Proteínas fosfatasas de parásitos: más allá de una función

Jenny Gómez Sandoval¹, Patricia Talamás Rohana², Magdalena Aguirre García¹

¹ Departamento de Medicina Experimental, Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad de México, D.F., México.

² Departamento de Infectómica y Patogénesis Molecular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Ciudad de México, D.F., México. Autor de correspondencia correo E: maguirre@unam.mx

Resumen

Las proteínas fosfatasas son enzimas que desfosforilan proteínas en residuos de tirosina y serina/treonina y están implicadas en diversos procesos celulares, cuyas funciones han sido mejor caracterizadas en células eucariontes. Sin embargo, en las últimas dos décadas se han identificado y caracterizado estas enzimas en microorganismos infecciosos como los parásitos. Se ha observado que algunas proteínas fosfatasas de parásitos pueden presentar funciones similares a las de algunas células eucariontes, mientras que otras fosfatasas presentan características estructurales y/o funcionales únicas, lo que las hace candidatas para el desarrollo de drogas o como marcadores de diagnóstico. En este escrito se engloba el conocimiento generado a la fecha, acerca de la función de estas enzimas en parásitos de importancia médica y veterinaria.

Palabras clave: Proteína fosfatasa, parásito, patógeno.

Abstract

Protein phosphatases are enzymes that dephosphorylate proteins in tyrosine and serine/threonine residues, and are involved in various cellular processes, whose functions have been best characterized in eukaryotic cells. However, in the last two decades these enzymes have been identified and characterized in infectious microorganisms such as parasites. It has been found that certain parasite phosphatases maintain conserved functions similar to those of higher eukaryotes, whereas other phosphatases have unique structural and/or functional characteristics, which make them candidates for drug development or as diagnostic markers. This paper encompasses the knowledge generated to date, about the role of these enzymes in parasites of medical and veterinary importance.

Key words: Protein phosphatase, parasite, pathogen.

1. PROTEÍNAS FOSFATASAS EN CÉLULAS EUCARIONTES

La fosforilación reversible de proteínas es un proceso importante en la regulación de varias funciones celulares. Este proceso es regulado por la acción opuesta de las proteínas cinasas y de las proteínas fosfatasas que catalizan respectivamente la adición o eliminación de un grupo fosfato en algún residuo de aminoácido, principalmente de serina, treonina o tirosina (1).

Las proteínas fosfatasas se clasifican con base en su dominio catalítico y al residuo que desfosforilan en: Proteínas tirosina fosfatasas (PTP) y proteínas serina/treonina fosfatasas (PSTP) (1). Las PTP comprenden cinco clases que incluyen las PTP clásicas, las PTP de especificidad dual (DSP), las PTP Cdc25, las PTP de bajo peso molecular (PTPs-LMW) y las PTP EyA basadas en Aspartato (1). Las PSTP se clasifican en 3 familias: las fosfo-proteínas fosfatasas (PPP), que agrupa a las proteínas fosfatasas PP1, PP2A, PP2B (PP3 o calcineurina), PP4, PP5, PP6, PP7 y las PPP tipo bacteria, por ejemplo las fosfatasas Shelphs (2). El segundo grupo corresponde a las proteínas fosfatasas dependientes de metal (PPM) cuyo representante es la proteína PP2C. La última familia incluye las fosfatasas FCP/SCP (fosfatasa del dominio carboxilo-terminal (CTD) del componente TFIIF asociado a la RNA polimerasa II/ pequeñas fosfatasas del CTD) (1). Algunas de las funciones descritas de estas enzimas en mamíferos, levaduras y plantas se muestran en la figura 1.

2. FUNCIONES DE LAS PROTEÍNAS FOSFATASAS DE PARÁSITOS

El conocimiento de la presencia y la función de las proteínas fosfatasas en células eucariontes, principalmente en las células de mamíferos, ha facilitado el estudio de estas enzimas en los parásitos protozo arios como: Tripanosomátidos (Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Trypanosoma rangeli, Leishmania major, Leishmania donovani y Leishmania mexicana); Apicomplexa (Plasmodium falciparum, Plasmodium berghei , Plasmodium yoelli y Toxoplasma gondii); Intestinales (Giardia lamblia y Entamoeba histolytica). Así como en helmintos de importancia médica y veterinaria: Nematoda (Setaria cervi, Haemonchus contortus y Ascaris suum) y Tremátoda (Clonorchis sinensis y Schistosoma mansoni). El conocimiento del papel que juegan estas enzimas en los ciclos de vida y en la biología de estos parásitos, permitirá identificar posibles blancos terapéuticos para el tratamiento de las enfermedades que producen. Las funciones de las fosfatasas de parásitos fueron agrupadas en relación al mecanismo en el cual participan como: ciclo celular, diferenciación y desarrollo, motilidad, regulación traduccional, metabolismo, respuesta a estrés, modulación de la respuesta inmune e invasión o daño a la célula hospedera. Algunas de estas funciones se resumen en la figura 2.

A) Ciclo celular

El ciclo celular en eucariontes comienza con la interfase, que abarca las fases G1, S y G2 durante las cuales las células crecen y duplican su ácido desoxirribonucleico (DNA). Este material genético se reparte en dos células hijas durante la mitosis, finalizando simultáneamente con la división del citoplasma en un fenómeno llamado citocinesis. Durante la fase G1, la proteína fosfatasa tipo PP5 de T. brucei se expresa en niveles altos y su depleción provoca una disminución en el crecimiento del parásito en condiciones normales de cultivo (3). Las fosfatasas tipo PP1 y PP2A de este parásito posiblemente regulan a la cinasa relacionada a cdc2 (CKR), enzima que promueve la citocinesis de forma positiva. La inhibición de estas fosfatasas, PP1 y PP2A, resulta en células multinucleadas sin división del citoplasma y con un solo cinetoplasto (3). Un fenotipo similar ocurre en los taquizoítos de T. gondii cuando se sobre expresa una enzima de este tipo, la PP2C (4).

B) Diferenciación y desarrollo de las fases de vida del parásito.

Algunos parásitos presentan ciclos de vida complejos que alternan entre diferentes hospederos y ambientes. Esta condición los obliga a presentar cambios controlados en su morfología y metabolismo para adaptarse al nuevo entorno. En T. brucei durante la diferenciación del tripomastigote sanguíneo corto ("stumpy") a tripomastigote pro-cíclico participan 2 fosfatasas, TbPTP1 y TbPIP39. Ambas enzimas previenen la diferenciación del parásito hasta que llegue al intestino medio de la mosca tse tse. TbPTP1 inhibe a TbPIP39, la cual para ser activa necesita estar fosforilada. Las condiciones oxidantes, el pH básico y la reducción de la temperatura en el intestino de la mosca hacen que se dispare un mecanismo de señalización que inactiva la TbPTP1. La inactivación de esta enzima, genera altos niveles de TbPIP39 fosforilada lo cual le permite migrar al glicosoma y promover la diferenciación celular (6). Otro sustrato de la fosfatasa TbPTP1, en la fase procíclica del parásito, es la fosfoproteína nuclear NOPP44/46, de la cual no se conoce el mecanismo por el que regula la diferenciación, pero se sugiere que esté involucrada en el metabolismo del RNA (7). En el caso de la TcPTP1 de T. cruzi se sugiere una función similar en la metaciclogénesis de este parásito (7).

La disminución gradual de la expresión de ciertas fosfatasas refleja la progresión en las fases del ciclo de vida del parásito. Tal es el caso de la fosfatasa TbPP5 de T. brucei que disminuye durante la transición de la fase logarítmica a la fase estacionaria del parásito en el cultivo (3). En el nematodo A. suum la cantidad de una PTP de la cáscara del huevo se reduce conforme va progresando el desarrollo del parásito, de 4 células, hasta la larva completa en el huevo (8). Efectos similares se han observado en P. falciparum durante la progresión de las fases sanguíneas de esquizonte a anilllo y de anillo a trofozoíto, sin embargo esta función se le atribuye a una fosfatasa única denominada PfPPJ (3).

Por el contrario, también la sobreexpresión de ciertas fosfatasas modula la diferenciación del parásito. En G. lamblia el aumento en la concentración de una fosfatasa tipo PP2A (gPP2A-C) en la pared del quiste regula las etapas de enquistamiento tardío y desenquistamiento (9).

Finalmente la expresión de fosfatasas puede ser específica de ciertos estadios. El nematodo parásito de rumiantes, H. contortus, presenta un tipo de fosfatasa PP1 denominada Hc-STP-1 en el gusano adulto macho y en la cuarta fase larvaria pero no en las hembras ni en los huevos y fases larvarias tempranas. Esta proteína juega un papel importante durante la espermatogénesis así como en procesos relacionados con el desarrollo y maduración de la fase adulta del parásito macho (l0). En P. falciparum una fosfatasa PPβ (PP2A) se expresa específicamente en la fase de gametocitos, sugiriendo su participación en el desarrollo de esta fase del ciclo sexual del parásito (3). En el trematodo C. sinensis también está involucrada una fosfatasa PP2A (CsPP2A) en el desarrollo de la fase adulta y de metacercaria del ciclo de vida del parásito (11).

