Cuantificación de maíz genéticamente modificado mediante las técnicas de qPCR y dPCR

Quantification of genetically modified maize with qPCR and dPCR techniques

Lizbeth E. Gutiérrez-Angoa, Luis C. Castillo-Durán, Blanca E. Gómez-Castelo, Abraham I. Acatzi-Silva^*

Centro Nacional de Referencia en Detección de OGM. Km 37.5, Carretera Federal México-Pachuca. Estado de México, 55740. Tecámac de Felipe Villanueva Centro. *Autor responsable. (abraham.acatzi@senasica.gob.mx)

Recibido: octubre, 2014.
Aprobado: febrero, 2015.

Resumen

A partir de la emisión de los permisos de liberación al ambiente de maíz (Zea mays L.) genéticamente modificado (GM) en el año 2009, en México fue necesario realizar la detección, identificación y cuantificación de organismos genéticamente modificados (OGM) de los cultivos en el país. El objetivo del presente estudio fue validar la técnica de cuantificación absoluta de mezclas de hoja en fracción masa de maíz GM a través de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real (qPCR) y digital (dPCR). Mezclas de hojas de maíz modificado con el evento MON810 se prepararon con hojas de maíz convencional, fueron analizadas con la técnica de qPCR, y como calibrantes se usaron un plásmido de referencia certificado y ADN obtenido de una hoja con la modificación MON810, y con la técnica de dPCR, la cual permite la medición precisa del número de copias iniciales de ADN en las muestras y no usa calibrantes. La prueba en qPCR cumplió con los criterios de validación, como límite de cuantificación, intervalo dinámico, eficiencia de amplificación, coeficiente de correlación y estimación de la incertidumbre. Además, se validó la técnica de dPCR previo a la cuantificación de las mezclas, usando materiales de referencia certificados (MRC). Una vez validada la técnica de dPCR se cuantificó la cantidad de material GM en las mezclas y los resultados entre ambas técnicas fueron comparables, indicando que pueden aplicarse para cuantificar la modificación genética en los cultivos y emitir los resultados en fracción masa o en número de copias. Los resultados muestran que se puede realizar la cuantificación de material genéticamente modificado de cultivos en México con resultados confiables.

Palabras clave: qPCR, dPCR, Zea mays L., OGM.

Abstract

In 2009 in Mexico, permission was given to release genetically modified maize (Zea mays L.) into the environment. This made it necessary to detect, identify and quantify genetically modified organisms (GMO) in the country's crops. The objective of this study was to validate the technique of absolute quantification of leaf mixtures in mass fraction of GM maize using real time (qPCR) and digital (dPCR) polymerase chain reaction (PCR) technique.Mixed leaves of maize modified with the MON810 event were prepared with conventional maize and analyzed with the qPCR technique. A certified reference plasmid and DNA obtained from a leaf with the MON810 modification were used as calibrants; besides, the dPCR technique was utilized since it allows a precise measurement of the number of DNA initial copies in the samples and does not require the utilization of calibrants. The test in qPCR complied with validation criteria, such as quantification limit, dynamic interval, amplification efficiency, correlation coefficient and estimation of uncertainty. Moreover, the dPCR technique was validated prior to quantification of the mixtures with the certified reference materials (CRM). Once the dPCR technique was validated, the GM material in the mixtures were quantified, and the results of the two techniques were comparable, indicating that they can be applied in quantifying genetic modification in crops and emit the results in mass fraction or copy number. The results show that quantification of genetically modified crop material in México is possible with reliable results.

INTRODUCCIÓN

En México, entró en vigor la Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados en 2005 y su reglamento en 2008, por lo cual la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA), a través del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA) inició las actividades de inspección, vigilancia y monitoreo de los cultivos genéticamente modificados (GM) en todo el país. El Centro Nacional de Referencia en Detección de Organismos Genéticamente Modificados (CNR-DOGM), donde se desarrolló este estudio, valida los métodos para asegurar la confianza en los resultados emitidos. El SENASICA envía las muestras al CNR-DOGM para su análisis. Las muestras deben ser de las primeras etapas de crecimiento de la planta, para dar a la autoridad un periodo suficiente para el ejercicio de sus facultades si es necesario. La mayoría de los métodos validados en el mundo para el análisis de OGM usan muestras de harina de las semillas, como maíz, soya o algodón (Luque-Perez et al., 2013; Mazzara et al., 2013), por lo cual, es conveniente tener métodos validados aplicables a las matrices que se analizan en el país, como las hojas de plantas de maíz.

