Actividad antibacteriana y citotóxica de Leucophyllum frutescens (Berl) I.M. Johnst del Norte de México contra Staphylococcus aureus de aislados clínicos
Antibacterial and citotoxic activity of Leucophyllum frutescens (Berl) I.M. Johnst from Northern Mexico against Staphylococcus aureus clinical isolates
María del Carmen Vega-Menchaca,1 Julia Verde-Star,1 Azucena Oranday-Cárdenas,1 María Eufemia Morales-Rubio,1 María Adriana Núñez-González,1 Mario Alberto Rivera-Guillén,2 Luis Benjamín Serrano-Gallardo,2 Catalina Rivas-Morales1
1 Departamento de Química, Laboratorio de Fitoquímica y Química Analítica, Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Autónoma de Nuevo León, México
]]> 2 Departamento de Bioquímica y Farmacología, Centro de Investigación Biomédica, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Coahuila, México
Correspondencia:
M en C María del Carmen Vega Menchaca
Laboratorio de Fitoquímica y Química Analítica
Facultad de Ciencias Biológicas
Universidad Autónoma de Nuevo León
Av. Torre Latino #579
Fraccionamiento Las Torres CP 27085, Torreón Coahuila
Tel. (871)2033020 ]]>
E-mail carmelitavega2006@yahoo.com.mx
Fecha de recepción: 25 de octubre de 2012.
Fecha de recepción de modificaciones: 29 de marzo de 2013.
Fecha de aceptación: 12 de mayo de 2013.
Resumen
El objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad antimicrobiana y citotóxica del extracto metanólico crudo de Leucophyllum frutescens Var. (Berl) I.M. Johnst ("cenizo") contra la cepa de Staphylococcus aureus de un aislado clínico. El estudio de la actividad antimicrobiana demostró que el extracto de hojas de Leucophyllum frutescens presenta actividad en las tres concentraciones evaluadas 1000, 500 y 250 μg/mL, con una concentración mínima inhibitoria de 25.4 μg/mL. En el ensayo de Artemia salina, el extracto presentó toxicidad con una DL50 196.37 μg/mL y resultó activo sobre líneas celulares VERO encontrándose una IC50 de 58.0 μg/mL. Estos hallazgos contribuyen al conocimiento científico de las plantas medicinales del Norte de México con propiedades antibacterianas.
Palabras clave: actividad antimicrobiana, toxicidad, citotoxicidad, extracto metanólico, L. frutescens.
]]> Abstract
The aim of this work was the evaluation of the antimicrobial and cytotoxic activity of methanolic extract of crude Leucophyllum frutescens Var. (Berl) I. M. Johnst ("Texas Sage", "Texas Ranger" or "Silverleaf") against Staphylococcus aureus strain from a clinical isolate. The study of the antimicrobial activity showed that the extract has activity at three evaluated concentrations 1000, 500 and 250 μg/mL, with a minimum inhibitory concentration of 25.4 μg/mL. In the Artemia salina assay, the extract showed toxicity with a DL50 196.37 μg/mL and was active on VERO cell lines having an IC50 of 58.0 μg/mL. These findings contribute to the scientific knowledge of medicinal plants in North of México with antibacterial properties.
Key words: antimicrobial activity, toxicity, cytotoxicity, methanolic extract, L. frutescens.
