Variación isoenzimática de Pinus pseudostrobus Lindl. a lo largo de un gradiente altitudinal en Michoacán, México
Pinus pseudostrobus Lindl. isoenzimatic variation along an altitudinal gradient in Michoacán, Mexico
Héctor Viveros-Viveros1, Blanca Ll. Tapia-Oivares2, Cuauhtémoc Sáenz-Romero2,3*
1 Instituto de Investigaciones Forestales, Universidad Veracruzana. Parque Ecológico "El Haya", Colonia Benito Juárez. 91070. Xalapa, Veracruz.
]]> 2 Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo (IIAF-UMSNH). Km 9.5 carretera Morelia—Zinapécuaro. 58880. Tarímbaro Michoacán, México.3 INRA, UMR 1202 BIOGECO, F-33610 Cestas, France & Univ. Bordeaux, UMR 1202 BIOGECO, F-33615 Pessac, France. * Autor responsable (csaenzromero@gmail.com).
Recibido: marzo, 2014.
Aprobado: agosto, 2014.
Resumen
Pinus pseudostrobus Lindl. es la especie de pino de mayor importancia económica en el estado de Michoacán. Para su conservación y manejo sustentable se debe conocer tanto la variación de caracteres cuantitativos con valor adaptativo como la diversidad genética mediante marcadores neutrales a la selección. En el presente estudio se investigó la variación genética isoenzimática entre poblaciones de P. pseudostrobus a lo largo de un gradiente altitudinal (de 2200 a 2910 m de altitud) en el estado de Michoacán, México. En enero del 2001 se recolectaron semillas de ocho localidades, separadas entre sí por 100 m de altitud; en cada población se seleccionaron al azar 9 a 11 árboles. En 12 de los 14 loci examinados se encontró polimorfismo. La heterocigosidad esperada promedio (He) fue 0.10. En todos los loci se encontró equilibrio de Hardy-Weinberg. La diferenciación genética entre poblaciones fue significativa (FST= 0.017), aunque fue baja. La distancia genética promedio fue baja (0.078) y el flujo génico promedio fue alto (Nm=14.5).Se encontró un débil patrón de variación genética asociado con la altitud de origen de las poblaciones, en el cual las poblaciones de menor altitud presentaron mayor número efectivo de alelos que las poblaciones de mayor altitud. Para conservar la diversidad genética se sugiere establecer tres Unidades de Conservación de Recursos Genéticos Forestales (UCRGF), una por cada uno de los siguientes intervalos altitudinales, con el tamaño mínimo de población efectiva viable (Ne) siguiente: entre 2100 y 2400 m con 3422 individuos en edad reproductiva, entre 2400 y 2700 m con 1586 individuos, y entre 2700 y 3000 m con 2321 individuos.
Palabras clave: Pinus pseudostrobus, variación genética altitudinal, conservación de recursos genéticos forestales, flujo génico, isoenzimas.
]]> Abstract
Pinus pseudostrobus Lindl. is the pine species of major economic importance in the state of Michoacán. For its conservation and sustainable management both the variation of quantitative traits with adaptive value as well as the genetic diversity through markers neutral to selection should be known. In the present study the genetic isoenzymatic variation among populations of P. pseudostrobus along an altitudinal gradient (2200-2910 m of altitude) in the state of Michoacan, Mexico was investigated. In January 2001, seeds from eight locations, separated by 100 m altitude were collected; in each population from 9 to11 trees were randomly selected. Polymorphism was found in 12 of the 14 loci examined. The expected average heterozygosity (He) was 0.10. In all loci Hardy-Weinberg equilibrium was found. Genetic differentiation among populations was significant (FST= 0.017), although it was low. Average genetic distance (0.078) was low, and average gene flow was high (Nm=14.5). It was found a weak pattern of genetic variation associated with altitude of origin of populations, in which lower altitude populations presented a greater effective number of alleles than higher altitude populations. To preserve genetic diversity it is suggested to establish three Forest Genetic Resource Conservation Units (FGRCU), one for each of the following altitudinal ranges, with the minimum size of a viable effective population (Ne) as follows: between 2100 and 2400 m with 3422 individuals in reproductive age, between 2400 and 2700 m with 1586 individuals, and 2700 and 3000 m with 2321 individuals.