La PCR es la técnica más usada para el análisis de ADN de los organismos derivados de la biotecnología moderna. La PCR en tiempo real o qPCR es una técnica sensible, rápida y cuantitativa; pero, las limitaciones son la necesidad de usar un calibrante, realizarla en un laboratorio que trabaje en un Sistema de Gestión basado en la norma internacional ISO/ IEC 17025:2005, y usar MRC generados por una institución competente (Žel et al., 2006), los cuales, en muchos eventos con modificación genética, no están disponibles inmediatamente en la mayoría de los países, incluyendo México. Estas limitaciones pueden ser superadas por la nueva técnica dPCR, la cual permite cuantificar el número de copias de una secuencia de ADN en una muestra a través de la amplificación desde una sola copia por división de la muestra en arreglos digitales. Esta técnica permite obtener moléculas individuales de ADN en cada uno de los cientos de pozos pequeños donde se realiza la reacción; esta cuantificación es una respuesta lineal y no necesita calibrante como referencia. Se basa en el concepto de diluciones límite usadas para enriquecer secuencias minoritarias por un proceso de partición. En este proceso no hay diferencias potenciales por efectos de la matriz entre el estándar y la muestra investigada, como en la qPCR, donde el ciclo de amplificación determina la concentración inicial de la secuencia de ADN analizada por interpolación con una curva de calibración (Corbisier et al., 2010). La técnica de dPCR no se usa para cuantificar muestras en hoja de maíz GM.

Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar la cuantificación de mezclas en fracción masa y en número de copias del evento MON810. El evento MON810 es una construcción genética generada con fines comerciales por Monsanto Company^® (Monsanto Company, 2002) que contiene una parte del marco abierto de lectura (ORF) del gen cry1Ab de la bacteria Gram positiva Bacillus thuringiensis (Monsanto Company, 2002; CERA, 2012), construcción que se introdujo en el genoma de maíz (maíz comercial: YielGard^®-Monsanto Company^®). La transformación permite expresar a este tipo de maíz MON810 un fragmento de la proteína CryA1b de 91 kDa (CERA, 2012), un péptido que confiere resistencia a daño por insectos del orden Lepidóptera (Monsanto Company, 2002) y cuya liberación al ambiente fue primero en los EE.UU. en 1995 (CERA, 2012).

MATERIALES Y MÉTODOS

Toma de muestra

El estudio se realizó en el CNRDOGM del SENASICA. A partir del permiso de liberación al ambiente 094/2010 (CIBIO-GEM, 2010), en julio de 2011 se recolectaron aleatoriamente 51 hojas de maíz (Zea mays) de un cultivo GM proveniente de Chihuahua, que contenía el evento MON810 y 32 hojas de maíz convencional. A cada hoja (convencional y GM) se le asignó un código con el cual se identificaron durante todo el estudio.

La presencia del evento MON810 o la ausencia de modificación se verificó en segmentos, menores de 3 cm, del ápice de todas las hojas. Con el resto de cada hoja se formaron lotes de 1 ±0.05 g, se etiquetaron y almacenaron a -20 °C.

Liofilización

Las hojas se almacenaron 48 h a -70 °C y se deshidrataron en una liofilizadora (LABCONCO, Kansas City, MO, USA) a -52 °C y 0.22 mBar. Las muestras se pesaron a las 6, 24 y 48 h hasta peso constante y se almacenaron a -20 °C.