Introducción
Las enfermedades infecciosas son consideradas un problema de salud pública debido a que son causa importante de mortalidad alrededor del mundo por el fenómeno de la resistencia bacteriana, sobre todo en el ambiente hospitalario, donde el uso continuo de fármacos antibacterianos ha favorecido la selección de cepas menos sensibles o de cepas portadoras de resistencia contra uno o más antibióticos.1-4 Durante las últimas tres décadas el problema de resistencia bacteriana ha ido en aumento por la aparición de bacterias patógenas multi-drogo resistentes.5 La OMS (Organización Mundial de la Salud) estima que el 80% de la población mundial usa la medicina tradicional para cubrir sus necesidades primarias de salud.4 En medicina tradicional diversas enfermedades infecciosas han sido tratadas con remedios herbolarios.6,7 Por este motivo la OMS promueve la búsqueda constante de nuevos antibióticos que contrarresten la resistencia de los microorganismos ya existentes y los reemergentes, por lo que se ha incrementado el interés de las plantas medicinales debido a que contienen una gran cantidad de principios activos que pueden ser útiles en el desarrollo de antibióticos.4,8 En las últimas décadas se ha incrementado el interés por los productos naturales y sus posibles aplicaciones en la industria farmacéutica en búsqueda de nuevos medicamentos más seguros y eficaces; aproximadamente el 30% de los fármacos empleados en los países industrializados proceden o se han sintetizado a partir de productos vegetales, por lo que los extractos de plantas son una fuente atractiva de nuevos medicamentos.5,9
La especie vegetal Leucophyllum frutescens es un arbusto que pertenece a la familia Scrophulariaceae, es conocido al Norte de México en los estados de Coahuila y Nuevo León como cenizo, crece hasta 2.5 metros de altura, ramificado y de hojas grises, las flores crecen como campana con un tamaño de 25 mm, de color lila y florece tres veces al año.10 Existen reportes de su uso en medicina tradicional para tratar infecciones pulmonares incluyendo tuberculosis, diarrea y disentería, en procesos febriles, tos, asma y desórdenes del hígado.8,11 Existen antecedentes de que algunas plantas del Norte de México inhiben el crecimiento de S. aureus.12 En estudios recientes realizados con extractos orgánicos de 14 plantas de la flora del Norte de México usadas para el tratamiento de enfermedades respiratorias, encontraron que las hojas de Cordia boissieri mostraron gran actividad antimicrobiana contra la cepa de Staphylococus aureus. En ese mismo estudio, los autores reportan que Leucophyllum frutescens mostró actividad antituberculosa contra cepas sensibles y resistentes de Mycobacterium tuberculosis. 13 Se han reportado pocos estudios fitoquímicos destacando la presencia de lignanos fitotóxicos diayangambina, epiyangambina, diasesartemina y epiasantina,14 leubetanol15 y furanolignano16 con actividad antituberculosa.
Staphylococcus aureus es la principal bacteria que causa infecciones hospitalarias, además es el agente causal de diversas enfermedades, incluyendo endocarditis, osteomielitis, síndrome de shock tóxico, neumonía y abscesos, en muchos casos los trabajadores del área de la salud son la fuente de infección ya que son portadores de la bacteria.17
Dada la relevancia del uso terapéutico de la flora vegetal en México así como la persistente búsqueda de nuevas alternativas naturales para el desarrollo de nuevos fármacos basados en el aislamiento de compuestos de los extractos vegetales, que brinden mayor calidad de vida y promuevan la buena salud reduciendo los efectos secundarios de los mismos, se vuelve necesaria la realización de estudios biológicos, toxicológicos, clínicos y fitoquímicos que permitan una mayor caracterización de los extractos vegetales.9,18
Los ensayos de citotoxicidad, son capaces de detectar mediante diferentes mecanismos celulares, los efectos adversos de interferencia con estructura y/o propiedades esenciales para la supervivencia celular, proliferación y/o funciones, dentro de estos se encuentran la integridad de la membrana y del citoesqueleto, metabolismo, síntesis y degradación, liberación de constituyentes celulares o productos, de regulación iónica y división celular.19 Comúnmente, en los estudios de citotoxicidad in vitro sobre líneas celulares, se emplean diferentes métodos de tinción celular con el fin de estimar de manera indirecta el número de células viables presentes después de un tratamiento. Una prueba in vitro ideal para evaluar la proliferación celular y la citotoxicidad debe tener como características principales la simplicidad, rapidez, económica, reproducibilidad, sensibilidad y efectividad en la medida de la población celular viable y que no muestre interferencia con el compuesto a evaluar.20,21 Existen diferentes métodos para realizar ensayos de citotoxicidad in vitro: uso de colorantes como cristal violeta y sulforrodamina B, que colorean componentes específicos de las células y permiten medir residuos celulares después de un tiempo de incubación con el compuesto evaluado, detectores de liberación de componentes constitutivos celulares, que miden la actividad de enzimas tales como lactato deshidrogenasa, y finalmente, aquellos que miden la función metabólica de las células usando sales de tetrazolio.21,22 Cada vez hay más evidencia de la actividad farmacológica del cenizo, además de la actividad anti-Mycobacterium tuberculosis, se ha reportado la actividad antioxidante y antifúngica.12,23 Con estos antecedentes y por el interés de profundizar en el conocimiento de la flora mexicana y su posible contribución a la etnofarmacología, se realizó este trabajo con el objetivo de evaluar el potencial antimicrobiano del extracto metanólico de hojas en Leucophyllum frutescens recolectado en la Región Norte de México en base a la información obtenida de entrevistas etnobotánicas, y por su distribución en el semidesierto del Norte de México contra Staphylococcus aureus causante de enfermedades infecciosas.