C) Motilidad celular

La motilidad en los parásitos juega un papel importante durante varias etapas en su ciclo de vida como son: la diferenciación, la invasión al hospedero, la migración y la locomoción dentro del hospedero, entre otros; donde en algunos casos se han desarrollado mecanismos que no solo dependen del rearreglo del citoesqueleto de actina sino también de la existencia de organelos como cilios y flagelos. Un ejemplo claro es la familia Apicomplexa, los cuales presentan una nueva forma de locomoción por deslizamiento llamada "gliding motility", la cual es generada por un motor de actinamiosina. En T. gondii, la toxofilina es una de las proteínas de secreción más abundante, cuya actividad es la de secuestrar monómeros de actina y desorganizar el citoesqueleto de la célula hospedera durante la invasión (3). La afinidad de la toxofilina a los monómeros de actina es regulada por la proteína tipo caseína cinasa II (CKII) y la fosfatasa PP2C, que fosforilan y desfosforilan respectivamente el residuo de Serina 53 de la toxofilina para regular su actividad (3). En el caso de A. suum, el movimiento de los espermas es generado por la fuerza de retracción que se presenta en la base del lamelopodio del cuerpo celular, cuyo aparato de motilidad está constituido por un citoesqueleto basado en filamentos de la proteína de esperma mayor (MSP) que son estabilizados por la proteína MSP fiber 3 (MFP3). La proteína PP2A desfosforila a la MFP3 generando un desensamblaje de los filamentos locales en el lamelopodio y consecuente desplazamiento del cuerpo del esperma hacia delante (12). Finalmente en tripanosomátidos, el flagelo es una estructura importante para su diferenciación celular. En epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos de T. rangeli se presenta una PTP (TrPTP2) en el flagelo que pudiera estar regulando su estructura (13).

D) Regulación traduccional

En eucariontes superiores se conoce que varios componentes de la maquinaria traduccional son regulados por procesos de fosforilación-desfosforilación y en parásitos esto no es la excepción. P. falciparum presenta una fosfatasa PP2C (PfPP2C) de alto peso molecular que interacciona con diferentes componentes de la maquinaria transcripcional, entre ellos la proteína de elongación 1 beta (PfEF-1β) del parásito, donde se ha visto que esta PP2C de P. falciparum regula el intercambio de nucleótidos realizado por la PfEF-1β (3). Otra fosfatasa caracterizada de P. falciparum es una fosfatasa de especificidad dual denominada PfYVH1, que junto con una proteína nuclear tipo Pescadillo (PfPes), modula el procesamiento del rRNA y progresión en el ciclo celular (6).

E) Metabolismo

La relación simbiótica que tienen los parásitos con su hospedero les permite obtener muchos metabolitos y nutrientes, sin embargo aún conservan mecanismos que hacen eficiente su metabolismo mediante vías alternas o proteínas como las fosfatasas que juegan un papel importante en el metabolismo de carbohidratos. En P. falciparum se infiere que una proteína fosfatasa tipo PP1 (PfPP1) pudiera participar en el metabolismo del glucógeno, dada la alta homología con PP1 de levaduras y su capacidad para interactuar con moléculas involucradas en esta ruta metabólica (3). Por otro lado, T. cruzi presenta una fosfatasa prenilada TcPRL en un compartimento pre-lisosomal llamado reservosoma, cuya actividad está implicada en el catabolismo de proteínas y lípidos de reserva durante las diferentes fases de vida del parásito (6).

F) Respuesta a estrés

Los parásitos presentan ciclos de vida complejos que pueden involucrar la transición de un hospedero a otro o la exposición al ambiente en diferentes formas como puede ser el caso del quiste. Este proceso implica la necesidad de responder a las señales y estrés del nuevo ambiente para su adaptación y progresión de su ciclo de vida. En los promastigotes de L. major, la captación de calcio es esencial para la adaptación del parásito al cambio de temperatura que sufre al pasar del insecto vector al hospedero mamífero. En esta fase de promastigote del parásito, el silenciamiento de la subunidad regulatoria CnB de la fosfatasa PP2B (calcineurina), afecta la viabilidad y diferenciación a la fase de amastigote durante el cambio de temperatura de 26 a 34 °C; este proceso fue revertido cuando se adicionó exógenamente la subunidad regulatoria CnB (14). Otra enzima de Leishmania spp implicada en este proceso de adaptación es la LPTP1, cuya actividad enzimática no participa en la diferenciación de promastigote a amastigote pero si en su sobrevida (6). La fosfatasa PP5 de P. falciparum y T. brucei en condiciones de estrés interactúa in vivo con una proteína de choque térmico 90 (HSP90) para regular la homeostasis celular (3).

Recientemente en nuestro laboratorio se ha encontrado que L. major y L. mexicana poseen una PP2C, y la inhibición de la actividad de PP2C por el compuesto sanguinaria (inhibidor específico), inhibe el crecimiento de la fase de promastigote de L. major y L. mexicana y de amastigote de L. mexicana (observación personal).