Extracción de ADN

El ADN genómico se extrajo con el método comercial Fast ID Genomic DNA Extraction Kit (Genetic ID NA, Inc. Fairfield, IA, USA). En tubos de 15 mL se mezclaron 2 g de la muestra y 6 mL de solución de lisis, se homogeneizó y se agregaron 30 μL de proteinasa K, se homogeneizó con vortex, se incubó 1 h a 65 °C y centrifugó 5 min a 4500 g. Un mL de sobrenadante, por duplicado, se transfirió a un tubo de 2 mL y se agregó un volumen igual de cloroformo, se agitó en vortex y se centrifugó 5 min a 9391 g. De la fase acuosa se transfirieron 900 μL a tubos de 2 mL, se agregó un volumen igual de solución de unión y se agitó en vortex. La mezcla se centrifugó 3 min a 9391 g, el sobrenadante se pasó a través de una columna de unión de ADN colocada en el sistema de vacío para columnas de unión a ADN QIAvac 24 Plus (QUIAGEN Inc., Valencia, CA, EE.UU.). En el mismo equipo se lavaron las columnas con 800 μL de solución de lavado y se realizaron tres lavados con 800 μL de etanol al 75 %; la última centrifugación se realizó a 9391 g por 3 min. La columna se transfirió a microtubos de 1.6 mL y se agregaron 50 μL de amortiguador 1X TE, se incubó 5 min a 65 °C, se centrifugó 3 min a 9391 g y se repitió una vez el procedimiento con 50 μL de amortiguador 1X TE, para obtener un volumen final de 100 μL de amortiguador 1X TE con ADN en suspensión. La extracción de ADN del material liofilizado se hizo con 200 mg de muestra, se mezclaron con 2 mL de amortiguador de lisis y se adicionaron 10 μL de proteinasa K; después se realizó el mismo procedimiento para el Fast ID Genomic DNA Extraction Kit. La concentración se determinó con un espectrofotómetro de ultra bajo volumen NanoDrop^® 2000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) y las muestras se estandarizaron a una concentración 50 ng μL^-1 con agua estéril. Todas las muestras se almacenaron a -20 °C.

Identificación del evento específico MON810

La identificación del gen endógeno hmgA y del evento específico MON810 en cada muestra se realizó por duplicado, en el equipo de PCR tiempo real ABI7500 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA) con TaqMan^® Universal PCR Master Mix, iniciadores y sondas TaqMan^® (ABI, ibid). Las secuencias fueron tomadas del método validado por la European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed y la European Network of GMO Laboratories (EURL-GMFF y ENGL, 2010). hmgA con un producto de amplificación de 79 pb: (f) 5'-TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA-3', (r) 5'-GCT ACA TAG GGA GCC TTG TCC T-3', (s) 5'-(FAM)-CAA TCC ACA CAA ACG CAC GCG TA-(TAMRA) - 3'; y MON810 con un producto de amplificación de 92 pb: (f) 5'-TCG AAG GAC GAA GGA CTC TAA CGT-3' (r) 5'-GCC ACC TTC CTT TTC CAC TAT CTT-3'; (s) 5'-(FAM)-AAC ATC CTT TGC CAT TGC CCA GC-(TAMRA)-3'. Cada reacción se preparó a un volumen final de 20 μ L, con 10 μ L de Master Mix, sonda e iniciadores, con concentración final de 180 nM y 300 nM, respectivamente, 2 μ L (100 ng) de ADN molde y la cantidad suficiente de agua estéril para completar los 20 μ L. Cada análisis por PCR incluyó testigos negativos, con ADN de semilla de algodón (Gossypium hirsutum) para la respuesta a la secuencia endógena de maíz hmg, una muestra de maíz no modificado para la secuencia MON810, y un blanco de reactivos (sin ADN), por duplicado. Las condiciones de termociclado fueron 1 ciclo a 50 °C por 2 min, luego 1 ciclo a 95 °C por 10 min y 40 ciclos de amplificación de 95 °C por 10 s, alineamiento y extensión de 60 °C por 1 min.

Elaboración de mezclas GM

Mezclas GM al 0.1, 1 y 10 % se prepararon con hojas húmedas y liofilizadas identificadas como positivas (GM) y negativas (convencionales) a la presencia del evento específico MON810 (Cuadro 1). Las hojas con humedad se colocaron en un mortero, se trituraron con nitrógeno líquido hasta que el tamaño de partícula pareciera homogéneo. La cantidad de hoja GM correspondiente al porcentaje masa fue pesada, se agregó hoja convencional hasta completar 10 g y la mezcla se homogeneizó. De los 10 g se obtuvieron cuatro submuestras, de 2±0.2 g, y cada una se colocó en un mortero limpio. El mismo procedimiento se realizó para las mezclas de 0.1 y 1 %. Las mezclas se sometieron al proceso de reducción de tamaño de partícula, con nitrógeno líquido, en mortero, hasta alcanzar el tamaño menor y homogéneo de partícula posible. El mismo procedimiento se aplicó a las mezclas con hojas liofilizadas, pero las mezclas tuvieron 2 g de peso total y se dividieron en cuatro submuestras de 200± 20 mg cada una. El ADN fue extraído después del acondicionamiento con el método ya descrito.