]]>Material y métodos
Material Biológico
La cepa de Staphylococcus aureus de aislado clínico fue proporcionada por el cepario del Laboratorio de Microbiología del Hospital Infantil Universitario de la ciudad de Torreón México. La cepa de referencia Staphylococcus aureus (ATCC BAA44) fue proporcionada por el Laboratorio de Química de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Autónoma de Nuevo León, Monterrey Nuevo León, México. Artemia salina (Brine ShrimpEggs® San Francisco Bay Brand, INC). Células VERO (ATCC CCL-81) proporcionadas por el Instituto de Salud Pública de Cuernavaca, México.
Preparación del material vegetal y extracción
Material vegetal
La especie vegetal se recolectó durante el mes de Mayo del año 2010 en el poblado de Tlahualilo ubicado en el semidesierto Chihuahuense que comprende la Región Lagunera en el Norte de México a una altitud de 1200 msn. El ejemplar fue autentificado por el Biólogo Eduardo Blanco Contreras de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro y se depositó un ejemplar en el herbario de la misma universidad con el número de registro UAAANL007/2012.
Preparación del material vegetal y extracción
Los solventes más ampliamente usados en investigaciones de actividad antimicrobiana en plantas son el metanol, etanol y agua. Se ha encontrado que los extractos vegetales con solventes orgánicos proporcionan mejor actividad antimicrobiana comparada con los extractos acuosos.24 Con base a ello se realizaron pruebas preliminares para seleccionar el mejor solvente entre el extracto acuoso y metanólico.
Las hojas de Leucophyllum frutescens se lavaron con agua destilada para eliminar el exceso de polvo y partículas extrañas, por desecación artificial se secaron en una estufa a una temperatura de 40° C, después se separaron las hojas y se trituraron en un molino (Wiley® modelo 4). Se pesaron 50 g de las hojas trituradas, se colocaron en un matraz Erlenmeyer y se adicionaron 350 mL de metanol (CTR Scientific®), se selló herméticamente, se dejó en agitación constante durante cinco días en un agitador (Dual Action Shaker Lab Line®), para luego filtrar el macerado utilizando papel Whatman No.1 (Whatman International LTD® England) en embudo Buchner y bomba al vacío (Evar® Power Electric México). El solvente se evaporó a presión reducida en un rota evaporador (Rota vapor Büchi® R-205, Switzerland) a 30 rpm y 50° C, el extracto se llevó a sequedad completa.25 Para la preparación del extracto acuoso se pesaron 5 g de material vegetal y se adicionaron 100 mL de agua desionizada estéril, se dejó 10 min a temperatura de 100° C, luego se dejó enfriar a temperatura ambiente. El extracto se almacenó a 4° C hasta su uso.26
]]> El rendimiento de extracción se obtuvo de la siguiente fórmula:
Donde:
PE = Peso obtenido después de la extracción
PI = Peso inicial del material vegetal a extraer
Identificación, tipificación y conservación de la cepa bacteriana
La identificación y tipificación de la cepa bacteriana se realizó conforme a perfiles bioquímicos y a las recomendaciones del Manual de Microbiología Clínica.13 Todos los aislamientos fueron mantenidos en el medio líquido C. Rivas.27
Evaluación de la actividad bacteriana por el método de difusión en disco de papel en agar
Para el ensayo microbiológico se vaciaron 5 mL del medio de cultivo en tubos de ensayo de 13x100 mm, se esterilizaron a 120° C y 15 Lb/15 min, los tubos se inocularon con la cepa bacteriana y se incubaron durante 18-24 h a 37° C. El ensayo se realizó por el método de difusión en placa con discos de papel filtro17,28 para lo cual se utilizó el medio sólido de C. Rivas (Patente IMPI MX/10892). El medio se preparó de acuerdo a instrucciones del fabricante. Para el ensayo de inhibición bacteriana, se colocaron 40 μL del extracto metanólico de L. frutescens a tres concentraciones de 1000, 500 y 250 μg/mL previamente esterilizados por filtración con membranas de 0.25 μm en filtro Milipore®, una vez esterilizados, cada concentración se impregnó en discos de papel filtro Whatman No.1 (Whatman® International LTD England) sobre una placa de agar sólido C. Rivas previamente inoculada con 100 μL de una suspensión bacteriana de 1x106 UFC de S. aureus de aislado clínico (AC) y una cepa de referencia ajustadas con el Nefelómetro de Mc Farland.29 Se realizó un tamizaje con los antibióticos cefotaxima, gentamicina, amikacina, penicilina y sulfametoxazol trimetropim para seleccionar el antibiótico más activo; se eligió cefotaxima. Como control negativo se utilizaron 40 μL de dimetil sulfóxido (DMSO) y como testigo positivo 40 μL de Cefotaxima (Sigma Aldrich®, St Louis, MO, USA). Las placas se incubaron en estufa a 37° C por 24 h, los resultados de los halos de inhibición fueron expresados en mm.29,30
Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
]]> La CMI se realizó por el método de microdilución. El medio usado para las diluciones fue el caldo C. Rivas. En una microplaca de 96 pozos se depositaron 100 μL de medio de cultivo líquido C. Rivas, se le agregó 50 μL del extracto a las concentraciones de 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.6, 7.8 y 3.9 μg/mL, enseguida se adicionaron 100 μL de la suspensión bacteriana conteniendo el inóculo 1 x 106 UFC. Posteriormente la microplaca se incubó por 24 h a 37° C. Para cada ensayo se utilizó Cefotaxima como testigo a concentración de 500 μg/mL. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Para determinar la concentración mínima inhibitoria se adicionó 10 μL de MTT (Bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio) a una concentración de 2.5 mg/mL a cada pozo, se incubaron por 8 h a 37° C, posteriormente se leyó la absorbancia en un lector de microplacas a 570 nm (Dynatech®MR5000).25-30Ensayo de Letalidad con larvas de Artemia salina
En un recipiente de material acrílico obscuro con 300 mL de agua de mar artificial (Coralife Scientific Grand Marine Salt) se incubaron 0.1 g de huevecillos de Artemia salina (BrineShrimpEggs® San Francisco Bay Brand, Inc.) durante 48 h. Una vez eclosionados se tomaron 10 nauplios en un volumen de 100 μL de agua de mar y se colocaron en una microplaca de 96 pozos, posteriormente se adicionaron 100 μL de las concentraciones del extracto:1,000, 500, 100 y 10 μg/mL. Se utilizó como control positivo dicromato de potasio a una concentración de 400 ppm, y como control negativo agua de mar. Los nauplios de A. salina estuvieron expuestos a las soluciones de extracto durante 24 h bajo las mismas condiciones. Después de este tiempo se contaron los nauplios vivos y muertos por concentración; primeramente se contaron los nauplios muertos con ayuda de un estereoscopio (Iroscope® WB2, EUA), posteriormente se colocaron 50 μL de etanol (CTR®, Scientific) para inmovilizar al resto de nauplios vivos en cada pozo. Se utilizó el método estadístico Probit para determinar la DL50. El criterio de toxicidad fue el siguiente: valores de DL50>1000 μg/mL (no tóxico), ≥ 500 ≤1000 μg/mL (toxicidad débil) y <500 μg/mL (tóxico).31-33
Evaluación de la citotoxicidad con MTT
Para evaluar la citotoxicidad del extracto se empleó la línea celular normal de mono verde africano (VERO). Las células se propagaron en el medio de cultivo DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Cellgro, Herndon. Sigma®) suplementado con 2 mL de glutamina (Sigma®-Aldrich, St Louis, USA), gentamicina 50 mg (Sigma®-Aldrich, St Louis, USA) y 10 % de suero fetal bovino (SFB, SIGMA®). Se utilizaron cultivos confluentes de la línea celular, realizando la exclusión con azul de tripano (Sigma®-Aldrich, St Louis, USA) para comprobar su viabilidad. Se colocaron 3,000 células/pozo en un volumen de 100 μL de medio DMEM en microplacas de 96 pozos (Corning Inc. Costar®), posteriormente se incubaron por 24 h a 37° C en atmósfera húmeda y 5 % de CO2. El extracto de L. frutescens se disolvió en dimetil sulfóxido (DMSO) a una concentración final de 0,001 μg/mL.
