Actividad in vitro del extracto acuoso del Bonellia flammea contra hongos fitopatógenos

In vitro activity of an aqueous extract of Bonellia flammea against phytopathogenic fungi

F. Amalia Moo-Koh¹, J. Cristóbal Alejo¹*, Arturo Reyes-Ramírez¹, J. María Tun-Suárez¹, ^†Ruth Sandoval-Luna², J. Abrahán Ramírez-Pool²

¹ Laboratorio de Fitopatología. Instituto Tecnológico de Conkal 1. Km 16.3 antigua carretera Mérida-Motul. Conkal, Yucatán, México. * Autor responsable (jairoca54@hotmail).

Recibido: mayo, 2014.
Aprobado: septiembre, 2014.

Resumen

Las enfermedades causadas por hongos en las plantas disminuyen la calidad y el rendimiento de los cultivos; el control de estas enfermedades demanda investigación enfocada a reducir el uso de los fungicidas sintéticos, los cuales generan resistencia de cepas y contaminación al medio ambiente. El extracto acuoso de Bonellia flammea es una alternativa natural de control ya que actúa como fungicida. El objetivo del presente estudio fue evaluar in vitro el efecto del extracto acuoso de B. flammea contra siete hongos fitopatógenos. El diseño experimental fue completamente al azar, los tratamientos fueron cada hongo expuesto al extracto y el hongo sin extracto, la unidad experimental fueron cuatro cajas petri, con cuatro repeticiones, los datos se analizaron mediante ANDEVA y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05). Las variables medidas fueron el crecimiento micelial, el porcentaje de esporulación y la germinación de conidios; además se identificaron a nivel especie los hongos mediante iniciadores ITS (Espacios Internos de Transcripción). El extracto acuoso de B. flammea tuvo una actividad inhibitoria en los hongos Curvularia verruculosa, Curvularia lunata, Exserohilum rostratum, Corynespora cassiicola, Bipolaris setariae y Lasiodiplodia parva, con un intervalo de inhibición de 20 a 100 % en el crecimiento micelial, de 58 a 100 % en la esporulación y de 73 a 100 % en la germinación de conidios, lo cual implica selectividad antifúngica del extracto según la especie de hongo.

Palabras clave: Inhibición, control, fungosis, PCR.

Abstract

Key words: Inhibition, control, fungosis, PCR.

INTRODUCCIÓN

El problema fitosanitario de los cultivos agrícolas se manifiesta por la presencia de plagas y enfermedades; estas últimas en su mayoría son inducidas por hongos, bacterias, virus y nematodos. Los hongos fitopatógenos causan al menos el 60 % de las enfermedades durante la producción de los cultivos, con importantes pérdidas de producción debido a que afectan el desarrollo de las plantas y las hacen más vulnerables al ataque por otros fitopatógenos (Agrios, 1999; Garon, 2006).

El uso indiscriminado y recurrente de fungicidas sintéticos genera presencia de cepas resistentes, acumulación de residuos tóxicos de los productos agrícolas y contaminación ambiental (Pérez et al., 2011). Los extractos vegetales son una opción para control ya que actúan como fungicidas o reguladores del desarrollo de hongos fitopatógenos; el empleo de extractos para el control de hongos en el marco de la agricultura sostenible es una alternativa promisoria, debido a que los compuestos obtenidos de las plantas son biodegradables, de elevada efectividad, de bajo costo y no contaminan al medio ambiente (Martínez et al., 2010). En el estado de Yucatán, México, hay estudios sobre extractos obtenidos de especies nativas con efecto antifúngico y uno de ellos es el extracto acuoso de Bonellia flammea (Cristóbal et al., 2013).

Para tener una propuesta adecuada del manejo de las enfermedades causadas por hongos fitopatógenos, es necesaria la caracterización e identificación de estos organismos evaluados con extractos. Por lo tanto, la identificación morfotaxonómica tradicional necesita técnicas moleculares que permitan una identificación confiable y conocer además las relaciones filogenéticas entre organismos, ya que en ocasiones no es posible realizarlo de manera tradicional debido a la biología del propio hongo y a la similitud morfológica entre especies. Las técnicas moleculares basadas en la secuenciación de la región ribosomal permiten un análisis rápido y se utilizan para el diagnóstico rutinario de varios agentes fitopatógenos (Guigón et al., 2010).

Con el propósito de ampliar el espectro de inhibición antifúngico, el objetivo del presente estudio fue evaluar el extracto acuoso de B. flammae contra siete hongos fitopatógenos aislados de cultivos en el estado de Yucatán y se identificaron a nivel especie los hongos fitopatógenos, usando iniciadores ITS.

MATERIALES Y MÉTODOS

Identificación de hongos fitopatógenos

La identificación preliminar del género se realizó mediante la observación de las características morfotaxonómicas de los siete hongos fitopatógenos aislados y se compararon con las claves de Barnett y Hunter (1999), donde se consideraron: el tipo de micelio, cuerpo fructífero y tipo de esporas (Cuadro 1).

Identificación molecular

La identificación molecular a nivel especie de las siete cepas se basó en un análisis de la región ITS1-5.8s-ITS2 del rADN (White et al., 1990). Para la extracción de ADN se recolectó micelio desde un cultivo líquido a base de papa más dextrosa de 7 d de crecimiento fúngico a 30 °C; la masa micelial de cada hongo se recuperó por filtración con gasa y el ADN se obtuvo con la metodología reportada por Liu et al. (2002). Para lograr una mayor recuperación y pureza del ADN se probaron dos modificaciones:

Modificación 1: se usó micelio fresco al cual se agregó la solución amortiguadora, se homogenizó y se calentó a 65 °C por 1 h.

Modificación 2: el micelio que se recuperó se deshidrató 6 d en una estufa a 56 °C, con un palillo se rompió la la pared celular, se agregó solución amortiguadora y se colocó en el limpiador ultrasónico BRANSON^® 2510 (D.F, México) por 10 s.

La integridad del ADN se verificó por electroforesis en gel de agarosa al 1 % (p/v) (SIGMA^®). Las regiones internas ITS1 e ITS2 entre los genes ribosomales (rADN) 18S-5.8S y 28S (White et al., 1990) se amplificaron por PCR con los iniciadores ITS1 (5' CCGTAGGTGAACCTGCGG 3') e ITS4 (5' TCCTC-CGCTTATTGATATGC 3') sintetizados por INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES (IDT). La mezcla de reacción consistió en: amortiguador para PCR (1 X), iniciadores ITS1 e ITS4 (1 mM), MgCI₂ (3 mM), dNTP (0.2 mM), Taq DNA polimerasa (2.5 unidades), y ADN (100 ng) para un volumen final de 50 μL. La amplificación por PCR se realizó en un Termociclador (TECHNE^®-312, Minnesota, EE.UU.) bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial de 2 min a 95 °C, seguido de 30 ciclos (desnaturalización a 94 °C por 1 min, alineación a 54 °C por 30 s y una extensión de 1 min a 72 °C) con una extensión final de 5 min a 72 °C (White et al., 1990).

Preparación del extracto acuoso B. flammae

Para preparar el extracto vegetal acuoso se pesaron 3 g de material seco que se depositaron en 50 mL de agua destilada a ebullición durante 15 min. Después, el extracto se enfrió y se filtró con papel Whatman No.1 para eliminar residuos sólidos. Luego, bajo condiciones asépticas y para eliminar hongos y bacterias contaminantes, se realizó una segunda filtración a través de un filtro membrana de 0.45 /ím (Rodríguez et al., 2012).

Determinación de la efectividad in vitro del extracto vegetal

Para esta determinación se utilizó el medio de cultivo PDA esterilizado, el cual se mezcló con el extracto vegetal para obtener una concentración de 3 % (30 g planta seca L^-1 agua), concentración establecida para la evaluación de la efectividad (Cristóbal et al., 2013). La mezcla se vació en cajas petri (diámetro 8 cm) y permanecieron 24 h para verificar su esterilidad. Después, en el centro de cada caja petri que contenía el extracto, se depositó un disco de micelio (diámetro 9 mm) de los hongos cultivados en medio de cultivo PDA; se sellaron las cajas y se conservaron a temperatura ambiente (30 °C) para su evaluación posterior.