Key words: Pinus psedostrobus, altitudinal genetic variation, forest genetic resource conservation, gene flow, isoenzymes.
INTRODUCCIÓN
Las poblaciones de especies con distribución a lo largo de gradientes altitudinales tienden a diferenciarse genéticamente en caracteres cuantitativos, como el patrón de elongación de la yema, el crecimiento en altura y diámetro, la resistencia a sequía y heladas, en respuesta a diferentes intensidades de selección impuestas por el ambiente (Sáenz-Romero et al., 2012). Pero en la mayoría de los casos se debe conocer la diversidad genética revelada con marcadores moleculares (neutrales o casi neutrales a la selección), para identificar el estado que presentan las poblaciones en relación a la diversidad genética entre y dentro de las poblaciones (Lynch et al., 1999), así como las evidencias de eventos previos (cuellos de botella, deriva génica y endogamia), y en caso necesario, establecer programas de conservación (Nelson, 2005). Según Ohsawa e Ide (2008), la variabilidad genética de caracteres neutrales en poblaciones de especies forestales presenta patrones muy diversos en relación con los gradientes altitudinales.
Los objetivos de este estudio fueron: 1) cuantificar la diversidad genética en poblaciones de Pinus pseudostrobus distribuidas en un gradiente altitudinal en el estado de Michoacán; 2) determinar la asociación entre los parámetros de diversidad genética y la ubicación de las poblaciones; y 3) estimar el tamaño de población genéticamente viable necesario para establecer Unidades de Conservación de Recursos Genéticos Forestales (UCRGF).
MATERIALES Y MÉTODOS
Material genético
]]> La semilla de polinización libre de P. pseudostrobus se recolectó en ocho poblaciones en un gradiente altitudinal, a lo largo de un solo transecto, desde 2200 (Paraje Joya del Durazno, 19° 27.8' N, 102° 08.9' O) a 2910 msnm (Cerro de Pario, 19° 28.4' N, 102° 11.0' O), en los bosques de la comunidad indígena de Nuevo San Juan Parangaricutiro, Michoacán, México. Cada población se ubicó aproximadamente a 100 m de diferencia altitudinal, con una distancia geográfica promedio entre sitios contiguos de 0.6 km. La población fue un grupo de individuos en una condición de rodal relativamente homogénea; esta categoría se podría considerar por algunos investigadores como subpoblación. En cada población se seleccionaron al azar de 9 a 11 árboles, separados al menos entre 30 y 50 m para disminuir la posibilidad de parentesco. Lo ideal sería incluir más de 20 individuos, pero el número de individuos incluidos por población está dentro del rango de tamaño de muestra por población utilizado en otros estudios con marcadores moleculares en árboles forestales: en Pinus sylvestris 10 a 22 individuos por población (Waldmann et al. 2005), en Pinus oocarpa 8 a 13 (Sáenz-Romero y Tapia-Olivares 2003), en Cedrela odorata 5 a 22 (Navarro et al. 2005), y en un estudio de encinos europeos 4.7 individuos (Petit et al., 2002a; 2002b).
Electroforesis de isoenzimas
El análisis fue electroforesis de isoenzimas en geles de almidón y se evaluaron 14 loci; en ocho loci (ACP, G6P, MDH-1, MDH-2, PGI-1, PGI-2, 6PG-1 y 6PG-2) se usó la metodología de Yamada y Guries (1989), y en seis (GOT-1, GOT-2, LAP-1, LAP-2, PGM y SKD) la de Soltis et al. (1983). La interpretación de los patrones de bandeo se realizó usando como referencia la migración de muestras de Pinus resinosa Aiton, una especie monomórfica (Fowler y Morris, 1977). Las muestras de P. pseudostrobus consistieron en seis megagametofitos por cada individuo; con ese tamaño de muestra, la probabilidad de error de una identificación de heterocigotos como homocigotos es 0.03 (Conkle, 1981).
