Evaluación del efecto del extracto metanólico de Tagetes lucida sobre la función testicular y calidad espermática en ratas macho Wistar

Evaluation of the effect of methanol extract of Tagetes lucida on testicular function and sperm quality in male Wistar rats

Miguel A. Téllez-López,^1,3 Jaime Fco. Treviño-Neávez,³ Ma. Julia Verde-Star,³ Catalina Rivas-Morales,³ Azucena Oranday-Cárdenas,³ Javier Moran-Martínez,² Luis Benjamín Serrano-Gallardo,² Ma. Eufemia Morales-Rubio³

¹ Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Juárez del Estado de Durango

³ Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Autónoma de Nuevo León

Correspondencia:   

MBC. Miguel Ángel Téllez López
Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma
de Nuevo León
Cerrada la Luz #45, Fraccionamiento Cerradas Quintas
Lerdo, C.P. 35158, Ciudad Lerdo, Durango.
e-mail: mtellez@ujed.mx

Fecha de recepción: 21 de mayo de 2013.
Fecha de recepción de modificaciones: 18 de septiembre de 2013.
Fecha de aceptación: 20 de enero de 2014.

Resumen

Se evaluó la calidad espermática y testicular en ratas macho Wistar administradas con extracto metanólico de Tagetes lucida. Las ratas se dividieron en grupos control negativo, positivo y tratado. Se determinó la toxicidad del extracto con Artemia salina presentando una DL₅₀ de 454.03 µg/mL. El peso de los testículos, epidídimos y niveles de testosterona no mostraron diferencia significativa. Las variables espermáticas del grupo tratado disminuyeron significativamente con respecto al control, la morfología testicular evaluada en cortes histológicos mostraron vacuolización de los túbulos seminíferos. La genotoxicidad encontrada mediante el ensayo cometa sobre los espermatozoides mostró rupturas de simple cadena del ADN en diferentes niveles de migración de 170.8 UA. Se concluye que el extracto metanólico de Tagetes lucida disminuye la calidad espermática de la rata macho y afecta la estructura testicular.

Palabras clave: actividad anticonceptiva, Tagetes lucida, toxicidad, genotoxicidad.

Abstract

Key words: contraceptive activity, Tagetes lucida, toxicity, genotoxicity.

Introducción

El semen normal es una mezcla de espermatozoides suspendidos en las secreciones testiculares y epididimarias, que luego se combinan con las secreciones prostáticas, de las vesículas seminales y de las glándulas bulbouretrales. El análisis seminal por tanto permite dar información sobre la espermatogénesis y la condición fisiológica de los tejidos comprometidos.¹ En la década de los 50, MacLeod & Gold comenzaron a comparar los seminogramas de personas fértiles en pacientes con problemas para concebir un hijo, encontrando una estrecha relación entre la concentración espermática, la motilidad y su influencia en la capacidad fecundante de los varones en estudio.²

En los últimos años el análisis seminal continúa siendo una de las mejores herramientas en la investigación de la fertilidad masculina y la que brinda la mejor información previa para evaluar la calidad reproductiva de los varones,³ dentro del campo de la salud reproductiva, la infertilidad implica una deficiencia que no compromete la integridad física del individuo ni amenaza su vida.⁴

Se han llevado a cabo Investigaciones sobre el desarrollo de un anticonceptivo hormonal para los hombres, análogos a los estrógenos y las píldoras de progesterona utilizadas con tanto éxito por las mujeres debido a que los preservativos y la vasectomía tienen cada uno deficiencias.⁵

Para los países desarrollados y subdesarrollados el crecimiento de la población está afectando no solamente la economía sino también los aspectos sociales.^6,7

Actualmente muchos gobiernos y dependencias no gubernamentales se encuentran trabajando para controlar el crecimiento desmedido de la población. A pesar de esto, en los últimos años, la población está aumentando a un ritmo alarmante.⁷ La población mundial supera los 7 mil millones de habitantes y está aumentando en 80 millones al año. Organizaciones de Planificación familiar estiman que la mitad de todos los embarazos no son planeados y la mitad de los embarazos resultantes son no deseados.⁵ Esto último ocasiona aumento de las tasas de aborto, niños no deseados, incremento de la pobreza y abandono. Por consiguiente existe la necesidad de un mejor acceso a los anticonceptivos existentes, una mejor educación sexual y una mayor opción en la selección de anticonceptivos.^5,8