Los resultados de la cuantificación de las mezclas GM con la técnica de dPCR se compararon con la cuantificación de la secuencia MON810 y del gen endógeno hmgA por qPCR, con una curva de calibración para cada secuencia, en el intervalo dinámico de 0.1 a 100 ng de ADN de una hoja con la modificación genética MON810 (100 % GM). La cantidad de OGM en las mezclas se calculó con las curvas de calibración y la concentración se expresó en porcentaje (m/m) de acuerdo con la ecuación 1 (EURL-GMFF y ENGL, 2010):

Para generar trazabilidad en las mediciones al SI y con base en la normativa ISO/IEC 17511:2005 se evaluó 100 % GM que sirvió como calibrante, en número de copias, usando el plásmido certificado EMR AD-413, del Instituto para Materiales de Referencia y Medidas (IRMM, Geel, Bélgica). Una curva de calibración se construyó con concentraciones nominales de 10², 10³, 10⁴ y 10⁵ copias del plásmido. Para obtener la concentración de OGM de las mezclas de hoja en porcentaje con los resultados obtenidos, se usó la ecuación 2 (EURL-GMFF y ENGL, 2010):

Para estas pruebas, cada muestra se analizó por cuadruplicado empleando las plataformas LightCycler^® 480 (LC480) (Roche Inc., Indianapolis, IN, USA ), ABI7500 y ViiA 7 (ABI, ibid); correspondientemente, se utilizó en cada reacción de PCR Light Cycler^® 480 Probes Master (Roche, ibid) y TaqMan^® Universal PCR Master Mix (ABI, ibid). En todos los casos, iniciadores y sondas TaqMan^® (ABI, ibid) para MON810 y hmgA ya descritas, en un volumen final de 20 μL, que incluían 10 μL de Master Mix, sonda e iniciadores a una concentración final de 180 nM y 300 nM, respectivamente, 2 μL de ADN y la cantidad suficiente de agua estéril para completar 20 μL.

Cada análisis por PCR incluyó testigos negativos con ADN de una especie diferente a maíz, en este caso ADN de semilla de algodón para la respuesta a la secuencia endógena de maíz hmg, y para la secuencia MON810 una muestra de maíz no modificado, así como un testigo reactivos (sin ADN), ambas por duplicado. Las condiciones de termociclado fueron: 1 ciclo a 95 °C por 10 min, y 40 ciclos de amplificación de 95 °C por 10 s, alineamiento de 60 °C por 30 s y elongación de 60 °C por 1 min. Las curvas de calibración debieron poseer linealidad y pendiente entre - 3.1 y -3.6 para ser usadas en la cuantificación.

La estimación de la incertidumbre asociada al porcentaje de OGM se obtuvo de la distribución estadística de los resultados, ésta se caracterizó mediante la desviación estándar de los resultados (ecuaciones 3 a 6) (Trapman et al., 2009):

donde uc: incertidumbre típica combinada; u(C_ref): incertidumbre del componente o material de referencia; u(RSD_IP): incertidumbre del componente de medición en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad.

donde u(RSD_IP): incertidumbre del componente de medición en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad; SD: promedio de la desviación estándar de la medición; n: número de repeticiones de la medición.

Para obtener la incertidumbre expandida se usa la ecuación.

donde U: incertidumbre expandida; uc: incertidumbre típica combinada; k: factor de cobertura (igual a 2 representado por un intervalo de confianza del 95 %)

Por último, la incertidumbre relativa es obtenida del cociente entre la incertidumbre expandida y el promedio en porcentaje de OGM, como se muestra en la ecuación 6.

donde U Relativa: incertidumbre relativa de la medición; U: incertidumbre expandida; x: Promedio en % de OGM de cada medición.

Cuantificación por dPCR

Los ensayos de dPCR se hicieron en la plataforma OpenArray^® Real-Time PCR System, que es una placa OpenArray^®Digital PCR con 3072 perforaciones, las cuales están en 48 sub-arreglos de 64 pozos con capacidad de 33 nL cada uno. Estos fueron tratados para permitir la retención de líquidos dentro del pozo. Cada pozo de la placa Open Array™ fue llenado por el equipo AccuFill™ System (ABI, ibid) desde un pozo de una placa de 384 pozos de acuerdo con la distribución ya establecida en el programa. Una placa de 384 pozos sirvió para cargar 8 placas OpenArray^®Digital PCR (Figura 1).