Análisis estadístico
Las frecuencias alélicas, la heterocigosidad observada y esperada, los alelos raros (alelos con frecuencia <0.05), los alelos privados, la proporción de loci polimórficos (criterio frecuencia del alelo más común ≤0.99) y las diferencias significativas entre la heterocigosidad observada y esperada, se estimaron usando Tools For Population Genetic Analysis (TFPGA) (Miller, 1997). El número promedio de alelos por locus, y el número efectivo de alelos se obtuvieron mediante el programa POPGENE versión 1.31 (Yeh et al., 1999). Se estimó la endogamia total (FIT), la proporción de la diversidad genética total entre poblaciones (FST) y la endogamia dentro de poblaciones (FIS). Los intervalos de confianza al 90 % para los estadísticos de F de Wright se calcularon por la técnica de muestreo con reemplazo (bootstrappig) sobre los loci con 10 000 repeticiones (Miller, 1997). Con el intervalo de confianza para FST se determinó la existencia de diferenciación genética significativa entre poblaciones. El flujo génico se estimó como el número de migrantes por generación (Nm), mediante la fórmula siguiente (Slatkin, 1987):
Nm =((1/ FST) —1)/4 (1)
Para conocer el patrón de diferenciación genética entre poblaciones se estimaron las distancias genéticas entre pares de localidades mediante la distancia modificada de Rogers (Miller, 1997). La frecuencia de alelos entre pares de poblaciones se comparó con la prueba de probabilidad combinada de Fisher (Miller, 1997). El tamaño efectivo de población genéticamente viable se calculó desde el valor estimado de heterocigosidad esperada, usando una fórmula de regresión obtenida al ajustar un modelo de regresión lineal entre valores de tamaño efectivo de población viable (Ne) y valores de heterocigosidad esperada (He) que se desea mantener, considerando una tasa de mutación de 1X10 -5, a partir de datos de Millar y Libby (1991) para especies de coníferas, con base en una ecuación de Crow y Kimura (1972) y la fórmula fue:
Ne =-984.58 + (36723 He) (2)
]]> El grado de asociación de los parámetros de diversidad genética respecto a la elevación (metros sobre el nivel del mar) de las localidades se evaluó usando los procedimientos CORR y REG (SAS Institute, 1988). La correlación entre las distancias genéticas y las distancias geográficas se estimó mediante la prueba de Mantel (Miller, 1997).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Frecuencias génicas
En 14 loci muestreados se registraron 33 alelos, de los cuales 14 fueron comunes a todas las poblaciones y dos fueron privados (alelos menos frecuentes de los loci PGI-1; alelo dos) para la población de 2700 msnm y de PGI-2 (alelo tres; para la de 2400 msnm). No se encontraron alelos raros (alelos con frecuencia <0.05). La cantidad de alelos raros y privados encontrados en P. pseudostrobus fueron menos que los encontrados en poblaciones de Pinus hartwegii Lindl. ubicadas también a lo largo de un transecto altitudinal (cinco alelos privados y 20 raros) (Viveros-Viveros et al., 2010). Lo anterior probablemente se debe a que en las poblaciones de P. pseudostrobus existe mayor intercambio génico que en las de P. hartwegii (flujo génico de 14.5 vs. 2.0). El mayor número de alelos por locus fue de tres y se presentó en siete de los 14 loci evaluados: ACP, GOT-2, MDH-1, PGM, PGI-2, SKD y 6PG-1.
Diversidad genética dentro de poblaciones
El número de alelos por locus a nivel de todas las poblaciones fue similar al reportado en Pinus oocarpa Lindl. (2.4) (Sáenz-Romero y Tapia- Olivares, 2003) y muy cercano al reportado en P. hartwegii (2.5) (Viveros-Viveros et al., 2010).
El análisis conjunto de todas las poblaciones de P. pseudostrobus mostró que 12 loci fueron polimórficos (85.7 %) y dos loci fueron monomórficos (LAP-2, y 6PG-2); de usarse el criterio ≤0.99, también PGI-1 sería monomórfico y los loci polimórficos serían 78.6 %, pero el promedio de loci polimórficos fue 51.8 % (Cuadro 1). Estos valores son similares a los reportados para Pinus pungens Lamb.: 76.2 % de loci polimórficos en análisis conjunto y 58.3 % promediando 19 poblaciones (Gibson y Hamrick, 1991); y para Pinus echinata Mill.: 90.7 % de loci polimórficos en análisis conjunto y 52.8 % promediando 18 poblaciones (Edwards y Hamrick, 1995).