Los anticonceptivos ofrecen una forma eficaz de regular la fertilidad y proteger la salud, aunque el acceso de las parejas y los adolescentes a éstos puede verse limitado por factores como la falta de información y sus condiciones económicas.⁸

Las plantas medicinales se han utilizado como medicina para el tratamiento de una amplia gama de enfermedades desde tiempos antiguos. A pesar del gran avance observado en la medicina moderna en las últimas décadas, las plantas todavía hacen una importante contribución a la salud.¹⁰ En la actualidad muchos de los medicamentos empleados para el tratamiento de diversas enfermedades incluyendo el cáncer, son obtenidos de especies vegetales.¹¹

Históricamente desde el siglo XIX las plantas han contribuido en el desarrollo de los anticonceptivos orales femeninos, pero la búsqueda de nuevos anticonceptivos masculinos se encuentra en una etapa incipiente.⁶

La regulación de la fecundidad con plantas o preparados de plantas han sido reportadas en la literatura médica antigua de los pueblos indígenas. Un gran número de especies de plantas con efectos anticonceptivos han sido analizados en China y la India hace unos 50 años y se reforzaron posteriormente por los organismos nacionales e internacionales.¹²

En México son pocas las fuentes que reportan métodos anticonceptivos tradicionales, en razón de que existen grandes prejuicios, tanto religiosos como morales, así como temor a enfermedades de transmisión sexual y trastornos que pudieran sobrevenir por su uso. Sin embargo, determinantes de tipo económico son generalmente los que propician la necesidad de prevenir un nuevo embarazo.¹³

Tagetes lucida Cav., es una especie vegetal de la familia Asteraceae, conocida con el nombre común en Guatemala, Honduras, México, Costa Rica, entre otros países, como anisillo, pericón, hierbanís o hierba de San Juan.¹⁴

En medicina tradicional, Tagetes lucida se ha empleado en diversos problemas gastrointestinales, abortivo, inductor del parto, trastornos ginecológicos, dolores menstruales y enfermedades infecciosas.^14-16 Sin embargo estudios sobre la fertilidad masculina en esta especie no se han reportado a la fecha, por lo que el objetivo de este trabajo fue evaluar su actividad contraceptiva en ratas macho.

La composición química de T. lucida ha sido estudiada previamente, desde 1938, cuando se logró identificar el metil chavicol en alta concentración. Este mismo componente ha sido identificado por diferentes autores en T. lucida. En México a partir de un extracto metanólico de T. lucida se aislaron 4 compuestos cumarínicos. De la raíz se aislaron 3 bitelinos y un alfa-tertienil. Cuatro flavonoides glucosídicos fueron identificados de las partes aéreas, un trabajo realizado en Guatemala revela la presencia de un nuevo flavonoide glicosídico y dos nuevos ácidos fenólicos aislados de las hojas secas.¹⁷

Materiales y métodos

Vegetal

Las partes aéreas de plantas de Tagetes lucida fueron recolectadas en el poblado Yerbanís, ubicado en la región del semidesierto Chihuahuense, en el Estado de Durango, al Norte de México, localizado en las coordenadas: Latitud 24.9, Longitud -104.067 (API Google Maps).

Un ejemplar fue montado en prensa botánica y se depositó en el Herbario de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, para su identificación, extendiéndose el Boucher # 009/2012.

Animales de experimentación

Las ratas macho Wistar fueron adquiridas en la empresa Harlam, Laboratories, SA de CV (México, DF) y fueron alojadas en el Bioterio de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Coahuila. La edad de los animales fue seleccionada de acuerdo a los eventos de maduración en el ciclo reproductivo de la rata.¹⁸

Para cumplir con los lineamientos internacionales sobre el uso adecuado de los animales de experimentación, el protocolo de investigación fue sometido al comité de Bioética de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Coahuila y aprobado de acuerdo a la NOM-062-ZOO-1999.¹⁹

Huevecillos de Artemia salina

Para el bioensayo de letalidad de A. salina, se adquirieron huevecillos en Estados Unidos (Brine Shrimp Eggs San Francisco Bay Brand INC).

