Detección del Prunus necrotic ringspot virus en durazno (Prunus persica (L.) en México y caracterización molecular de su componente ARN-3

Detection of Prunus necrotic ringspot virus from peach (Prunus persica (L.) in Mexico and molecular characterization of its RNA-3 component

Rodolfo De La Torre-Almaraz^1*: , Jesús Sánchez-Navarro², Vicente Pallás²

¹ Laboratorio de Microbiología, Unidad de Biotecnología y Prototipos, FES-IZTACALA, UNAM. Avenida de los Barrios No. 1. 04090. Los Reyes, Iztacala, Tlalnepantla, Estado de México. * Autor responsable (drodolfo@servidor.unam.mx).

Recibido: julio, 2013.
Aprobado: agosto, 2014.

Resumen

Durante recorridos realizados de 2008 a 2012 en huertas comerciales de durazno en el Estado de México, estados de Morelos y Puebla, se observaron daños foliares de moteado amarillo, anillos cloróticos, patrones lineales y mosaico. Se transmitió mecánicamente un virus de macerados de hojas de durazno con daños de moteado amarillo, a plántulas de varias especies de tabaco causando manchas blanquecinas. En diagnósticos serológicos (DAS-ELISA) y de hibridación tipo dot-bot, utilizando ribosondas marcadas con digoxigenina, para la detección de seis virus que infectan al durazno, se detectó sólo al virus Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV. Ilarvirus) en las muestras recolectadas con síntomas. El análisis electroforético de ARN-dc de origen viral, obtenido de follaje con síntomas, mostró tres bandas de 3.6, 2.5 y 1.8 Kpb de peso molecular, correspondientes al genoma del PNRSV. En todas las localidades se verificaron infecciones por PNRSV en plantas de durazno por secuenciación directa de productos de la RT-PCR, utilizando como moldes extractos de ARN-dc viral y oligonucleótidos específicos que amplifican un fragmento del gen de la proteína de la cápside de 455 pb de este virus. La identidad del PNRSV se confirmó mediante la clonación y determinación de la estructura primaria del ARN-3 del virus, que contiene los marcos de lectura abierta correspondientes a la proteína de movimiento (MP) y de la cápside (CP). La comparación de la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondientes al ARN-3 del PNRSV, con secuencias disponibles en la base de datos, mostró una identidad del 98 % y 100 %, respectivamente. Análisis filogenéticos agruparon los tres aislados caracterizados dentro de los grupos PE5-III y PV32-I. En conjunto, los datos presentados indican que las variantes de PNRSV caracterizadas en México, no difieren del resto de aislados previamente conocidos, señalando un probable origen común.

Palabras clave: Moteado amarillo, Ilarvirus, RT-PCR, diagnóstico.

Abstract

Key words: Yellow mottle, Ilarvirus, RT-PCR, diagnosis.

INTRODUCCIÓN

Desde 2005 se ha observado la presencia, incremento y distribución de daños foliares en plantas de durazno en diferentes localidades de el Estado de México, estados de Morelos y Puebla. Estos daños se caracterizan por moteados y mosaico de color amarillo en las hojas (Figura 1 A y B). Los moteados al crecer forman mosaicos y patrones lineales (Figura 1 C) o anillos irregulares (Figura 1 D). Los tejidos dañados se desprenden dejando perforaciones irregulares con márgenes necróticos. El follaje de las plantas afectadas adquiere una tonalidad amarillenta o clorosis y causa una defoliación severa. Los frutos pueden presentar manchas tenues anilladas de color rojizo y redución del tamaño y color del fruto, así como un retraso en su madurez (observación personal del primer autor).

La causa de esos daños se desconoce y la revisión en el laboratorio con un microscopio estereoscópico del material vegetativo con síntomas recolectado en campo, no mostró la presencia de hongos, bacterias u otro tipo de organismo, por lo que se concluyó que estos pudieran ser causados por alguno de los múltiples virus y viroides que infectan al durazno en todo el mundo y que causan varios de los síntomas descritos (Cambra et al., 2008). Por tanto, los objetivos de la presente contribución fueron la caracterización biológica y molecular de virus y viroides en durazno cultivado en el Estado de México, estados de Morelos y Puebla.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cien muestras (10 en cada localidad) de flores, hojas y ramas jóvenes de durazno, todas con síntomas de moteado amarillo, se recolectaron en huertas comerciales ubicadas en Coyutla de Benitez y Texcoco en el Estado de México; Ocuituco, Tétela del Volcán y San Miguel Tlacotepec ubicadas en el estado de Morelos; Domingo Arenas, Tepetzala, Tepetlaxco, San Pedro Coronango y San Martín Texmelucan en el estado de Puebla. Las zonas destacan por la superficie sembrada, volumen y calidad de la producción. Las muestras fueron recolectadas en agosto de cada año, desde 2008 a 2012, previo a la cosecha y con la máxima severidad de daños. Las temperaturas promedio en estas zonas durante el verano varían de 24 a 28 °C máximo y mínimas de 11 a 15 °C y días lluviosos.

Transmisión mecánica de virus a plantas indicadoras

Para determinar la presencia de virus en las muestras de durazno se realizaron pruebas de transmisión mecánica a plantas indicadoras, macerando 1 g de corteza de ramas y hojas jóvenes en 10 mL de solución amortiguadora (NaPO₄ 0.02 M, pH 7-DIECA) de cuatro muestras de la huerta Las Dalias, en San Pedro Coronango, Puebla, que mostraron la mayor severidad de síntomas de moteado amarillo. El macerado de cada muestra fue frotado, en forma independiente, en hojas de plántulas sanas de 11 especies indicadoras, previamente espolvoreadas con carborundum, usando un hisopo de algodón. Las hojas inoculadas fueron lavadas con agua para eliminar residuos del macerado y del carborundum. Las plantas inoculadas se mantuvieron en invernadero entre 25 y 35 °C, 70 % HR y 12 h luz/oscuridad esto hasta la aparición de síntomas. Las plántulas de las especies indicadoras inoculadas fueron tabaco (Nicotiana glutinosa, N. rustica, N. clevelandii, N. debneyii y N. tabacum var Xanthi), toloache (Datura stramonium), quelites (Chenopodium amaranticolor y Ch. quinoa), gonfrena (Gomphrena globosa), chile (Capsicum annuum L.) y tomate (Solanum esculentum M.). La transmisión de virus se repitió tres veces, usando en cada ocasión muestras nuevas con síntomas de la misma parcela. Macerados de hojas de las plantas que mostraron síntomas se usaron para retransmitir virus, inoculando tres series de plántulas indicadoras sanas y conservadas en el invernadero bajo las mismas condiciones, hasta la aparición de síntomas (Dijkstra y De Jager, 1998).

Detección de proteína viral por serología (DAS-ELISA)

La detección de proteína viral se realizó con macerados de corteza de ramas y hojas jóvenes (1 g 10 mL ^-1 de amortiguador de extracción) de las 100 muestras recolectadas de todas las localidades, utilizando la técnica de inmunoadsorción enzimática en fase sólida de doble sándwich (DAS-ELISA), para desarrollarse en 2 d con antisueros policlonales comerciales específicos y siguiendo las intrucciones del fabricante (Agdia, Inc., Elkhart, IN) para Apple mosaic virus (ApMV Bromoviridae), Prunus dwarf virus (PDV Bromoviridae), Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV Bromoviridae), Plum plox virus (PPV Potyviridae) y Strawberry leaf ringspot virus (SLRSV. Sadwavirus), algunos de los virus más comunes que afectan al durazno en el mundo (Brunt et al., 1996). Las reacciones fueron consideradas positivas por observación visual directa de la intensidad en el cambio de color amarillo de los pocillos y por comparación con los testigos positivos incluidos en las mismas placas. No se utilizó ningún lector de absorbancia (Clark y Adams, 1977).

Análisis de ARN de doble cadena (ARN-dc) de origen viral

Para determinar la presencia de virus y sus componentes genómicos se realizó la extracción y análisis del ARN-dc viral de hojas de durazno de 10 muestras con síntomas de moteado amarillo y positivas para alguno de los antisueros probados. El ARN-dc se analizó por electroforesis en geles de poliacrilamida al 6 %, usando un mini gel (1.75 mmX7 cmX8 cm) montado en una cámara Biorad doble. El volumen del extracto de ARN-dc viral de las muestras fue 30 μL por carril y 20 μL de solución amortiguadora de carga. Las condiciones de electroforesis fueron 100 V por 2:30 h a temperatura ambiente. Los geles fueron teñidos con solución de bromuro de etidio y después con solución de nitrato de plata 0.011 M (Valverde et al., 1990).

Hibridación molecular no radiactiva con ribosondas marcadas con digoxigenina

Para detectar infecciones por virus o viroides comunes en durazno, se realizaron pruebas de hibridación molecular del tipo dot-blot no radiactivo, con 10 muestras con síntomas de moteado amarillo y positivas para alguna de las pruebas serológicas, utilizando ribosondas marcadas con digoxigenina (Roche), específicas para la detección de los virus o viroides de durazno: Plum bark necrosis stem pitting-associated virus (PBNSPaV. Closteroviridae), APLPV (American plum line pattern virus. Bromoviridae), PPV (Plum pox virus. Potyviridae), PNRSV (Prunus necrotic ringspot virus. Bromoviridae), HSVd (Hop stunt viroid. Pospiviroidae) y PLMVd (Peach latent mosaic viroid. Asunviroidae) (Herranz et al., 2005).

Para la prueba dot-blot se desnaturalizaron 10 μL ARN-dc, por muestra, en mezcla con 6 μL de amortiguador SSC (20x) y 4 μL de formaldehido (37 %) por 10 min a 65 °C. Se transfirieron 2 μL de la mezcla ya fría a cuadros de 1X1 cm marcados en membranas de Hybond Nylon (+) y como testigos positivos se adicionaron 0.5 μL de producto clonado del virus o viroide por detectar, fijando los ácidos nucleicos con luz ultravioleta por 3 min. Las membranas, una para cada virus o viroide, fueron pre-hibridadas e hibridadas a 68 °C usando la ribosonda Dig-UTP-T7. La reacción de hibridación se detectó por autorradiografía, utilizando películas X Ray (Kodak, USA) (Pallás et al., 1998).

Detección de virus por pruebas de transcripción reversa ligada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) punto final

Para verificar la presencia e identidad de los virus o viroides comunes que infectan al durazno, se realizaron pruebas de RT-PCR (siglas en inglés) punto final en cuatro muestras por localidad, en un solo paso (Super Scrip III One Step High-Fidelity, Invitro Gene, USA), usando como templado el ARN-dc obtenido de plantas con los daños de moteado amarillo en durazno. Los oligonucleótidos y condiciones de reacción específicos usados fueron para los virus PNRSV, PBNSPaV, APLPV, PPV, ACLSV (Apple chlorotic leaf spot virus), ApMV (Apple mosaic virus. Bromoviridae), PDV (Prunus Dwarf virus), PMV (Peach Mosaic Virus), TRSV (Tomato ringspot virus. Secoviridae), CMLV (Cherry mottle leaf virus. Betaflexiviridae ), HSVd (Hop stunt viroid.) y PLMVd (Peach latent mosaic viroid) (Mackenzie et al., 1997; Delano y Upton, 1999; Sánchez-Navarro et al., 2005).

Los productos de la RT-PCR fueron analizados por electro-foresis en geles de agarosa al 1 %, en solución amortiguadora TBE 1x. Las condiciones de electroforesis fueron a 100 V por 20 min a temperatura de laboratorio. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio al 0.5 % y su peso molecular se calculó por comparación con el marcador de peso molecular 1 Kb plus (Invitro Gene) incluido en el mismo gel. Las muestras positivas se seleccionaron para futuras pruebas de confirmación de la identidad de los virus detectados.

Secuenciación nucleotídica directa de productos de la RT-PCR de un fragmento de la proteína de la cápside de PNRSV

Los productos de la RT-PCR del tamaño esperado fueron purificados del gel de agarosa (Wizar PCR, Promega, USA) y analizados directamente en un secuenciador Applied Biosystem 3100 Genetic Analyzer. Las secuencias nucleotídicas obtenidas se alinearon y compararon para su identificación con secuencias disponibles en la base de datos del GenBank, utilizando el método Clustal W (DNA Star software, Madison, WI) y se depositaron en el GenBank para obtener su número de acceso (NCBI, 2012).

Caracterización del componente viral RNA-3 del PNRSV por clonación y secuenciación nucleotídica

Con el fin de confirmar la identidad del PNRSV se clonó y secuenció el componente ARN-3 completo de tres muestras, utilizando los productos de la RT-PCR obtenidos con la mezcla de los oligonucleótidos en sentido positivo (s) VP 970s 5'-CAC AAA GCT TGT TTT TAT ATG CCA GAA ATC GTA AC-3', VP 969s (5'-CAC AAA GCT TGT TGT TTT TAC CAA AAT GAA ATC GTA AC-3'), VP 968s 5'-CAC AAA GCT TGT TTT TAC AAT CGA AAT CGT AAC-3') y con el oligonucleótido en antisentido (as) VP 313as 5-CAC ACT GCA GCT TCC CTA ACG GGG C-3', que permiten la amplificación completa del ARN-3. Los oligonucleótidos VP968, VP969 y VP970, se diseñaron para cubrir las variantes de secuencia observadas en el extremo 5' terminal del ARN-3.

Los productos de la RT-PCR de 1800 pb fueron purificados del gel de agarosa (Wizar PCR, Promega, USA), clonados en el vector pTZ57R (InsT/Aclone PCR, Fermentas) y secuenciados, en ambas direcciones, en un equipo Applied Biosystem 3100 Genetic Analyzer. Las secuencias nucleotídicas obtenidas se ensamblaron, reconstruyendo el componente ARN-3 completo. Las secuencias del ARN-3 del PNRSV de las diferentes muestras, se utilizaron para su alineamiento y comparación con secuencias similares de PNRSV disponibles en la base de datos del GenBank, utilizando el método Clustal W ver. 2.1 y para construir los dendrogramas respectivos (DNA Star software, Madison, WI). Las secuencias consenso del PNRSV de cada muestra fueron depositadas en el GenBank para obtener su número de acceso.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Transmisión mecánica de virus a plantas indicadoras

Se logró transmitir un virus de los macerados de hojas de durazno con síntomas de moteado amarillo a varias plantas indicadoras. El virus relacionado con el moteado amarillo del durazno causó grandes manchas irregulares blanquecinas en las hojas inoculadas sólo en las especies de tabaco (Nicotiana tabacum var Xanthi, N. clevelandii, N. benthamiana y N. debneyii). En las plantas de chile y tomate, inoculadas con extractos de hojas de durazno con síntomas, se observaron manchas irregulares blanquecinas en las hojas inoculadas. Esto sugiere que no hay movimiento sistémico del virus. En las hojas inoculadas de Gomphrena globosa se observaron pequeñas lesiones locales necróticas, sin movimiento sistémico. En las demás plantas indicadoras no hubo síntomas o daños. El virus transmitido mecánicamente de hojas de durazno, con síntomas de moteado amarillo, tuvo un reducido rango de hospedantes y los síntomas observados desaparecieron rápidamente, por lo que fue difícil incrementar el virus para realizar pruebas biológicas adicionales, como pruebas de patogenicidad (postulados de Koch) o para su purificación o para su observación con el microscopio electrónico. No se realizaron pruebas de transmisión por injerto, ya que las plantas (portainjertos) producidas desde semillas en viveros comerciales, son injertadas con ramas de plantas con síntomas de mosaico amarillo, que impidió garantizar que las posibles plantas estuvieran libre de virus para realizar estas pruebas. Por tanto, es necesario considerar en futuras investigaciones otras plantas indicadoras, que permitan una infección sistémica y obtener purificaciones del virus que infecta al durazno en México (Salem et al., 2004).

Detección de proteína viral por serología (DAS-ELISA)

Solamente Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) fue detectado por serología en el 80 % de las muestras recolectadas de durazno de todas las localidades del Estado de México, estados de Morelos y Puebla. La detección de PNRSV por DAS-ELISA sólo fue posible cuando se usaron los tejidos de brotes jóvenes de corteza de ramas y hojas. Los resultados de DAS-ELI-SA fueron negativos cuando se usaron flores, sépalos o pétalos completos y partes maduras de hojas y ramas. Fue común observar que los macerados de estructuras florales eran demasiado viscosos, lo cual probablemente afectó la detección serológica del virus. Una alternativa para la detección de este virus sería usar polen (Cole et al., 1982), semillas o plántulas, cuando estén disponibles, en los cuales se ha mostrado que el PNRSV está presente, lo que explica la dispersión y su amplia distribución geográfica (Mink y Aichele, 1984; Yuyemoto et al., 2003; Pallás et al., 2012). Además, es probable que la distribución diferencial del virus en los tejidos de la planta, altere la concentración de la proteína de la cápside en los tejidos utilizados, reduciendo la eficiencia de las pruebas de detección serológica. El PNRSV tiene diferente distribución en la planta según su estado fenológico, correlacionado con las condiciones ambientales (Dal Zotto et al., 1999; Matic et al., 2008), principalmente por las temperaturas durante el año, aspecto que se debe verificar en las localidades del Estado de México, estados de Puebla y Morelos, ya que las muestras usadas en el presente estudio fueron recolectadas en agosto, en plena madurez de frutos y previo a la cosecha.

Es necesario considerar que el 20 % de las muestras negativas para la presencia del PNRSV, mostraron moteado amarillo por lo cual es factible que el material recolectado se encuentre infectado por virus o viroides desconocidos, aún no descritos en México, comunes en durazno en otras regiones del mundo (Brunt et al., 1996).

Análisis de ARN de doble cadena (ARN-dc) de origen viral

El análisis electroforético en geles de poliacrilamida de ARN-dc de origen viral obtenido por columnas de celulosa, mostró consistentemente la presencia de tres bandas de 3.6, 2.5 y 1.8 Kpb de peso molecular (Figura 2 carriles A y D), similares a los patrones electroforéticos del PNRSV (Fulton, 1985). Este tipo de bandas fueron visibles en algunas muestras y en otras fueron muy tenues o no se observaron a pesar de mostrar síntomas claros del moteado amarillo (Figura 2 carril C). En otras se observaron bandas de ARN-dc adicionales que indicaron la posible presencia de otros virus en mezcla con el PNRSV (Figura 2. carril B). El diagnóstico por análisis electroforético de virus del tipo ARN, como el PNRSV, permite confirmar con cierto grado de certeza infecciones virales simples o en mezcla; aunque una concentración viral baja en los tejidos de la planta reduce significativamente la eficiencia de esta técnica, subestimando la incidencia de un virus en particular, por tanto es necesario considerar técnicas adicionales de diagnóstico al análisis electroforético de ARN-dc (Valverde et al., 1999).

En las muestras analizadas se obtuvieron marcas de hibridación correspondientes al PNRSV y en algunas se detectaron marcas débiles y no concluyentes para PBNSVaV y PLMVd (datos no mostrados). Al considerar el número de virus que afectan al durazno en el mundo es muy probable que en los materiales mexicanos existan otros virus o incluso viroides, que no fue posible de confirmar con esta técnica. Sin embargo, es necesario continuar con la detección de virus en durazno en diferentes épocas del año y con un mayor número de muestras, y usando diferentes tipos de tejidos o técnicas alternativas que permitan una mejor detección.

Detección de virus por pruebas de transcripción inversa ligada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) punto final

La presencia del PNRSV por RT-PCR se determinó en 90 % de las muestras recolectadas con los síntomas de moteado amarillo, obteniendo un producto de 455 pb (Figura 3, carriles C a F). En algunas muestras se obtuvieron señales tenues de los productos de la RT-PCR o bien fueron negativas, aún con síntomas de moteado amarillo (Figura 3, carriles G y H, respectivamente), que indica que la concentración del ARN de PNRSV pudo ser diferente entre las muestras recolectadas (Sánchez-Navarro et al., 1998; Dal Zotto et al., 1999; Yuyemoto et al., 2003).

Secuenciación nucleotídica directa de productos de la RT-PCR de un fragmento de la proteína de la cápside de PNRSV

Secuencias parciales directas y sus números de acceso se obtuvieron de los productos de la RT-PCR de PNRSV, el único virus detectado de muestras procedentes de las localidades de Ocuituco (Número de Acceso en el Genbank EF456764, EF456765, EF456766) y Tétela del Volcán (Número de Acceso en el Genbank EF456767, EF456768, EF456769, EF456770) del estado de Morelos; Domingo Arenas (Número de Acceso en el Genbank DQ979004), Tepetzala (Número de Acceso en el Genbank DQ979005), San Martín Texmelucan (Número de Acceso en el Genbank EF456771) y San Pedro Coronango (Las Dalias) del estado de Puebla. La comparación de las secuencias obtenidas de los aislados de PNRSV de durazno cultivado en estas regiones de México, con las disponibles en el GenBank, confirmaron la identidad de este virus por mostrar una similitud del 94 % al 100 % con aislados del mismo virus presentes en otras regiones del mundo, al menos con la región de la CP comparada y mostrando quizá un origen común (Sánchez y Pállas, 1997; Scott et al., 1998).

Caracterización del componente viral ARN-3 del PNRSV por clonación y secuenciación nucleotídica

Se obtuvieron las secuencias completas del producto de la RT-PCR de 1800 pb, que secuenciado en ambos sentidos y recostruido, practicamente incluye el componente ARN-3 completo, de los tres aislados provenientes del estado de Puebla: Las Dalias 5 (Número de Acceso en el Genbank FJ546090), Las Dalias 11 (Número de Acceso en el Genbank FJ546091) y Tepetlaxco 5 (Número de Acceso en el Genbank FJ546092) todas del estado de Puebla (Figura 4. Panel B; carriles B, C y D).

El componente ARN-3 del PNRSV de los aislados Mexicanos, ya recostruidos, consiste de 1950 nucleotidos (nt) y contiene dos OFR's separados por una región intergenica (RI) de 75 nt no codificante. El ORF próximo al extremo 5' de 852 nt, codifica un polipeptido de 283 aminoácidos (aa) que corresponde al ORF de la proteína del movimiento (MP). El ORF próximo al extremo 3' de 681 nt, codifica un polipeptido de 226 aa correspondiente a la proteína de la cápside (CP) (Figura 4. Panel A).

Las secuencias nucleotídicas (nt) del ARN-3 de las muestras seleccionadas y sus productos de traducción (aa) fueron comparadas con secuencias similares disponibles en la base de datos del NCBI/GenBank (NCBI, 2012), señalando una identidad del 98 % y 100 %, respectivamente, con variantes del PNRSV.

El análisis filogenético, utilizando todas las secuencias de PNRSV disponibles en la base de datos disponibles en el GenBank (NCBI, 2012), reveló que los tres aislados de PNRSV caracterizados se agruparon dentro de los grupos PV32-I y PE5-III, previamente descritos, para MP (Figura 5) y la CP (Figura 6), mostrando poca variabilidad y alta similitud, indicando que el PNRSV y sus aislados encontrados en las regiones del Estado de México, estados de Puebla y Morelos, podrían tener un origen geográfico común (Sánchez y Pallás, 1997; Scott et al., 1998; Sala y Paduch, 2013).

El Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) pertenece al género Ilarvirus el cual junto a Alfamovirus, Bromovirus, Cucumovirus y Oleavirus constituyen la familia Bromoviridae (Fulton, 1985; Brunt et al., 1996; Pallás et al., 2012) y es uno de los patógenos más frecuentes en frutales de hueso, que afecta severamente el crecimiento, productividad y longevidad de las plantas infectadas (Pusey y Yadava, 1991; Hammond y Crosslin, 1998; Cui et al., 2012).

El PNRSV es transmitido principalmente por injerto de material infectado a sano, que contribuyen a su rápida propagación y amplia distribución mundial, combinado con otros virus y viroides, en frutales de hueso y otras especies de Rosaceae (Pallás et al., 2012; Yuyemoto, et al., 2003; Sánchez et al., 2005).

No se conoce el origen y la distribución del PNRSV en las plantas de durazno cultivadas en las zonas productoras de durazno en México y los daños que causa en el ciclo productivo de este frutal. Es posible que otros virus o viroides, que son comunes en otras partes del mundo, estén infectando al durazno cultivado en México, por lo cual es necesario identificarlos.

CONCLUSIONES

La presencia del Prunus necrotic ringspot virus se determinó parcialmente en plantas de durazno con daños de moteado, mosaico y anillos irregulares amarillentos, cultivadas en regiones del Estado de México, estados de Morelos y Puebla, utilizando transmisión mecánica a hospedantes indicadoras, prueba serológica de DAS-ELISA, hibridación Dot-blot, análisis electroforético de ARN-dc y por secuenciación directa de productos de la RT-PCR de un fragmento de 455 pb muy conservado dentro del ORF de la proteína de la cápside (CP) del PNRSV, que mostró una identidad de 94 % a 100 % con otros aislados del PNRSV distribuidos ampliamente en el mundo.

La identidad del PNRSV se confirmó también en tres muestras por clonación y secuenciación nucleotídica completa del componente ARN-3, que contiene los ORF's de la proteína del movimiento (MP) y de la proteína de la cápside (CP) y por comparación con secuencias similares disponibles en la base de datos del Genebank. Las secuencias nucleotídicas (an) y las correspondientes con sus productos de traducción (aa) del componente ARN-3 del PNRSV de México fueron 98 % y 100 %, respectivamente, idénticas a las encontradas en durazno cultivado en otras partes del mundo, indicando un probable origen geográfico común. El análisis filogenético, utilizando todas las secuencias de PNRSV disponibles en la base de datos, reveló que los tres aislados de PNRSV caracterizados se agruparon dentro de los grupos PV32-I y PE5-III, previamente descritos.

AGRADECIMIENTOS

La presente investigación fue apoyada económicamente por el PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN E INNOVACIÓN TECNOLÓGICA (PAPIIT-IN203108) de la UNAM.

Brunt, A. A., K. Crabtree, M. J. Dallwitz, A. J. Gibbs, L. Watson, and E. J. Zurcher (eds). 1996. Plant Viruses Online: Descriptions and Lists from the VIDE Database. Version: 20^th August 1996. http://biology.anu.edu.au/Groups/MES/vide/        [ Links ]

Cambra, M., Flores, R., Pallás, V., Gentit, P., and Candresse, T. 2008. Viruses and viroids of Peach Trees. In: Layne D. R., and D. Bassi (eds). The Peach Botany, Production and Uses. CABI, UK.         [ Links ]

Clark, M. F., and M. A. Adams. 1977. Characteristics of microplate method of enzime linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34: 475-483.         [ Links ]

Cole, A., G. I. Mink, and Régev, S. 1982. Location of Prunus necrotic ringspot virus on pollen grains from infected almond and cherry trees. Phytopathology 72: 1542-1545.         [ Links ]

Cui, H., N. Hong, G. Wang, A. Wang. 2012. Molecular characterization of two Prunus necrotic ringspot virus isolates from Canada. Arch. Virol. 157: 999-1001.         [ Links ]

Dal Zotto, A., S. F. Nome, J. A. Di Rienzo, and D. M. Docampo. 1999. Fluctuations of Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) at various phenological stages in peach cultivars. Plant Dis. 83: 1055-1057.         [ Links ]

Delano, J., and C. Upton. 1999. Single primer pair designs that facilitate simultaneous detection and differentiation of Peach mosaic virus and Cherry mottle leaf virus. J. Virol. Methods 83: 103-111.         [ Links ]

Dijkstra, J., and P. C. De Jager. 1998. Practical Plant Virology. Protocols and Exercises. Springer, Berlin. 459 p.         [ Links ]

Fulton, W. R. 1985. Prunus necrotic ringspot ilarvirus. In: Brunt, A. A., K. Crabtree, M. J. Dallwitz, A. J. Gibbs, L. Watson, and E. J. Zurcher (eds). (1996 onwards). Plant Viruses Online: Descriptions and lists from the VIDE database. Version: 20^th August 1996. http://biology.anu.edu.au/Groups/MES/vide/        [ Links ]

Hammond, R. W., and J. M. Crosslin. 1998. Virulence and molecular polymorphism of Prunus necrotic ringspot virus isolates. J. Gen. Virol. 79: 1815-1823.         [ Links ]

Herranz, M. C., J. A. Sánchez-Navarro, F. Aparicio, and V. Pallás. 2005. Simultaneous detection of six stone fruit viruses by non-isotopic molecular hybridization using a unique riboprobe or 'polyprobe'. J. Virol. Methods 124: 49-55.         [ Links ]

Mackenzie, D. J., M. A. McLean, S. Mukerji, and M. Green. 1997. Improved RNA extraction from woody plants for the detection of viral pathogens by reverse transcription-polymerase chain reaction. Plant Dis. 81(2): 222-226.         [ Links ]

Matic, S., Sánchez-Navarro, J. A., Mandic, B., Myrta, A. & Pallas, V. 2008. Tracking three ilarviruses in stone fruit trees throughout the year by ELISA and tissue-printing hybridization. J. Plant Pathol. 90: 137-141.         [ Links ]

Mink, G. I., and M. D. Aichele. 1984. Detection of Prunus necrotic ringspot virus and Prune dwarf virus in prunus seed and seedlings by enzyme-linked immonosorbent assay. Plant Dis. 68: 378-381.         [ Links ]

NCBI. 2012. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ (Consulta: diciembre, 2012).

Pallás, V., Más, P., and J. A. Sánchez-Navarro. 1998. Detection of plant RNA viruses by non-isotopic dot-blot hybridization. In: Foster, G., and S. Taylor (eds). Plant Virus Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance. Humana Press, Totowa, NJ. pp: 461-468.         [ Links ]

Pallás, V., J. A. Sánchez-Navarro, and J. Díez. 1999. In vitro evidence for RNA binding properties of the coat protein of Prunus necrotic ringspot Ilarvirus and their comparison to related and unrelated viruses. Arch. Virol. 144: 797-803.         [ Links ]

Pallás, V., F. Aparicio, M. C. Herranz, K. Amari, M. A. Sánchez-Pina, A. Myrta, and J. A. Sánchez-Navarro. 2012. Ilarviruses of Prunus spp.: A continued concern for fruit trees. Phytopathology 102: 1108-1120.         [ Links ]

Pusey, P. L., and U. L. Yadava. 1991. Influence of Prunus necrotic ringspot virus on growth, productivity, and longevity of peach trees. Plant Dis. 75: 847-851.         [ Links ]

Rosner, A., L. Maslenin, and S. Spiegel. 1997. The use of short and long products for improved detection of Prunus necrotic ringspot virus in woody plants. J. Virol. Methods 67: 135-141.         [ Links ]

Sala-Rejczak, K., and E. Paduch-Cichal. 2013. Molecular variability of the coat protein gene of Prunus necrotic ringspot virus isolates. Acta Sci. Pol., Hortorum Cultus 12: 35-42.         [ Links ]

Salem, N., A. Mansour, A. Al-Musa, A. Al-Nsour, and R. Hammond. 2004. Identification and partial characterization of Prunus necrotic ringspot virus on stone fruits in Jordan. J. Plant Pathol. 96: 85-90.         [ Links ]

Sánchez-Navarro, J. A., and V. Pallás. 1997. Evolutionary relationships in the ilarviruses: nucleotide sequence of Prunus necrotic ringspot virus RNA 3. Arch. Virol. 142: 749-763.         [ Links ]

Sánchez-Navarro, J. A., Aparicio, F., Rowhani, A. and Pallas, V. 1998. Comparative analysis of ELISA, non radioactive molecular hybridization and PCR for the detection of Prunus necrotic ringspot virus in herbaceous and Prunus hosts. Plant Pathol. 47: 780-786.         [ Links ]

Sánchez-Navarro, J. A., F. Aparicio, M. C. Herranz, A. Minafra, A. Myrta, and V. Pallás. 2005. Simultaneous detection and identification of eight stone fruit viruses by one-step RT-PCR. Eur. J. Plant Pathol. 111: 77-84.         [ Links ]

Scott, S. W., M. T. Zimmermann, D. X. Ge, and J. MacKenzie. 1998. The coat proteins and putative movement proteins of isolates of Prunus necrotic ringspot virus from different host species and geographic origins are extensively conserved. Eur. J. Plant Pathol. 104: 155-161.         [ Links ]

Untiveros, M., Z. Pérez E., and G. Clover. 2010. PCR assays for the detection of members of the genus Ilarvirus and family Bromoviridae. J. Virol. Methods 83: 103-111.         [ Links ]

Valverde, R. A., T. S. Nameth, and L. R. Jordan. 1990. Analysis of double-stranded RNA for plant virus diagnosis. Plant Dis. 74: 255-258.         [ Links ]

Yuyemoto, J. K., L. R. Bulluck III, S. Pethybridge, B. McCorkell, and W. K. Asai. 2003. Horizontal spread of Ilarviruses in young trees of several peach cultivars. