Estudio de mutagenicidad y actividad antibacteriana de Erythrina herbacea, Zanthoxylum caribaeum y Dendropanax arboreus

Mutagenicity study and antibacterial activity of Erythrina herbácea, Zanthoxylum caribaeum and Dendropanax arboreus

Cynthia Ordaz Pichardo,¹ Rocío Clemente Garcés,² Ma. Edith López Villafranco,³ Mireya de la Garza,⁴ Myriam Arriaga-Alba⁵

¹ Laboratorio de Biología Celular y Productos Naturales, Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía, Instituto Politécnico Nacional.

³ Herbario Izta, Facultad de Estudios Superiores Iztacala, Universidad Nacional Autónoma de México.

⁴ Departamento de Biología Celular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN.

⁵ Laboratorio de Investigación en Microbiología, Hospital Juárez de México.

Correspondencia: 

Dra. Cynthia Ordaz Pichardo 
Laboratorio de Biología Celular y Productos Naturales 
Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía
Instituto Politécnico Nacional ]]> Guillermo Massieu Helguera No. 239 Fracc. La Escalera
Col. Ticomán, C.P. 07320, México. D.F.
Tel: 5729 6000 ext 55535 Fax: 5729 6000 ext 55561
e-mail: dra_cynthia@hotmail.com

Fecha de recepción: 24 de enero de 2014
Fecha de recepción de modificaciones: 11 de abril de 2014
Fecha de aceptación: 21 de mayo de 2014

Resumen

Palabras clave: Plantas medicinales, actividad antibacteriana, actividad mutagénica, Erythrina herbacea, Zanthoxylum caribaeum, Dendropanax arboreus.

Abstract

This study presents the phytochemical characterization and antibacterial and mutagenic evaluation of Erythrina herbacea, Zanthoxylum caribaeum and Dendropanax arboreus, used in Mexican traditional medicine for the treatment of gastrointestinal and skin infections. The extracts contained mainly amines, phenols and alkaloids when were characterized by thin layer chromatography. The aqueous extract of D. arboreus and the hexane extracts of Z. caribaeum and E. herbacea were the most active presenting MICs of < 0.78, 0.78 and 1.56 µg/mL respectively. None of the extracts has mutagenic properties when were evaluated by Ames test. These results suggest that the extracts of these plants have good potential for be used as antibacterial agents.

Key words: Medicinal plants, antibacterial activity, mutagenic activity, Erythrina herbacea, Zanthoxylum  caribaeum, Dendropanax arboreus.

Introducción

Las comunidades rurales en los países en vías de desarrollo emplean con frecuencia plantas medicinales como tratamiento alternativo para procurar su salud, debido a que los servicios médicos son inaccesibles para la mayoría de la población, ya sea por las largas distancias o los elevados costos.¹ Las plantas medicinales se utilizan con frecuencia en forma de cataplasmas o infusiones sin tener ningún conocimiento de sus propiedades químicas, genotóxicas, terapéuticas o sus dosis requeridas.

México ocupa el cuarto lugar en el mundo en diversidad de plantas y se ha informado que de las 26 000 especies de plantas que se encuentran en todo el mundo, 9 500 son endémicas de México. Se cree que el 15% de estas plantas (1 425 especies) tienen propiedades terapéuticas, sin embargo, sólo se han realizado estudios genotóxicos, farmacológicos y químicos a aproximadamente el 5 % del total de éstas. En el Estado de Tamaulipas, en el noreste de México, las plantas han sido utilizadas tradicionalmente por sus propiedades nutritivas y terapéuticas.²

El objetivo de este trabajo fue realizar la caracterización fitoquímica y la evaluación antibacteriana y genotóxica de los extractos de las plantas, Erythrina herbacea L. (Leguminosae), Zanthoxylum caribaeum Lam. (Ulmaceae) y Dendropanax arboreus (L) Dacae y Planch. (Araliaceae), utilizadas tradicionalmente por los nativos del Estado de Tamaulipas en México para tratar infecciones gastrointestinales y de la piel. Este trabajo establece si estos extractos de plantas son una buena alternativa a la terapia antibiótica tradicional. El conocimiento científico de las propiedades antibacterianas de los extractos acuosos de estas plantas dará validación y confianza a las comunidades rurales para utilizar estos extractos. Además, los tres nuevos extractos podrían ser estudiados en futuros tratamientos clínicos.