Variables evaluadas

Inhibición del crecimiento micelial (%)

El diámetro del crecimiento del hongo se midió cada 24 h hasta que la cepas testigo sin aplicación del extracto cubrió por completo la caja petri. La efectividad del extracto sobre cada hongo se calculó con la siguiente fórmula (Abbott, 1925):

E = ((Test - Trat)/Test) x 100

Inhibición de la esporulación y la germinación de conidios (%)

En las cajas petri donde no se observó 100 % de inhibición del crecimiento micelial, se agregaron 9 mL de agua destilada estéril para la recolección de las conidios; con un portaobjetos se raspó el micelio, la solución obtenida se filtró con gasas estériles y esta solución se depositó en un tubo de ensayo de 50 mL. Después, 100 μL de la solución filtrada se depositaron en un vial estéril, se adicionaron 900 μL de agua destilada estéril, se transfirieron 9 μL de esta dilución de conidios en cada campo del hematocitómetro (cámara de Neubauer), y se observaron en el microscopio compuesto Leica^® BM500 a 10X (Wetzlar, Alemania).

El número de conidios (Hölleret al., 1999) se calculó para cada hongo fitopatógeno con la fórmula:

NE= (X / 0.1) (1000) (9)

donde NE = número de esporas en 1 mL, X = promedio de esporas de los 4 campos, 0.1 = profundidad de la cámara, 1000 = volumen, 9 = mL agregados a las cajas petri para el arrastre de esporas. Para contabilizar la germinación de conidios se aplicó la misma metodología de la esporulación. Sin embargo, los 9 μL de la dilución de conidios se incorporaron en una caja petri con medio de cultivo PDA marcada en cuadrantes y otra con PDA más extracto previamente preparado. Las observaciones se realizaron cada hora, hasta que en las cepas testigo se cuantificó la emisión del tubo germinativo de 100 conidios.

El porcentaje de inhibición en la esporulación y en la germinación de conidios se obtuvo por diferencia porcentual, al considerar al tratamiento testigo como el 100 % de la capacidad de los hongos para expresar la producción de esporas y su germinación.

Diseño experimental

El diseño experimental fue completamente al azar, con los tratamientos: 1) cepa del hongo expuesto al extracto y, 2) cepa testigo del hongo sin extracto. Con los datos de porcentaje de inhibición de crecimiento micelial, esporulación y germinación de conidios, se realizó un ANDEVA usandoSAS Ver. 8.1 para Windows^®, previa transformación de los datos con la fórmula: y = arsin (sqrt (y/100)). Las medias de los tratamientos se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Identificación molecular de siete hongos fitopatógenos

Las extracciones del ADN con la metodología modificada de Liu et al. (2002) permitió obtener 57 % de las cepas estudiadas, mientras que 43 % de las cepas se obtuvo con la metodología de extracción empleada para el Kit Axygen para sangre y tejido (AxyPrep TM Blood Genomic DNA MiniPrep Kit). La extracción del ADN se dificulta principalmente por los componentes y la estructura de la pared celular de los hongos, que confieren rigidez y presencia de carbohidratos excretados por las células (Lurá et al., 2003), pero con las modificaciones implementadas para extraer ADN se mejoró la eficiencia de la técnica.

En todas las muestras se obtuvieron amplificaciones por PCR usando los iniciadores ITS1 e ITS4; inicialmente se secuenciaron tres fragmentos amplificados usando ambos iniciadores, pero los electroferogramas del iniciador ITS1 mostraron traslape de picos en las bases nucleotídicas en comparación de las amplificadas con el iniciador ITS4, por lo cual la comparación con la base de datos del GenBank (NCBI) se realizó usando las secuencias amplificadas con el iniciador ITS4. El análisis comparativo de las secuencias con el banco de genes del NCBI permitió identificar las cepas en estudio con índices de identidad de 97 y 99 % con las especies comparadas (Cuadro 2), las cuales se reportan también con su sinonimia (homología) cuando es el caso, asi como con su fase sexual o teleoforma correspondiente.

Para la cepa ITC1 la especie correspondió a Cochliobulus verruculosus la cual afecta al sorgo (Sorghum spp.), frijol (Phaseolus vulgaris), caña de azúcar (Saccharum officinarum) y maíz (Zea mays) (FAO, 2010). La cepa ITC2 se identificó como Lasiodiplodia theobromae y, de acuerdo con Sandoval et al. (2013), es una especie cosmopolita e infecta al menos 280 especies de plantas en el mundo, como mango (Mangifera indica) con pudriciones en postcosecha, aguacate (Persea americana) y cacao (Theobroma cacao) en los cuales afecta la mayoría de los órganos y causa muerte de la planta.