Una vez validada la técnica, se cuantificaron las mezclas para 0.1, 1 y 10 %, se realizaron diluciones en serie con factor 1:10 desde la solución de ADN estandarizada a 50 ng μL^{- 1} hasta las concentraciones requeridas para obtener un número de copias entre 0.6 y 1.6, establecido por el fabricante. La cantidad de ADN de cada concentración para la amplificación de la secuencia hmgA fue 1 ng, para la secuencia GM al 10 % fue 10 ng y para las mezclas al 0.1 y 1 % fue 100 ng. Después de cuantificar el número de copias de MON810 y hmgA en las mezclas GM con dPCR, la cantidad de OGM expresada en porcentaje se calculó con la ecuación 7 (EURL-GMFF y ENGL, 2010).

Todos los casos se evaluaron cuadruplicados, y cada uno incluyó el promedio de 11 sub-arreglos usados en la placa de dPCR y un subarreglo sin la adición de ADN como control de reactivos para cada concentración. El volumen de reacción por subarreglo fue 5 μL, que contenían 2.5 μL de 1X TaqMan^® OpenArray^® Digital PCR Master Mix (ABI, ibid), sonda e iniciadores (secuencias ya descritas) a una concentración final de 180 y 300 nM, respectivamente. Las condiciones de termociclado fueron: 1 ciclo a 95 °C por 10 min, y 40 ciclos de amplificación a 95 °C por 20 s, alineamiento a 60 °C por 60 s y elongación a 72 °C por 30 s.

En la fase final de análisis, el programa OpenArray^® Digital PCR genera el valor en número de copias y el intervalo de confianza de cada muestra analizada en la placa de OpenArray^® Digital PCR. Para cada muestra el programa genera el número de copias de cada subarreglo con un intervalo de confianza de 95 %, mediante el conteo del número de reacciones positivas con relación al número de particiones usando la aproximación binomial de Poisson, basada en el número de particiones con productos amplificados y el número total de particiones analizadas (Corbisier et al., 2010), de acuerdo con la ecuación 8. Para cada posición del subarreglo el programa asigna un valor positivo (1) cuando detecta una amplificación dentro de un intervalo aceptable o negativo (0) si no hay una amplificación. El programa no permite el ajuste manual del ciclo de amplificación o Ct asociado con cada nano reacción. El programa OpenArray^® Digital PCR genera, desde los datos procesados, mapas en dos dimensiones que permiten revisar mediante color el resultado de la variación de copias en cada una de las posiciones de los subarreglos de la placa OpenArray^® Digital PCR:

donde M: número de moléculas por panel; H: número de particiones que contienen producto amplificado; C: número total de particiones analizadas.

Análisis estadístico de los resultados del dPCR

El programa Digital PCR^® genera el valor promedio y un intervalo de confianza para cada cuantificación en número de copias. Para las mezclas GM, donde los resultados se expresan en porcentaje de la secuencia GM con respecto a la secuencia endógena, el análisis estadístico se realiza con las ecuaciones 3 a 6, considerando U(ref) igual a 0 porque no se usa material de referencia. Las fórmulas de incertidumbre están referenciadas a la guía de medición de incertidumbre publicada por la JRC (Trapman et al., 2009), pero la incertidumbre del material de referencia en el cálculo es cero debido a que la PCR digital no necesita un material de referencia para la cuantificación.

Análisis del material recolectado

La identificación de la modificación genética MON810 se realizó en las 51 hojas recolectadas (Figura 4) a partir del permiso de liberación al ambiente 094/2010 (CIBIOGEM, 2010), y se comprobó en 47 de ellas; pero en ninguna de las 31 hojas convencionales se detectó la modificación genética. Además de la identificación de la modificación genética de MON810, en todas las hojas se realizó la amplificación de la secuencia endógena del maíz (hmgA), que sirvió como secuencia normalizadora para las pruebas cuantitativas en qPCR. La amplificación de esta secuencia fue positiva en todas las hojas, con valor experimental promedio Ct_hmgA=23.5 y para la secuencia transgénica de Ct_MON810=26.3 (Figura 5). La diferencia entre la secuencia endógena y la GM fue 2.8 ciclos, que es mayor al esperado de 1 Ct. Lo anterior tiene como base la ecuación de la PCR (2ⁿ), donde n es el número de ciclos de amplificación, y la composición genética teórica del ADN de la hoja de maíz GM, en la cual 50 % del material genético proviene de la herencia paterna o materna. En este caso, comercialmente se usan líneas de herencia paterna, y se esperaba que el número de copias GM en el tejido vegetal se encontrara en esa proporción, y genera una reacción de qPCR con Ct de amplificación del gen endógeno con un ciclo antes que Ct de la secuencia GM. Los resultados permitían esperar que las mezclas presentaran un comportamiento atípico, ya que el valor calculado no correspondió al 50 % del valor teórico.