G) Modulación de la Respuesta Inmune

En células del sistema inmune (macrófagos y linfocitos) existe información acerca de la participación de las proteínas fosfatasas en la regulación de la activación de estas células inmunes frente a microorganismos patógenos. Los parásitos han evolucionado desarrollando mecanismos para evadir la respuesta inmune mediante la inhibición de proteínas esenciales que participan en las vías de señalización importantes para la activación de las células inmunes. Sin embargo, se conoce poco acerca de la función que pudieran tener las fosfatasas de parásitos para modular y evadir esta respuesta. En el nemátodo S. cervi se ha observado que secreta una fosfatasa ScDSP durante los estadios de adulto y microfilaria. Esta fosfatasa a altas concentraciones inhibe la degranulación de eosinófilos (15). En P. falciparum se ha identificado una fosfatasa extracelular (PfEP) en sobrenadantes de cultivos de eritrocitos infectados con el parásito y se sugiere que esta enzima pudiera participar en la modulación y señalización de la respuesta inmune (16).

H) Invasión, salida o daño a la célula hospedera

Varios estudios han descrito que la secreción o exposición del dominio catalítico de enzimas al exterior de la célula pueden modular vías de señalización relacionadas con el proceso de invasión. En el caso de promastigotes metacíclicos de L. major, se ha descrito una PTP asociada a la membrana, cuya función pudiera tener un papel en la invasión a la célula hospedera (17). Por su parte, L. mexicana presenta una fosfatasa PTP de 50 kDa que es secretada al medio de cultivo y se sugiere que puede participar en la invasión a la célula hospedera (17).

En roptrías de taquizoítos de T. gondii se ha descrito una fosfatasa PP2C (PP2C-hn)que es secretada y posteriormente internalizada por la célula hospedera, relocalizándose en el núcleo de esta célula (3). Otro ejemplo de fosfatasas secretadas o expuestas en la superficie es una PfPRL de P. falciparum, la cual es translocada de las roptrías a la superficie del parásito donde pudiera participar en la liberación de los merozoítos del esquizonte y/o en la consecuente invasión a los eritrocitos (6). Otras fosfatasas interesantes, dado que no presentan homólogos en mamíferos, son las fosfatasas PPP tipo bacteria, Shelphs. En P. falciparum se localiza una fosfatasa Shelph en el complejo apical y se sugiere que es esencial en la interacción e invasión a la célula hospedera (2). P. berghei presenta dos isoformas de Shelphs, SHLP1 y SHLP2, donde SHLP1 es esencial en el desarrollo del micronema del oocineto (cigoto), formación del quiste y subsecuente transmisión por el insecto vector (18). Otra fosfatasa caracterizada de P. berghei es una proteína fosfatasa con dominios tipo kelch, PPKL, que también es esencial en la diferenciación del oocineto, motilidad e invasión a la célula hospedera (19). Finalmente en taquizoítos de T. gondii se ha visto que la inhibición de una PP1 reduce significativamente la invasión a la célula hospedera (3).

Con respecto al daño a la célula hospedera, en trofozoítos de E. histolytica se ha caracterizado la función de una fosfatasa ácida de unión a membrana (MAP) que presenta actividad de PTP. La interacción de esta enzima amibiana con células HeLa resultó en la alteración del citoesqueleto de actina (6). Además, en un estudio de la expresión diferencial de genes de trofozoítos no virulentos y virulentos de E. histolytica se incrementa la transcripción del gen que codifica para la MAP (20). Esta expresión diferencial entre trofozoítos en diferentes condiciones se ha reportado para la EhPTPA, cuya sobreregulación sugiere un papel importante en la adaptación del trofozoíto durante el desarrollo del absceso hepático amebiano (6).

La fosfatasa PP1 de P. falciparum está implicada en la salida de la célula hospedera. Esta enzima favorece la liberación de los merozoítos de los eritrocitos al mantener bajos los niveles de fosforilación de la proteína de unión al citoesqueleto (PfSBP)1, la cual es una proteína transmembranal de la hendidura de Maurer que regula la estabilidad de la membrana del eritrocito (3).

Conclusión

Las fosfatasas presentes en diferentes parásitos resultan de suma importancia para la regulación de diversos mecanismos involucrados en su ciclo de vida y otras funciones. Muchas de estas fosfatasas presentan características muy semejantes a las fosfatasas de eucariontes superiores y conservan muchas de las funciones. No obstante, los parásitos también han desarrollado fosfatasas únicas, cuya función pudiera ser peculiar, lo que las convierte en atractivos blancos terapéuticos y/o de diagnóstico. Sin embargo, falta mucho para esclarecer el papel que juegan y las vías específicas que modulan estas fosfatasas en los parásitos y/o en la célula que invaden.

Agradecimientos.

A los proyectos CONACYT: 152433 y DGAPA-PAPIIT: IN218412.

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