Diseño experimental

Grupo I (Grupo tratamiento): Se les administro 50 mg kg^-1 de extracto metanólico de Tagetes lucida diariamente suspendido en agua destilada por vía oral durante 45 días.

Grupo II (Grupo control positivo): Se les administró 50 mg kg^-1 de Undecanoato de testosterona diluido con aceite de oliva extra virgen estéril por vía intramuscular en dosis única.

Grupo III (Grupo control negativo) Se les administró un mL de agua destilada estéril (vehículo) diariamente por vía oral durante 45 días.

Obtención de extractos

El material vegetal se colocó en un desecador con aireación por un periodo de 5 días a 45 ° C, una vez seco se molió en un molino mecánico (Wiley) obteniendo un polvo fino.²⁰

Para la obtención del extracto metanólico se pesaron en una balanza analítica (Ohaus) 30 g de material vegetal seco triturado y se adicionaron 300 mL de metanol (CTR Scientific) grado reactivo en un matraz Erlenmeyer, se tapó con papel parafilm y se agitó a baja velocidad en un agitador (Dual Action Shaker Lab-Line) y temperatura ambiente por 24 h, el macerado se filtró en papel filtro (Whatman International LTD. England) de poro grueso en matraz Kitazato con bomba de vacío (Auto Science), repitiendo el proceso tres veces utilizando la misma cantidad de solvente nuevo en cada ocasión. El filtrado del macerado se destiló en un Rotaevaporador (LEV211-V) para separar el solvente, el extracto crudo se llevó a sequedad completa en una estufa de aire caliente (Riossa) a temperatura menor a 50° C. Los extractos secos se almacenaron en refrigeración a 4° C en frasco ámbar hasta su utilización.^{20, 21}

Análisis fitoquímico preliminar para identificación parcial de metabolitos secundarios

Para la determinación inicial de los principales principios activos presentes en los extractos metanólicos de T. lucida, se realizaron pruebas químicas de identificación. Las soluciones de los extractos se prepararon a una concentración de 50 mg/mL disueltos en metanol. Se utilizaron placas de cerámica de 12 pozos para las reacciones con el propósito de identificar esteroles, metilesteroles, flavonoides, saponinas, sesquiterpenlactonas, alcaloides, instauraciones,oxhidrilos fenólicos, grupo carbonilo y azúcares.²²

Toxicidad del extracto metanólico de T. lucida sobre A. salina

Se pesaron 0.1 g de huevecillos de A. salina (Brine Shrimp Eggs San Francisco Bay Brand INC) y se depositaron en un recipiente de vidrio de color negro dividido por una pared intermedia con un espacio en la parte baja de 2 mm, con 100 mL de agua de mar artificial, se mantuvieron en condiciones de oscuridad y oxigenación. Uno de los compartimentos se iluminó con una lámpara de 20 watts de luz blanca. Después de 48 h de incubación se tomaron 10 nauplios con micropipeta (LabMate Soft) para transferirlos a una microplaca de 96 pozos, se adicionaron 100 µL de la suspensión de nauplios/pozo más 100 µL de las diluciones de los extractos diluidos en agua de mar. Se utilizaron 50, 100, 250, 500 y 1000 µg/mL de extracto en cinco repeticiones. Como control positivo se utilizó dicromato de potasio a concentración de 400 ppm²⁵ y agua de mar como control negativo. Después de 24 h y con la ayuda de un microscopio estereoscópico (Labomed), se contaron los nauplios vivos y muertos por concentración, y se calculó la Dosis letal media (DL₅₀) del extracto utilizando el método estadístico Probit de Finney.²⁶

Evaluación de los niveles séricos de testosterona en ratas macho Wistar

Transcurridos los 45 días de administración oral del extracto y/o controles, se sacrificaron los animales por dislocación cervical. Se extrajo 1 mL de sangre por punción cardiaca, se obtuvo el suero sanguíneo dejando coagular la muestra durante 2 h a temperatura ambiente y posteriormente se centrifugó por 20 min a 1000 rpm. Se removió el suero inmediatamente y se almacenó a -20 °C para su posterior análisis.

La determinación de testosterona se llevó a cabo con la técnica de ELISA con kits comerciales (NovaTein Biosciences^®) según el protocolo y la lectura de las absorbancias se realizó por medio de un lector de placas de ELISA modelo WH100.²⁷

Evaluación de los parámetros de la calidad espermática

Se obtuvo semen de los vasos deferentes y de la cola de los epidídimos, por medio de una incisión abdominal con la retracción del escroto, cortando el epidídimo en las ratas.

La región más caudal de los epidídimos y los conductos deferentes se colocaron en una placa de Petri con 2 mL de solución de NaCl al 0.9% a 4°C, con una aguja calibre 30 G se realizaron perforaciones para facilitar la dispersión del esperma. Se determinó la concentración espermática en cámara de Neubauer siguiendo el procedimiento utilizado para el conteo de glóbulos rojos, la cantidad de espermatozoides por macho se expresó en millones/mL de suspensión.

La morfología se evaluó en alícuotas de suspensión fijadas en formol y extendida en un portaobjetos, se tiñeron con eosina y se examinaron bajo microscopio óptico a 1000 aumentos. Por cada macho se analizaron 100 espermatozoides identificando normales y no normales.^{28, 29}

Las células consideradas morfológicamente anormales fueron aquellas que presentaron cabeza triangular, colapsada o en martillo, presencia de curvatura a nivel de la pieza intermedia, cola rectilínea o con curvatura (en distintos grados) tanto en la porción media como distal de la misma.³⁰

Electroforesis en gel de células individuales (Ensayo cometa)

En las ratas macho en estudio se evaluaron 5x10⁵ espermatozoides/mL ajustados y suspendidos en agarosa (CONDA®) de bajo punto de fusión al 0.5% en láminas portaobjetos pre-tratadas con 100 de agarosa de punto de fusión normal (CONDA®) al 0.5%, se incubaron 10 min a temperatura ambiente, los portaobjetos se colocaron en solución de lisis número 1 (2.5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 10% DMSO y 1% de Triton X 100) a un pH 10.0 a 4 °C durante 4 h. Posteriormente, los portaobjetos se depositaron en solución de lisis número 2 (2.5 M NaCl, 100 mM Na₂ EDTA, 10 mM Tris, 200 µg/mL de proteinasa K y 300 mM de DTT) con pH 7.4, a 37.5 °C durante 18 h. Terminada la lisis número 2, se incubaron en tampón de electroforesis (NaOH 0.3 M, EDTA 200 mM) a pH 13.0 a 4 °C durante 10 min en cuarto oscuro. Luego se realizó una corrida electroforética a 25 V y 100 mA/10 min. Se lavaron los portaobjetos con tampón neutralizante (0.4 M Tris-HCl; pH 7.5) y se deshidrataron con metanol puro. Una vez secas se sometieron a tinción con bromuro de etidio (SIGMA®) 35µL a 4X, se observó en microscopio de fluorescencia (Labomed LX-400) a 40X.

Se analizaron 100 células por cada rata y se clasificaron por niveles de migración: ninguna, corta, media, larga y muy larga. A estos niveles se les asignaron valores numéricos (0, 1, 2, 3 y 4). Se analizan las unidades arbitrarias según Collins en el 2004.³¹

UA= 0 x TCG0 + 1 x TCG1+ 2 x TCG2 + 3 x TCG3 + 4 x TCG4.