Elaboración de mezclas GM y extracción de ADN

Las mezclas GM con hojas frescas y liofilizadas se analizaron según el diagrama en la Figura 6 y las cantidades del Cuadro 2. En todos los casos se obtuvieron concentraciones de ADN mayores a 50 ng μL^-1, por lo cual se cuantificaron las mezclas.

Cuantificación de las mezclas por qPCR

Los resultados de la cuantificación de las mezclas con muestras húmedas y uso de la curva de calibración de la hoja 100 % GM estuvieron lejos de los valores teóricos, inclusive cuando se consideró la incertidumbre relativa asociada con los valores promedio esperados (Cuadro 3). Una sobre estimación en la cantidad de OGM se observó respecto a los valores teóricos. Se descartó que los factores analíticos fueran el origen de la desviación en los resultados de cuantificación, ya que los valores de eficiencia de amplificación en las curvas de calibración se encontraron dentro de los rangintervalos permitidos (Mazzara et al., 2008; ENGL Working Group on Method Verification, 2011), 98.3 y 90.3 % para hmgA y MON810, y ambas con R²≥0.98. Además, los valores calculados de la desviación estándar relativa en condiciones de repetibilidad (RSDr) mostraron que el ensayo es preciso, pues las desviaciones fueron menores de 25 %, de acuerdo con la normativa europea (Mazzara et al., 2008; ENGL Working Group on Method Verification, 2011). La incertidumbre relativa, aplicable sólo a la cuantificación experimental, es aceptable y comparable con resultados de publicaciones similares (Mazzaraet al., 2008; ENGL Working Group on Method Verification, 2011).

Esa variación podría deberse al contenido de humedad de las hojas en las mezclas, por lo cual, se cuantificaron las mezclas liofilizadas (Cuadro 2 y 4). Las mezclas mostraron resultados satisfactorios, por ser comparables, precisos (RSDr menores de 25 % en todos los casos) y repetibles. La incertidumbre del componente de medición en condiciones de repetibilidad u(RSD_IP) se redujo a un valor mínimo, proporcionalmente con el incremento del porcentaje de la mezcla GM. El valor de la u(RSD_IP) disminuyó y mostró que las condiciones de repetibilidad no afectaron la precisión del resultado.

Debido a que las mezclas GM elaboradas con hojas liofilizadas aportaron un valor más cercano a los valores en fracción masa, las cuantificaciones se realizaron a partir de estas mezclas, en lugar de las mezclas con hojas húmedas.

Con la curva de calibración elaborada con el MRC EMR AD-413 para las secuencias MON810 y hmgA (Cuadro 5) se cuantificó el número de copias de dichas secuencias de la hoja 100 % GM, y sirvió como calibrante en las pruebas anteriores, junto con las mezclas GM.

Una vez obtenido el número de copias se aplicó la ecuación 3 para calcular los valores en fracción masa (Cuadro 6). Los resultados experimentales coincidieron con el valor teórico predicho, pues con base en la fisiología del maíz se espera obtener 50 % del material genético modificado y los resultados experimentales. Así, los valores obtenidos de Ur son los esperados, son precisos y reproducibles, ya que los valores de RSDr son menores a 25 % y coinciden con los criterios de aceptación establecidos por la regulación aplicable a los análisis de OGM en la Unión Europea (EURL-GMFF y ENGL, 2010) .

Validación de la técnica de dPCR

Para validar la técnica se evaluó la concentración en número de copias del plásmido ERM^®-AD413, con y sin digestión enzimática, la amplificación se realizó sólo de la secuencia MON810, y se analizaron tres concentraciones nominales (Figura 7). De acuerdo con los resultados obtenidos, las concentraciones nominales de valor menor (0.33 y 0.66 copias por reacción, correspondientes a 50 y 100 copias), fueron comparables con el valor nominal esperado y, con base en los valores del intervalo de confianza que genera el software del equipo OpenArray^® Real-Time PCR, los resultados no mostraron diferencia con la evaluación del plásmido digerido y sin digerir. Estos resultados condujeron a la evaluación con el plásmido sin digerir.