La cepa ITC3 correspondió a Exserohilum rostratum causando síntomas similares en Caryota mitis (Cúndom et al., 2006). La cepa ITC4 tuvo homología con Curvularia lunata, asociado con manchas en follaje y en semillas de arroz (Oryza sativa), cacao, trigo (Triticum aestivum), sorgo, maíz y amaranto (Amaranthus hypochondriacus) (FAO, 2010). La cepa ITC6 se identificó como Bipolaris setariae, Riascos et al. (2011) lo asociaron con pudriciones y tizones foliares en palmas de las especies Bactris gasipaes y Chrysalidocarpus lutescens. En relación con la cepa ITC7 la homología correspondió con Corynespora cassiicola el cual induce pérdidas de producción en cultivos de importancia económica como pepino (Cucumis sativu), calabaza (Curcubita pepo), papaya (Carica papaya), tomate (Solanum lycopersicon) y chiles (Capsicum annuum y C. chinense) afectando principalmente el follaje (Pérez et al., 2000; Tun et al., 2011). Finalmente, la cepa ITC9 presentó identidad con Lasiodiplodia parva, aunque se le considera en algunos casos como fitopatógeno secundario (Burgess et al., 2006) y este resultado es el primer reporte en Salvia divinorum.

Para el análisis filogenético se utilizaron 35 secuencias, 28 obtenidas del GenBank y siete de los aislamientos en el estudio. Entre las secuencias de los aislamientos con las secuencias comparadas se distinguen claros agrupamientos. Los códigos de cepas ITC2 e ITC9 se agruparon con las especies cuya familia corresponde a Botryosphaeriaceae y se caracterizan por presentar conidios y conidióforos en picnidios, son causantes de muerte descendente de ramas, cancros e incluso manchas foliares y pueden afectar diferentes órganos de la planta (Agrios, 1999).

Los códigos de las cepas ITC1, ITC3, ITC4, ITC6 e ITC7 se definieron como miembros de la familia Dematiaceae, cuyas características corresponden con hongos de color oscuro, causantes de manchas foliares, y los conidios y conidióforos los forman libres (Agrios, 1999). En el árbol filogenético se visualiza la relación de estos organismos (Figura 1).

Efectividad in vitro del extracto acuoso de B. flammea

Pérez et al. (2000) con un extracto acuoso de piñón amoroso (Gliricidia sepium) en concentraciones de 6, 10, 15 y 25 %, observaron una disminución de 91 % en el crecimiento micelial de Corynespora cassiicola con la concentración más alta. En el presente estudio, con el extracto acuoso de B. flammea hubo menor efectividad en el crecimiento micelial en C. cassiicola, B. setariae, L. parva y L. theobromae, por lo cual la selectividad del extracto funciona de acuerdo con la especie del hongo y la concentración de los compuestos involucrados con propiedades antifúngicas.

En las cepas que no mostraron sensibilidad al extracto acuoso de B. flammea, éste causó deformaciones en el micelio de L. parva y cambios en la coloración del crecimiento micelial en E. rostratum y C. cassiicola. De acuerdo con Sánchez et al. (2009), este efecto se puede manifestar desde un cambio en la forma, textura y color del micelio, y en el hongo Rosellinia bunodes sometido al extracto acuoso de hojas de Brugmansia aurea, ellos observaron deformaciones y deshidratación, un micelio débil, con menor densidad y diferencias de color, en comparación con el micelio observado en el tratamiento testigo.

Inhibición de la esporulación y la germinación de conidios

La esporulación y germinación de conidios se evaluaron en las cepas que esporularon en presencia del extracto acuoso de B. flammea. La esporulación se evaluó solo en cuatro cepas. La cepa más sensible fue C. verruculosus con 100 % de inhibición, mientras que la menos sensible fue C. cassiicola, en la cual el extracto fue ineficiente para evitar la formación de conidios y promovió su producción en relación con la cepa testigo sin extracto (Cuadro 3). Monoterpenos obtenidos de hojas de Sequoi sempervirens actuaron diferencialmente contra varias especies de hongos: algunas especies se inhibieron con dosis bajas, otras con dosis altas y otras se estimularon por algunos compuestos del extracto (Montes, 2009). El extracto acuoso de B. flammea al 3 % mostró mejor capacidad antifúngica en C. verruculosus comparado con los extractos acuosos de Artemisia camphorata y Cymbopogon citratus contra Alternaria solani, donde una concentración de 40 % inhibió al menos un 90 % en la esporulación, pero no tuvo efecto en el crecimiento micelial del hongo (Itakoet al., 2008). Además, el extracto acuoso de B. flammae al 3 %, superó la efectividad antifungica del extracto hecho con Azadirachta indica al 50 %, contra Curvularia lunata, Fusarium sp. y Sarocladium oryzae en los cuales redujo en 50 % la esporulación de los hongos (Cruz y Rivero, 2009). Los resultados obtenidos con B. flammae son promisiorios ya que con la concentración evaluada ejerció mejor acción antifúngica en algunos hongos.