Posteriormente se prepararon diluciones del extracto en DMEM a una concentración final de 3.12, 6.25, 12.0, 25.0, 50.0 y 100.0 μg/mL, se adicionaron 100 μL/pozo de cada dilución y el ensayo se realizó por cuadruplicado. El DMSO se utilizó como control negativo y se evaluó individualmente para citotoxicidad de forma similar a los extractos, las placas se incubaron durante 72 h en atmósfera de 5% de CO2 a 37° C. Luego de 72 h se adicionaron 20 μL MTT (sal de tetrazolio (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio) (Sigma®-Aldrich, St Louis, USA) al cabo de 4 h en atmósfera de 5% de CO2 a 37° C se decantó el medio, se adicionaron 200 μL/pozo de DMSO y se leyó la densidad óptica (DO) en un lector de microplacas de ELISA (Dynatech®MR5000) a 560 nm y 630 nm como referencia.34,35
Análisis estadístico
Los datos se expresaron como la media ± desviación estándar (DE) de ensayos independientes con 3 réplicas. Las comparaciones de las medias del efecto de inhibición de la concentración del extracto sobre S. aureus se hicieron mediante la prueba t de Student, considerando como antibiótico de referencia la cefotaxima. Para los ensayos de inhibición del crecimiento se utilizó un modelo bivariado de regresión lineal para el extracto y bacteria en estudio, considerando la dosis inhibitoria. Se utilizó el paquete estadístico STATA versión 11.0 Stata Corporation, Texas, USA)36 considerando la diferencia estadística significativa a una P < 0.05, mientras que para el ensayo de letalidad con A. salina la DL50 se obtuvo con el estadístico Probit. Los valores de IC50 (citotoxicidad) del extracto se determinaron a partir de las curvas de concentración-efecto (y = porciento de viabilidad, x = logaritmo) mediante el análisis de regresión lineal utilizando el paquete estadístico SPSS versión 15.
Resultados y discusión
]]> La planta utilizada en este estudio fue seleccionada por su uso en medicina tradicional para el tratamiento de enfermedades respiratorias. Los resultados obtenidos corroboran que el metanol puede considerarse buen solvente para la extracción de sustancias con actividad antimicrobiana de manera similar a otro estudio37. El resultado del rendimiento de la extracción metanólica y acuosa de las hojas de Leucophyllum frutescens fue de 17.2% y 8.3% respectivamente. En esta investigación, la actividad antimicrobiana del extracto metanólico y acuoso de las hojas de L. frutescens fue evaluada contra cepas de S. aureus de aislado clínico y de referencia. El extracto metanólico mostró actividad antimicrobiana relevante a las concentraciones probadas a diferencia del acuoso que no mostró efecto antibacteriano. La inhibición de S. aureus (AC) por difusión en disco con el extracto metanólico fue de 12 mm a las concentraciones de 1000 y 500 μg/mL y 10 mm a la concentración de 250 μg/mL. La cepa de referencia mostró inhibición de 15 mm a la concentración de 1000 y 500 μg/mL, en cambio a la concentración de 250 μg/mL no inhibió el crecimiento bacteriano. El solvente dimetil sulfóxido (DMSO) se utilizó como control negativo el cual no mostró inhibición del crecimiento bacteriano con el extracto probado, mientras que la cefotaxima que se usó como control positivo, mostró inhibición del crecimiento bacteriano con el extracto metanólico a las tres concentraciones de prueba en un rango de 15 mm (Tabla 1). De acuerdo al análisis estadístico, por cada microgramo del extracto aplicado se observó un efecto inhibitorio de 0.00114 mm (Tabla 2). Al comparar las medias del efecto de inhibición y la concentración aplicada sobre el cultivo bacteriano considerando como referencia el control positivo, empleando la prueba t-Student se observó una P<0.01 lo cual se considera altamente significativa.