Los resultados de la cuantificación del DMR-436IIa por dPCR mostraron que al utilizar 0.1 ng de la secuencia MON810 por subarreglo (42.1 ±3.6%) fueron comparables con el reportado en fracción masa, al considerar la incertidumbre expandida con un factor de cobertura de 2 (Figura 8).

Lo anterior permitió concluir que los valores son comparables con los reportados en un certificado (Corbisier et al., 2007) emitido por institutos de metrología (IRMM y CENAM), que fueron obtenidos con procedimientos estandarizados en laboratorios acreditados (ISO Guide 34:2009) con la técnica de qPCR, que es la más usada en pruebas moleculares debido al gran soporte técnico y validación en todo el mundo. El presente estudio es el primero realizado en la plataforma de OpenArray^® Real-Time PCR System y aplica para medir secuencias GM. Los resultados de validación permitieron seguir con la siguiente etapa de cuantificación de las mezclas.

Cuantificación de las mezclas de maíz por dPCR

Las cuantificaciones de las mezclas con las secuencias hmgA y GM mostraron disminución del número de amplificaciones, proporcional al porcentaje de cada una de las mezclas para MON810 (Figura 9). La cuantificación de las mezclas por qPCR (Cuadro 7) permitió concluir que los valores obtenidos por dPCR son más precisos, ya que se observa una relación proporcional entre el porcentaje GM obtenido para la hoja 100 % GM y las mezclas elaboradas desde ella. Es decir, entre 0.031, 0.3, 3.69 y 41.87 % el factor de dilución fue cercano a 1:10, y corresponde al factor de dilución usado para elaborar las mezclas de manera gravimétrica.

La incertidumbre fue menor para la mezcla con concentración menor, comparada con la obtenida por qPCR. Sin embargo, los resultados de la cuantificación de la hoja 100 % GM y la mezcla 10 % GM por qPCR fueron más cercanos al valor esperado; así, la cuantificación de esos dos materiales fue más exacta.

De acuerdo con el valor teórico del 50 % GM para la hoja de maíz, el factor de dilución entre la secuencia hmgA y MON810 es 0.5, al substituir en la igualdad anterior, la diferencia de Ct esperada es 1.

CONCLUSIONES

En el presente estudio la técnica de PCR digital se validó usando materiales de referencia certificados por institutos de metrología nacional e internacional. Los resultados fueron comparables entre los valores reportados en los certificados y los determinados experimentalmente con la plataforma OpenArray^® Real-Time PCR System. Además, los resultados se expresaron en número de copias para ERM-AD413, y en porcentaje GM para DMR-436IIa, lo cual contribuye a la validación de la técnica en la cuantificación de secuencias transgénicas. La cuantificación de hojas de maíz por PCR en tiempo real y PCR digital con la presencia del evento MON810 después de validar la técnica permitió obtener los resultados de cuantificación de mezclas por PCR digital más cercanos a los porcentajes en fracción masa de las mezclas realizadas que los obtenidos por la técnica tradicional de PCR en tiempo real.

La caracterización de cada hoja recolectada permitió establecer la presencia o ausencia del evento MON810; a la vez, esto condujo a realizar las mezclas genéticamente modificadas en fracción masa al 0.1, 1 y 10 %, con una hoja 100 % GM como calibrante para los ensayos por PCR en tiempo real y el tejido liofilizado, lo cual mejoró la cuantificación. Con las mezclas liofilizadas se obtuvieron resultados comparables entre las dos técnicas PCR en tiempo real y digital. Los resultados por PCR digital son los más próximos a los valores esperados en fracción masa de las mezclas.

En conclusión, la técnica de PCR digital a través de la plataforma OpenArray^® Real-Time PCR System es aplicable para cuantificar el material vegetal genéticamente modificado y puede utilizarse en la caracterización de materiales de referencia, usados como calibrantes, en pruebas de PCR en tiempo real.