La efectividad del extracto en la esporulación no se evaluó en algunas cepas porque no se obtuvieron conidios, aunque las cepas se cultivaron en medios específicos para esta variable. Esto confirmaría que para algunas especies se requieren técnicas y condiciones especiales para su esporulación in vitro (Carvalho et al., 2008).

En algunos casos la respuesta a los extractos es estimulatoria en la esporulación de los hongos, como ocurrió con C. cassiicola, lo cual es similar a lo observado por Montes y García (1997) con los extractos acuosos de Asclepias glauscecens, Citrus limón, Hibiscus rosasinensis y Ricinus comunis en Alternaria solani, donde el fitopatógeno se estimuló en la esporulación y además mejoró el porcentaje de germinación de conidios, lo cual puede favorecer su virulencia y suponer cierta selectividad del extracto. En hongos mitosporicos empleados para el control de insectos en condiciones oxidantes, se mejora la producción de esporas la cual está asociada con su capacidad infectiva (Miranda-Hernández et al., 2013). Esto sugiere que existen productos metabólicos, como los radicales libres producidos bajo condiciones de estrés, que regulan la diferenciación celular como la esporulación según el ambiente en el cual se desarrollan (Aguirre et al., 2005).

El extracto acuoso presentó una disminución significativa (p≤0.01) en la variable de germinación de conidios (Cuadro 3). En C. verruculosus no se observó germinación de conidios, lo cual hace al extracto 100 % efectivo, mientras que en E. rostratum causó la menor efectividad (73 %), comparado con la cepa testigo sin extracto. La capacidad de inhibir la germinación de esclerocios y conidios usando extractos acuosos también fue observada por Alcalá et al. (2005) al aplicar Ricinus communis, Azadirachta indica y Allium sativum contra Sclerotium rolfsii y Thielaviopsis basicola. Además, Singh (1980) y Barros et al. (1995) encontraron efectos inhibitorios de A. sativum sobre la germinación de conidios en Fusarium sp., Colletotrichum spp., Curvularia sp. y Alternaria sp. La acción de subproductos contra hongos filamentosos está asociada con la producción de compuestos de bajo peso molecular estructuralmente presentes durante las etapas de desarrollo de las plantas, o bien, se inducen durante la infección a partir de compuestos existentes como cumarinas, compuestos fenólicos, flavonoides, saponinas, quinonas, alcaloides, terpenoides fenilpropanoides, fitoalexinas tipo flavonoides, terpénicas y sesquiterpénicas (Grayer y Harbone, 1994, Montes, 2009). En otros estudios se detectó la presencia de la sakurososaponina a partir del extracto metanólico en raíz de B. flammae, la cual tuvo una actividad anifúngica contra Colletotricum gloeosporioides; este metabolito secundario forma una interacción no específica con los esteroles de la membrana celular, favorece la formación de poros en la membrana e induce la muerte celular (Sanchez et al., 2009; Cristóbal et al., 2013).

CONCLUSIONES

El extracto acuoso de Bonellia flammea mostró diferentes porcentajes de efectividad en el crecimiento micelial, en la esporulación y en la germinación de conidios según la especie del hongo, lo cual indicó una selectividad antifúngica.

La extracción de ADN en 57 % de las cepas de hongos se optimizó con las modificaciones implementadas en este estudio, lo cual permite la identificación molecular y su aplicación en especies donde se dificulte la extracción de ADN.

La identificación de Lasiodiplodia parva en Salvia divinorum contribuye al primer reporte de esta especie induciendo tizones foliares y muerte descendente en esta ornamental tropical.

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