Debido a que el extracto presentó actividad antimicrobiana con la técnica de difusión en disco, se evaluó la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC por sus siglas en inglés) sobre las cepas de S. aureus de aislado clínico y de referencia, resultando una buena actividad antimicrobiana (MIC) de 25.4 μg/mL y 20.2 μg/mL respectivamente. Estos resultados concuerdan con reportes de otras especies vegetales, donde evaluaron la actividad antimicrobiana del extracto metanólico de Calophyllum brasiliense contra S. aureus resultando una MIC de 32 μg/Ml,34 además otro estudio con la especie Piper regnelli con una MIC de 7.7 μg/mL.38 En el reporte la especie Cyperus alternifolius fue activa con una MIC de 62.5 μg/mL.12 En otros investigaciones donde evaluaron plantas del desierto mexicano, reportaron que el extracto metanólico de Amphypteringium adstringens inhibió el crecimiento de Staphylococcus aureus.39 De acuerdo a los resultados en los cuales se trabajó con cuatro plantas del norte de México, los extractos metanólicos de Lysiloma acapulcensis, Miconia mexicana, Hibiscus sabdariffa y Loeselia mexicana fueron activos contra S. aureus y S. faecalis.40 Otros estudios demostraron la actividad antibacteriana de L. frutescens sobre Mycobacterium tuberculosis drogo-resistente13 y sobre hongos causantes de micosis pulmonares.23
Debido a que uno de los objetivos del trabajo fue analizar el riesgo de toxicidad aguda del extracto de L. frutescens, se realizó la determinación de la dosis letal media (DL50) con el ensayo de Artemia salina considerado como de selección o descarte de extractos tóxicos para sistemas biológicos.31,33 En este trabajo se encontró para el extracto una DL50 de 196.37 ^ g/mL, moderadamente tóxico, según la escala reportada por Déciga y colaboradores.32
Con base a los resultados obtenidos sobre la toxicidad, en este estudio se demostró la actividad citotóxica de las hojas de L. frutescens con la línea celular VERO, el extracto evaluado mostró una IC50 de 58.0 μg/mL. Un extracto crudo que tiene una IC50 con un valor superior de 30 μg/mL puede ser considerado para fraccionarlo y aislar los compuestos con actividad.41,42
Conclusiones
]]> Los resultados de este estudio indican que el extracto metanólico de las hojas de Leucophylum frutescens tiene actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus, esto corrobora el uso de esta planta en medicina tradicional para el tratamiento de algunas enfermedades infecciosas, sin embargo se requieren estudios adicionales para determinar los compuestos responsables del efecto antimicrobiano de esta planta. El té de cenizo se ha empleado para algunos trastornos respiratorios y digestivos sin efectos aparentemente tóxicos, nuestros resultados indican toxicidad moderada, aún así futuros estudios podrían ser útiles en la búsqueda de posibles compuestos anticáncer. Es importante el estudio de las especies nativas de las zonas áridas del Norte de México ya que son útiles en Medicina Tradicional para la atención primaria de la salud y son fuente potencial de nuevos antimicrobianos.
Agradecimientos
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) México por la Beca No. 341796. Los autores agradecen el apoyo técnico de la Q.F.B. Angela Diluvina Hernández Mungaray.
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