LITERATURA CITADA

Bhat, S., J. Hermann, P. Armishaw, P. Corbisier, and K. R. Emslie, K. 2009. Single molecule detection in nanofluidic digital array enables accurate measurement of DNA copy number. Anal. Bioanal. Chem. 394: 457-467.         [ Links ]

CERA (GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment). 2012. ILSI Research Foundation, Washington, D.C. http://www.cera-gmc.org/GmCropDatabaseEvent/MON810%20#. (Consulta: enero de 2015.         [ Links ]

CIBIOGEM (Comisión Intersecretarial de Bioseguridad de los OGM). 2010. Registro Nacional de Bioseguridad de los Organismos Genéticamente Modificados. CIBIOGEM, CONACYT. http://www.conacyt.gob.mx/cibiogem/index.php/resoluciones/permisos. (Consulta: agosto de 2013).         [ Links ]

Corbisier, P., Broeders, S., Charles, S., Trapmann, S., Vincent, S. and Emons, H. 2007. Certification report. Certification of plasmidic DNA containing MON 810 maize DNA fragments. Certified Reference Material ERM^®-AD413. Institute for Reference Material and Measurements (IRMM) and European Reference Materials (ERM). 37 p. https://ec.europa.eu/jrc/sites/default/files/rm/ERM-AD413_report.pdf. (Consulta: agosto de 2013.         [ Links ]

Corbisier, P., S. Bhat, L. Partis, V. R. D. Xie, and K. R. Emslie. 2010a. Absolute quantification of genetically modified MON810 maize (Zea mays L.) by digital polymerase chain reaction. Anal. Bioanalytical. Chem. 396: 2143-2150.         [ Links ]

ENGL Working Group on Method Verification. 2011. Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods. Joint Research Centre and Office for Official Publications of the European Communities, 23 p. http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/111111111/22252. (Consulta: agosto de 2013).         [ Links ]

EUR22948EN-2007. CERTIFICATION REPORT. Certification of plasmidic DNA containing MON 810 maize DNA fragments Certified Reference Materials ERM^®-AD413. European Commission Joint Research Centre. Institute for Reference Materials and Measurements. EUR 22948 EN, ISBN 978-92-79-07139-3, ISSN 1018-5593, DOI 10.2787/49996.         [ Links ]

EURL-GMFF (European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed) and ENGL (European Network of GMO Laboratories). 2010. Compendium of Reference Methods for GMO Analysis. Joint Research Centre and Office for Official Publications of the European Communities. 259 p. http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/111111111/15068. (Consulta: agosto de 2013).         [ Links ]

ISO Guide 34:2009. General requirements for the competence of reference material producers.

Luque-Perez, E., M. Mazzara, T. P. Weber, N. Foti, E. Grazioli, B. Munaro, G. Pinski, G. Bellocchi, G. Van den Eede, and C. Savini. 2013. Testing the robustness of validated methods for quantitative detection of GMOs across qPCR instruments. Food Anal. Methods 6: 343-360.         [ Links ]

Mazzara, M., C. Savini, C. Delobel, H. Broll, A. Damant, C. Paoletti, and G. Van den Eede. 2008. Definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO Testing. European Network of GMO Laboratories (ENGL). Joint Research Centre and Office for Official Publications of the European Communities. 8 p. http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/111111111/5261. (Consulta: agosto de 2013).         [ Links ]

Mazzara, M., C. Paoletti, P. Corbisier, E. Grazioli, S. Larcher, G. Berben, M. De Loose, I. Folch, C. Henry, N. Hess, L. Hougs, E. Janssen, G. Moran, R. Onori, and G. Van den Eede. 2013. Kernel lot distribution assessment (KeLDA): a comparative study of protein and DNA-based detection methods for GMO testing. Food Analytical. Methods 6: 210-220.         [ Links ]

Monsanto Company. 2002. Safety Assessment of YieldGard^® Insect-Protected Corn Event MON 810. 28 p. http://www.cera-gmc.org/files/cera/GmCropDatabase/docs/dec-docs/02-269-010.pdf. (Consulta: enero de 2015).         [ Links ]

Trapman, S., M. Burns, H. Broll, R. Macarthur, R. Wood, and J. Žel. 2009. Guidance Document on Measurement Uncertainty for GMO Testing Laboratories. Joint Research Centre and Office for Official Publications of the European Communities. 48 p. https://ec.europa.eu/jrc/en/publication/eur-scientific-and-technical-research-reports/guidance-document-measurement-uncertainty-gmo-testing-laboratories. (Consulta: agosto de 2013.         [ Links ]

Žel, J., K. Cankar, M. Ravnikar, M. Camloh, and K. Gruden. 2006. Accreditation of GMO detection laboratories: improving the reliability of GMO detection. Accredit. Qual. Assur.         [ Links ]