuentra relacionanda con la cantidad de compuestos fenólicos o antocianinas presentes en el extracto. Por ejemplo, altos niveles de retención de β-caroteno fueron observados por los extractos de la variedad negra "M3n2c2" y roja "M5IG04", aunque las concentraciones de antocianinas se encuentren entre las más bajas de los fenotipos estudiados.

Conclusiones

Se analizaron diversas variedades de maíz mexicano y las actividades antioxidantes de sus extractos. Aunque el perfil específico de compuestos fenólicos y antocianinas en las muestras se encuentran relacionadas a las actividades antioxidantes observadas, existe una relación general entre el contenido de antocianinas y el nivel de actividad antioxidante relativa. Los fenotipos morados que mostraron mayor cantidad de antocianinas totales fueron AREQ51654TL y Veracruz 42 las cuales consistentemente exhiben la mayor capacidad antioxidante. Estas variedades son objeto de estudios más profundos sobre su efecto potencial como promotores de la salud, así como de la identificación de cuáles de los compuestos fenólicos son responsables de las actividades antioxidantes.

Referencias

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