La heterocigosidad esperada fue ligeramente mayor en las poblaciones de menor altitud (de 2200 y 2490 m), excepto en la población de 2400 m, que las demás poblaciones (Cuadro 1). La heterocigosidad esperada promedio fue similar a la hetercigosidad esperada para el análisis conjunto de todas las poblaciones (0.10) y similar a la encontrada en P. oocarpa (Sáenz-Romero y Tapia-Olivares, 2003); pero menor a la de otras especies de pinos con distribución en gradientes altitudinales: 0.12 en P. hartwegii (Viveros-Viveros et al., 2010) y de 0.295 a 0.299 en Pinus sylvestris L. (Puglisi et al., 1999). La heterocigosidad observada promedio fue similar a la heterocigosidad esperada promedio (0.10). Estos valores están dentro del rango reportado para especies de pino (Ledig, 2000). La prueba de equilibrio de Hardy-Weinberg no mostró diferencias significativas entra la heterocigosidad observada y la esperada para los 14 loci en el análisis conjunto y en el de cada una de las ocho poblaciones. Lo anterior sugiere que todos los loci estudiados están en equilibrio de Hardy-Weinberg.
]]> En el estudio de la diversidad genética de especies entre poblaciones se usó el índice Shannon, y éste varió de 0.12 (población de 2600 msnm) a 0.22 (población de 2490 msnm), con un promedio de 0.17 para las ocho poblaciones; para el análisis conjunto de las poblaciones fue 0.21 (Cuadro 1). El valor promedio fue menor al encontrado en Pinus brutia Ten. (0.34) (Kandemir et al., 2004), y para el conjunto de poblaciones fue menor al reportado en otras especies arbóreas, por ejemplo, 0.50 en Pinus albicualis Engelm. (Mahalovich e Hipkins, 2011).
Estructura de la diversidad genética
El valor medio del coeficiente de endogamia (FIS) no fue significativamente diferente de cero (el intervalo de confianza incluye al cero, Cuadro 2). La no significancia de FIS sugiere que los loci están en equilibrio de Hardy-Weinberg. En forma contraria, el valor estimado promedio de FIT, fue significativamente diferente de cero (Cuadro 2). El valor de Fit indica que a nivel global (análisis conjunto de todas las poblaciones) hay indicios de exogamia o bien un ligero exceso de heterocigotos (Schmidtling et al., 1999), probablemente debido a la combinación de un intenso flujo génico entre poblaciones y selección natural de embriones heterocigóticos.
La diferenciación genética entre poblaciones fue significativamente diferente de cero (Cuadro 2). El valor de FST indica que solo una pequeña proporción (1.7 % en promedio) del total de la variación isoenzimática se atribuyó a diferencias entre poblaciones, mientras que 98.3 % se puede atribuir a diferencias dentro de poblaciones. Valores de FST menores a 0.050 representan niveles bajos de diferenciación genética (Yeh, 2000). El valor de FST fue mayor al de P. oocarpa en un gradiente altitudinal (FST = 0.001) (Sáenz-Romero y Tapia-Olivares, 2003), pero en P. hartwegii el valor de diferenciación genética entre poblaciones fue mayor (FST=0.111) (Viveros-Viveros et al., 2010). Lo anterior indica que el flujo génico elevado que presentó P. pseudostrobus con respecto a P. hartwegii, disminuye la diferenciación entre poblaciones.
Los valores del número de migrantes por generación (Cuadro 2) tienen un promedio de 14.5, lo cual fue mayor al reportado en P. hartwegii (Viveros-Viveros et al., 2010). Pero según Ledig et al. (1997), los valores de Nm en coniferas pueden variar de 1.8 a 27.5, aunque en la mayoría de los casos los valores van de 4.6 a 17.2 (Ledig, 2000), rango en el que se ubica P. pseudostrobus.