Material y métodos

Colección e identificación del material vegetal

Las raíces de E. herbacea y las cortezas y tallos de Z. caribaeum y D. arboreus fueron colectadas en 2010 en la comunidad rural de Gómez Farías, en el centro del Estado de Tamaulipas. Estas plantas se encuentran a 350 m de altitud y crecen a temperaturas que oscilan entre los 7 °C en invierno y 25 a 35 °C en verano.⁴ Después de su colección, las plantas se secaron a 40 °C y se identificaron por la M. en C. María Edith López Villafranco en el "Herbario Izta" ubicado en el campus Iztacala de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), en donde se asignaron los siguientes números de registro: E. herbacea (No. 1650), Z. caribaeum (No. 1651) y D. arboreus (No. 1652).

Preparación de los extractos

25 gramos de material vegetal seco y libre de polvo, se suspendieron en 250 mL de agua destilada, acetona (Golden Bell 30200) o hexano (Golden Bell 31220). Los extractos acuosos se filtraron y se liofilizaron (Ultra dryer EVO40FXDW) por 96-120 h a -1 °C. Los extractos con acetona y hexano se filtraron y se secaron completamente en un rotavapor (Büchi R200/205). Alícuotas de 1 mg de extracto de las plantas se almacenaron a -20 °C hasta su uso.⁵

Caracterización de los extractos por cromatografía de capa fina (ccf) y espectrometría de masas por impacto electrónico (EM-IE)

Alícuotas de 250 µL de una solución de 1 mg de extracto/mL se colocaron cuidadosamente en placas de gel de sílice (Merck 105554) y se eluyeron con una mezcla de hexano-acetato de etilo (80:20 v/v).

Los espectros de masas por impacto electrónico fueron obtenidos en un equipo Jeol AX-505 HA mass spectrometer a 70 eV.

Cultivo de bacterias y reactivos

Cepas empleadas en la prueba de actividad antibacteriana de los extractos vegetales

Las cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 29213) y Escherichia coli (ATCC25922) fueron cultivadas en caldo Müeller-Hinton (M-H) (Becton Dickinson, Cockeyvillle, MD) en un baño de agua con agitación a 37 °C durante 24 h. Los controles positivos utilizados para la inhibición del crecimiento fueron clindamicina (Cli) (Sigma C5269) para S. aureus y trimetoprima-sulfametoxazol (T-S) (Bactelan, Wyeth SA de CV, México) para E. coli.

Cepas empleadas para la prueba de actividad mutagénica

Se prepararon cultivos en fase estacionaria de las cepas de Salmonella typhimurium TA98, TA100 y TA102 en caldo nutritivo (Oxoid-No. 2) en un baño de agua con agitación a 37 °C durante 16 h. Estas cepas fueron amablemente proporcionadas por el doctor B.N. Ames de la Universidad de California (Berkeley, CA).

Reactivos

La ampicilina (Amp) (A9393), tetraciclina (Tet) (T3258), D-biotina (B4501), sal dipotásica de D-glucosa 6-fosfato (G6P) (G7375), sal sódica de β-nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP) (N0505), ácido picrolónico (AP) (P5628), N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) (129941), mitomicina C (MC) (69824-1EA), 2-amino-antraceno (2AA) (A38800) y la ciclofosfamida (CP) (C0768) fueron adquiridas en Sigma Chemical Co. (St Louis, MO., EUA). El dimetil sulfóxido (DMSO) (D7941) y la L-histidina (H6034) fueron adquiridas en E. Merck (Darmstad, Alemania). Mientras que la fracción hepática S9 se preparó como se ha descrito por Maron y Ames en 1983,⁸ induciendo con Aroclor-1254 (Analab Inc., Reino Unido).

Ensayo de actividad antibacteriana

La determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) se realizó en placas de 96 pozos, agregando 100 µL de las cepas bacterianas preparadas como se ha descrito anteriormente y añadiendo alícuotas de los extractos hasta llegar a las concentraciones entre 0.78 y 250 µg/mL. Las placas se incubaron a 37 °C durante 18 a 24 h y la densidad óptica (DO) se midió a 630 nm en un espectrofotómetro (ELx808, Bio-Tek).

Ensayo de actividad mutagénica

Alícuotas de 100 µL de las cepas de S. typhimurium TA98, TA100 ó TA102 fueron expuestas a concentraciones entre 1 y 200 µg de extracto/placa o a un control positivo adecuado para cada cepa: MC (2 ng/placa), 2AA (10 µg /placa), AP (50 µg/placa), MNNG (10 µg/placa) o CP (500 µg/placa) y como control negativo se utilizó el disolvente (DMSO). Los ensayos se realizaron en presencia y ausencia del activador metabólico S9, mezclando el contenido del tubo con ayuda de un vortex y colocándolo en placas de Vogel-Bonner que se incubaron durante 48 h a 37 °C. Las colonias revertantes de histidina (His⁺) se contaron con un contador de colonias Fisher.⁸

Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron por triplicado en tres estudios independientes y los resultados se analizaron en los programas Microsoft Excel y Statgraphics Plus versión 4.0.

Resultados y discusión

Caracterización fitoquímica por ccf

En la Tabla 1 se resumen los compuestos químicos que se encontraron en los tres extractos de las plantas estudiadas. El extracto hexánico de E. herbacea presentó la mezcla más compleja de compuestos, que consiste en ácidos grasos, aminas, fenoles, esteroides y alcaloides. En comparación, los extractos acuoso y acetónico mostraron una menor cantidad de compuestos.

En los extractos de Z. caribaeum se identificaron las mismas familias de compuestos que se encontraron en los extractos de E. herbacea pero en menor cantidad, mientras que D. arboreus tiene la menor complejidad de compuestos químicos. Algunos metabolitos primarios, tales como ácidos grasos y aminoácidos se presentaron en todos los extractos debido a que son componentes esenciales de las plantas. Es importante mencionar que la polaridad de los disolventes tuvo una influencia significativa en la separación de estos compuestos.

Propiedades antibacterianas de los extractos

Los tres extractos (agua, acetona y hexano) de las tres especies evaluadas muestran actividad contra S. aureus a la concentración de 25 µg/cilindro; resultados similares se observaron para los extractos con acetona y hexano en contra de E. coli, mientras que los extractos acuosos de E. herbacea y D. arboreus fueron activos contra esta misma especie a las concentraciones de 25 y 100 µg/cilindro, respectivamente (Tabla 2). Los valores de CMI para todos los extractos se presentan en la Tabla 3. Todos los extractos mostraron actividad inhibitoria contra S. aureus a concentraciones menores de 3.12 µg/mL, excepto el extracto acuoso de E. herbacea. Mientras que los mejores resultados contra la especie E. coli se mostraron en los tres extractos de E. herbacea con CMIs inferiores a 3.12 µg/mL y en el extracto hexánico de D. arboreus CMI < 0.78 µg/mL.

Estudio de mutagenicidad (Prueba de Ames)

La prueba de Ames en S. typhimurium demostró que ninguno de los extractos evaluados induce mutaciones por corrimiento en el marco de lectura (cepa TA98), mutaciones por sustitución en los pares de bases (cepa TA100) o mutaciones por daño oxidativo (cepa TA102). En la Tabla 4 se muestran los resultados de la prueba de Ames para estos extractos con propiedades antibacterianas, donde se puede corroborar que el número de colonias revertantes de histidina provocadas por los diferentes extractos tiene valores similares al número de colonias revertantes espontáneas en presencia y ausencia de fracción metabólica S9. Para que los extractos sean considerados como mutagénicos es necesario encontrar un incremento dos veces mayor al número de revertantes espontáneas.⁸

Diferentes especies del género Erythrina se distribuyen en todo el mundo en las regiones tropicales y subtropicales, estas especies son conocidas por ser ricas en flavonoides y alcaloides. Previamente se han reportado seis alcaloides (erisodina, erisovina, eritralina, erisopina y el hexósido de la erisopina) presentes en las semillas de E. herbacea.¹¹ Mientras que en otros estudios realizados sobre las flores de esta misma especie se encontraron seis alcaloides (10-hidroxi-11oxoerisotrina, eritarbina, 10,11-dioxierisotrina, eritrartina, erisotramidina y erisotrina-N-óxido) con capacidad atrapadora de radicales libres de peroxinitrito in vitro.¹² Y en el estudio más reciente que se ha reportado se encontraron dos nuevos alcaloides (eribacina A y eribacina B) con potente actividad antibacteriana contra diversas cepas de S. aureus resistentes a meticilina.¹³ A partir de otras especies del género Erythrina se han aislado 50 flavonoides prendados,¹⁴ que han demostrado tener diferentes efectos terapéuticos, principalmente como antihipertensivos, relajantes musculares y antibacterianos.^15-17