0TCG0= Total de células grado 0

1TCG1= Total de células grado 1

2TCG2= Total de células grado 2

3TCG3= Total de células grado 3

]]> 4TCG4= Total de células grado 4

Evaluación histológica de testículo de rata

Después del periodo de tratamiento de las ratas macho se tomaron muestras de testículo y se procesaron por la técnica convencional histológica hasta su inclusión en bloques de parafina. Posteriormente mediante microtomía se obtuvieron cortes histológicos de 5 µ de grosor que se tiñeron con Hematoxilina- Eosina (H y E) para su evaluación histológica general. Las muestras se analizaron a microscopia de luz.³²

Resultados y discusión

La especie vegetal seleccionada para este estudio fue elegida en base a estudios previos sobre la actividad biológica, aplicación etnofarmacológica y por su distribución en la Región de la Comarca Lagunera de Durango, al Norte de México. Se sabe que determinados rangos de temperatura e intensidad lumínica intervienen de manera directa en el comportamiento de estas plantas, tanto en su crecimiento y desarrollo, como en la biosíntesis de los principios activos.³³

Un ejemplar vegetal debidamente prensada fue entregada para su identificación al Herbario de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro el cual extendió el Boucher # 009/2012. El rendimiento de la extracción fue de 6.12 %. En las pruebas fitoquímicas realizadas al extracto metanólico de T. lucida se identificaron saponinas, flavonoides, esteroides, alcaloides y antocianinas, al respecto existen reportes de que T. lucida es una especie medicinal cuyo principal compuesto activo acumulado en las partes aéreas, es un aceite esencial constituido fundamentalmente por metilchavicol, se refiere que posee además 7 cumarinas y 3 flavonoides, en especial patuletina y constituyentes fenólicos,³³ así mismo se ha reportado la presencia de terpenoides en las hojas y tienilos en la raíz.³⁴

Estos resultados nos permiten corroborar que los compuestos presentes en T. lucida, pertenecen a los mismos grupos funcionales que previamente se han reportado en la literatura.

Por ser un método sencillo y económico para la búsqueda primaria de toxicidad en extractos crudos³⁵ se empleó el bioensayo de letalidad de A. salina, el extracto metanólico de T. lucida resultó activo, no toxico con una DL₅₀ de 454.03 µg/mL. En otro estudio se reportó que el extracto hexánico de flor, hojas y raíz de esta especie, presentan una elevada toxicidad con el bioensayo de A. salina siendo la excepción el extracto metanólico el cual según los criterios de Meyer lo considera bioactivo.³⁶

Durante el periodo de acondicionamiento y tratamiento de las ratas se llevó a cabo el control de peso corporal de los animales en estudio (tabla 1), observando que los pesos corporales no mostraron alteración significativa durante la alimentación en el tratamiento, resultados similares pero con extracto de semilla de Abrus precatorius indican que el extracto no promueve el aumento de peso que causa la obesidad o retención de agua.¹⁰ En la tabla 2 se muestran los pesos y la longitud de los testículos y epidídimo al término del experimento; en la cual observamos diferencia entre los promedios de la longitud y peso de los testículos, así mismo no se encontró diferencia en los pesos de los epidídimos del grupo tratado con T. lucida y el grupo control. Estos resultados son diferentes a lo que se encontró con el extracto de semilla de Madhuca latifolia donde se reportó la disminución del tamaño de los testículos en ratas, en concordancia con la disminución en los niveles plasmáticos de testosterona⁶ observándose que en esta investigación los niveles de testosterona si se ven comprometidos. Otro estudio muestro que la administración del extracto de semilla de Abrus precatorius en ratones machos ocasionó una disminución significativa del peso del testículo y del epidídimo en ratones con respecto al control lo cual pudo ser atribuido a la pérdida de espermatozoides en los testículos,¹⁰ observándose en ésta investigación que la estructura testicular se ve afectada, más sin embargo los parámetros de peso y longitud del testículo no mostró diferencia significativa ni los pesos de los epidídimos.

Por otra parte la reducción significativa de testosterona en suero ocasionó la completa supresión de espermatozoides en ratas administradas con dienogestel más undecanoato de testosterona, contrario a lo que se ha descrito en seres humanos en los que a pesar del cese de la administración de testosterona intratesticular la espermatogénesis continúa, aunque a niveles marcadamente reducidos.³⁸

En la tabla 3, se muestran los resultados de la evaluación de la calidad espermática: concentración, motilidad, viabilidad espermática, así como el ensayo cometa donde se evaluó el daño en las cadenas de ADN del núcleo de los espermatozoides; parámetros andrológicos que son evaluados para determinar la fertilidad de un sujeto masculino.³⁹

En el grupo tratado con extracto metanólico de T. lucida disminuyó significativamente (p<0.05) la concentración, motilidad y viabilidad espermática respecto al grupo control negativo, así como la motilidad y viabilidad del grupo tratado con T. lucida, respecto al grupo control positivo mostró una disminución significativa (p<0.001).

En otra investigación con ratas donde se administró extracto etanólico de Lagenaria breviflora presentaron anormalidades en la morfología espermática pero la viabilidad de las células estaban dentro del rango que las ratas control, lo que demuestra que el extracto no afectó la viabilidad de espermatozoides pero causó la deformación de las células afectando su movilidad;³⁹ caso contrario a este estudio donde los parámetros de la concentración espermática, motilidad y viabilidad fueron afectados significativamente en comparación con el grupo control. Otro reporte con extracto etanólico al 50 % de la raíz de Martynia annua dio como resultado un nulo conteo de los espermatozoides testiculares y epididimales causando lesiones en los túbulos seminíferos relacionados con la dosis administrada.¹²

Los resultados en el ensayo cometa (figura 1) muestran que el ADN nuclear de los espermatoziodes del grupo control positivo y el grupo tratado con el extracto metanólico de T. lucida mostraron alteraciones morfológicas a las dosis expuestas en los grupos experimentales.

En la tabla 3 se presentan los resultados obtenidos del ensayo cometa, mostrando una diferencia significativa (p<0.001) con respecto al tratamiento y el grupo control negativo. Con el ensayo cometa en el grupo tratado con el extracto de T. lucida de las células evaluadas por cada una de las unidades experimentales se observó que un 46.7 % de las células se observaron dentro del nivel de daño 2, lo que indica un daño moderadamente bajo, con frecuencia moderadamente alta de lesiones en el ADN.

En el grupo control negativo, el 100 % de las células se observaron en el nivel de daño 0; en el grupo control positivo el 61.4 % de las células se observaron en el nivel de daño 4 con células totalmente dañadas y cometas visibles. En otra investigación realizada en ratas Sprangue Dawley donde se comparó la respuesta de ciclofosfamida (CF) y bleomicina (BL) se observó un efecto mutagénico de ambos compuestos, obteniéndose cabezas de espermatozoides anómalas con la CF en comparación con la BL, a la misma dosis, diseño y vía utilizada, observándose a la vez una disminución en la concentración espermática,⁴⁰ lo cual refleja resultados similares a esta investigación.

Con la administración oral de 50 mg/kg del extracto metanólico de T. lucida, se observó en el análisis morfológico de daño tisular in vivo sobre el testículo de ratas una vacuolización en la región de los túbulos seminíferos, observándose amplias zonas carentes de células y disminución espermática (figura 2a). En los cortes histológicos de los testículos del grupo control negativo se observó una elevada densidad de células espermáticas, límites celulares bien definidos y estructura de la apariencia histológica normal (figura 2 c); no hubo vacuolización.

En el grupo control positivo, las ratas tratadas con undecanoato de testosterona, presentaron inhibición de la espermatogénesis, daño generalizado en el tejido testicular, presencia de abundantes vacuolas, signos de necrosis y alteración de la estructura testicular normal caracterizada por la desorganización y amplias zonas carentes de células (figura 2 b).

Conclusiones

La administración oral de extracto metanólico de T. lucida a ratas macho Wistar produjeron efectos en la calidad espermática y estructura testicular, específicamente en los túbulos seminíferos. Probablemente los compuestos presentes en el extracto metanólico de T lucida tengan influencia inhibidora sobre la liberación de las hormonas gonadotrópicas las cuales a su vez son las responsables de la producción de testosterona por lo que al verse afectadas dichas hormonas, se produce una disminución de la producción de testosterona, lo que conduce a cambios en la espermatogénesis contrastada con la afectación de la concentración espermática, viabilidad y motilidad así mismo el daño en la estructura testicular, aunado a su efecto genotóxico. Se proponen estudios complementarios para evaluar completamente la fertilidad y reversibilidad con este extracto y otras fracciones de esta planta.

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