Distancias genéticas
]]> La distancia genética (modificación de la distancia de Roger) promedio fue 0.078, un valor que indica poca diferenciación genética (Bakshi y Konnert, 2011) y coincide con los valores bajos de FST . Sin embargo, las distancias fueron muy variables, desde 0.055 (entre las poblaciones de 2400 y 2600 m), hasta 0.117 (entre las poblaciones de 2200 y 2290 m), una diferenciación importante según Konnert (1995). La distancia genética promedio fue mayor a la encontrada en P. oocarpa en un gradiente altitudinal (0.0054; Sáenz-Romero y Tapia-Olivares, 2003), pero menor al encontrado en P. hartwegii (0.108; Viveros-Viveros et al., 2010). La prueba de Mantel indica que no hubo asociación significativa entre las distancias altitudinales y las genéticas (r=—0.044; p = 0.5910) de las poblaciones. Por lo tanto, no hubo un efecto de aislamiento genético por la distancia entre ellas.
Asociación entre variación genética y altitud de la población
La mayoría de los parámetros de diversidad genética no mostraron una correlación con la altitud. Sin embargo, sí hubo asociación negativa significativa entre el número efectivo de alelos y la altitud de origen de las poblaciones; es decir, las poblaciones de menor altitud presentaron mayor número efectivo de alelos que las poblaciones de mayor altitud (Figura 1). Este patrón altitudinal coincide con el 19 % de los casos analizados por Ohsawa e Ide (2008). Este patrón puede originarse por una de las siguientes razones o por combinación de las mismas: 1) la especie comenzó a ampliar su distribución altitudinal a partir de las poblaciones de menor elevación, por lo cual tienen más antigüedad que las de mayor elevación, lo cual permite ampliar su diversidad genética (Austerlitz et al., 2001); 2) la selección natural favorce la presencia de un número mayor de alelos como un mecanismo de adaptación a ambientes más desfavorables (ambientes menos húmedos) o muy particulares (Kawecki, 2000); 3) las poblaciones de elevación mayor se originaron de un número reducido de individuos ocasionado por un cuello de botella durante la expansión altitudinal de la especie, con lo cual se redujo la diversidad genética de la mismas (Newton et al., 1999).
Implicaciones para la conservación de las poblaciones
Para implementar el uso de la zonificación altitudinal propuesta (con base a la variación de caracteres cuantitativos) por Sáenz-Romero et al. (2012) para esta especie y en la región de Nuevo San Juan Parangaricutiro, Michoacán, sería útil contribuir a conservar el patrón actual de distribución de la variabilidad genética entre y dentro de poblaciones para caracteres neutrales o casi neutrales a la selección, mediante el establecimiento de tres UCRGF, una por cada zona altitudinal y cada una con un tamaño de población genéticamente viable estimado con la fórmula (2), aprovechando que se cuenta con estimaciones de FST (Cuadro 2). Esto lleva a sugerir una UCRGF entre 2100 y 2400 m con un tamaño efectivo de población (Ne) de 3422 individuos, otra entre 2400 y 2700 m con un Ne de 1586 individuos, y otra entre 2700 y 3000 m con un Ne de 2321 árboles.
]]> CONCLUSIONES
Pinus pseudostrobus mostró una ligera pero significativa diferenciación genética entre poblaciones. Hubo un débil patrón de variación genética asociado con la altitud de origen de las poblaciones, en el que las poblaciones de menor altitud presentaron mayor número efectivo de alelos que las poblaciones de mayor altitud; pero otros parámetros de diversidad genética (como heterozigosidad) no presentaron una asociación significativa con la altitud. Para usar una zonificación altitudinal para recolección y movimiento de semillas, se propone establecer tres UCRGF: una entre 2100 y 2400 m, otra entre 2400 y 2700 m, y una tercera entre 2700 y 3000 m, con un tamaño mínimo de población de 3422, 1586 y 2321.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece el financiamiento del Fondo Sectorial CONACyT-CONAFOR (proyecto 2002- C01-4655) para la colecta de semillas, y de la Coordinación de la Investigación Científica de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo (5.1) y la beca CONACyT por año sabático a CSR (232838). Se agradece a Reyes Aguilar, Manuel Echeverría, Rafael Echeverría, Luis Toral, Felipe Aguilar y otras personas de la Dirección Técnica Forestal de la Comunidad Indígena de Nuevo San Juan Parangaricutiro, Michoacán, y a Ernesto Moreno, Daniel Saldívar, Víctor Quiñónez y otras personas de la Comisión Forestal de Michoacán, por su ayuda en la colecta de semillas. Tres revisores anónimos ayudaron a mejorar significativamente el manuscrito.
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