Por ejemplo, las isoflavonas prendadas aisladas de la corteza de la raíz de Erythrina eriotricha y la corteza del tallo de Erythrina vogelli mostraron actividad antibacteriana contra S. aureus 209P.^18,15 Mientras que los alcaloides también han mostrado propiedades curativas, incluyendo actividades antibacterianas y anti-inflamatorias.¹⁹ En este trabajo se encontró una elevada cantidad de alcaloides de manera similar a lo reportado en trabajos anteriores para las flores, semillas y raíces de E. herbacea y otras especies del género Erythrina como Erythrina crista-galli y Erythrina variegata.²⁰ Además de los alcaloides detectados en E. herbacea, encontramos aminas 4,4-bis (dietilamino) benzofenona oxima o-metil éter y la Tris(1,3,2-ditiaborolen-2-il amina), el alcaloide canadina y el fenol 6-terbutil-o-cresol, algunos de estos compuestos han sido reportados previamente.²⁰ La caracterización química de estos compuestos fue determinada por comparación de los espectros en la librería Wiley275. Aunque algunos flavonoides y alcaloides ya han sido identificados, nuevos compuestos se pueden aislar en esta planta; en este momento estamos trabajando en el aislamiento e identificación de algunos de ellos por resonancia magnética nuclear (¹H-NMR).

Respecto a la especie Zanthoxylum caribaeum no se han reportado antecedentes, sin embargo, a partir de la corteza del tallo de Zanthoxylum myriacantum se han aislado el 8,9-dimetoxi-2,3-metilen-dioxibenzofenantridieno (N-nortidina) y el 7-9-dimetoxi-2,3-metilen-dioxibenzofenantridina.²¹ De las hojas de Zanthoxylum budrunga se han aislado los alcaloides 2-(2',4',6'-trimetil-heptenil)-4-quinozolona y la lunacridina.²² De la corteza del tallo de Zanthoxylum buesgenii se identificaron los alcaloides buesgenina, decarina, sesamina, matairesinol dimetileter y metilpluviatilol²³ y a partir de Zanthoxylum madagascariense se aislaron la dihidroqueleritrina, nornitidina, norqueleritrina y la decarina.²⁴ En el presente estudio, los compuestos mayoritarios aislados de Z. caribaeum fueron el alcaloide triptamina y el aldehído 4-formil-biciclo (3.3.2) deca 2,7,9-trien-2-carboxaldehido, ambos se determinaron por EM-IE. Estos compuestos no habían sido identificados en las otras especies del género Zanthoxylum.

Los tres extractos acetónicos exhibieron el mayor efecto antibacteriano frente a S. aureus y E. coli por el método de difusión con disco en agar. Los valores de CMI de los extractos acuoso, acetónico y hexánico de la raíz de E. herbacea fueron de 25, 3.12 y 1.56 µg/mL, respectivamente contra la especie S. aureus; mientras que para la especie E. coli fueron de 1.56, 3.12 and <0.78 µg/mL, respectivamente. Estos resultados son similares a los resultados de las evaluaciones de otras especies de Erythrina.^26,27 Sin embargo, los disolventes de esos estudios fueron generalmente polares (agua, etanol y acetona) y los métodos y concentraciones utilizadas varían entre las diferentes investigaciones. Por ejemplo, el extracto etanólico de la corteza del tallo de Erythrina senegalensis ha sido evaluado sobre S. aureus y Enterobacter faecalis, mostrando CMIs de 12 y 23 µg/mL, respectivamente.²⁶ Por el contrario, el mismo tipo de extractos obtenidos de Erythrina mulungu no inhibió el crecimiento de S. aureus o E. coli, incluso a 100 µg/mL.

Pero mostraron un efecto antibacteriano muy interesante contra cepas de S. aureus manipuladas genéticamente resistentes a macrólidos y fluoroquinolonas y cepas con daño en las bombas de flujo electrónico.²⁷ Algunos investigadores han evaluado la actividad antibacteriana de extractos de otras especies del género Erythrina contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas a dosis de 1000 µg/mL, observando actividad antibacteriana contra bacterias Gram-positivas exclusivamente.^19,17 Nuestros resultados indican que la especie E. herbacea tiene una mayor actividad antibacteriana contra bacterias tanto Gram-positivas como Gram-negativas.

Respecto al género Zanthoxylum, la corteza del tallo y los tallos de las plantas se han estudiado usando disolventes no polares para la preparación de extractos principalmente. En este estudio, los extractos acuoso, acetónico y hexánico de corteza del tallo de Z. caribaeum mostraron buena actividad antibacteriana con valores de CMI de 1.56, 1.56 y 0.78 µg/mL frente a S. aureus, respectivamente y >100, 25 y 50 µglmL contra E. coli, respectivamente. Esto sugiere que la especie Z. caribaeum es un inhibidor más potente contra las bacterias Gram-positivas. En estudios realizados sobre otras especies del mismo género se ha encontrado que el extracto con diclorometano de Zanthoxylum tetraspermum contiene diversos alcaloides con actividad antibacteriana contra S. aureus a concentraciones entre 1.56 y 3.12 µg/mL, sin tener efecto inhibidor contra E. coli.²⁸ Los extractos acuoso, metanólico y acetónico de Zanthoxylum chalybeum y Zanthoxylum usambarense mostraron actividad antibacteriana contra Bacillus subtilis, Micrococcus luteus y S. aureus a 100 µg/mL, pero no contra cepas Gram-negativas de Klebsiella pneumoniae o E. coli.²⁹ Esta información refuerza la hipótesis de que los metabolitos contenidos en Z. caribaeum son antibacterianos sólo contra las bacterias Gram-positivas. En contraste, los extractos con metanol, cloroformo y hexano de Zanthoxylum rhoifolium y Z. budrunga son antibacterianos contra cepas Gram-positivas y Gram-negativas a concentraciones entre 12.5 y 200 µg/mL.³⁰ A partir de esta información, podemos concluir que incluso cuando las plantas pertenecen al mismo género, los metabolitos secundarios y la actividad biológica pueden ser significativamente diferentes, dejando abierta la posibilidad de desarrollar investigación sobre una amplia variedad de plantas medicinales.

No existen muchos estudios que reporten la actividad biológica de D. arboreus; en un trabajo reciente se reportó que el extracto acuoso y hexánico de las hojas tienen actividad contra S. aureus y S. epidermidis con CMIs de 5 mg/mL.³¹ Y en otro trabajo se encontró que el extracto etanólico de las hojas tiene actividad citotóxica contra las líneas celulares tumorales Hep-G2, A-431, H-4IIE y L-1210.³² Mientras que en otros estudios se han evaluado sus propiedades citotóxicas utilizando líneas celulares cancerosas de riñón, pulmón y ovario encontrando que el falcarinol es el responsable de la actividad citotóxica y anticancerígena en un modelo xenográfico inducido con células de melanoma humano.²⁵ En este estudio, los extractos acuoso, acetónico y hexánico de D. arboreus mostraron buena actividad antibacteriana con valores de CMI de <0.78, 3.12 y 1.56 µg/mL frente a S. aureus respectivamente y 100, 12.5 y <0.78 µg/mL contra E. coli, respectivamente. Esto sugiere que la especie D. arboreus tiene potencial antibacteriano contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.

La evaluación de la actividad mutagénica de plantas utilizadas con fines medicinales debe ser un procedimiento de rutina para eliminar el riesgo de exposición a compuestos mutagénicos presentes en los productos naturales. Generalmente las plantas medicinales carecen de efectos tóxicos, pero existen algunas investigaciones que describen la inducción de mutaciones por corrimiento en el marco de lectura, como el caso de Gnapalium spp. y Valeriana procera.³³

Sin embargo, es mayor la cantidad de plantas que tienen propiedades anti-mutagénicas y anti-cancerígenas, debido a la presencia de antioxidantes.³⁴ Ninguna de las tres plantas evaluadas en este trabajo induce mutaciones al ser evaluadas con la prueba de Ames en S. typhimurium. Estos resultados son similares al único estudio que se ha reportado en la literatura, donde los autores encontraron que los extractos acuoso y etanólico de las hojas y corteza de tallo de Zanthoxylum ailanthoides Sieb & Zucc no tienen propiedades mutagénicas, en presencia y ausencia de la fracción S9, al ser evaluadas en las cepas de S. typhimurium TA97, TA98, TA100, TA102 y TA1535.³⁵ Nuestro estudio contribuye a incrementar la lista de extractos de plantas medicinales que no son mutagénicos y por lo tanto tienen baja probabilidad de ser cancerígenos. Por lo tanto, estos extractos pueden ser utilizados con mayor confianza para propósitos medicinales.

Conclusiones

Los extractos acuosos, acetónicos y hexánicos obtenidos de E. herbacea, Z. caribaeum y D. arboreus son antibacterianos y no mutagénicos. Estas propiedades los convierten en buenos candidatos para nuevos estudios sobre su uso como antibióticos contra bacterias tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Nosotros pensamos que debe ampliarse la investigación sobre sus propiedades anti-mutagénicas y estos extractos podrían ser evaluados por su posible potencial como anti-cancerígenos.

Agradecimientos

Gracias al Fondo Mixto de Fomento a la Investigación Científica y Tecnológica CONACYT, Gobierno del Estado de Tamaulipas, por el financiamiento otorgado al proyecto: TAMPS-2005-C08-13. Al Dr. Jorge Cornejo Garrido por su apoyo en la interpretación de los resultados de espectrometría de masas.

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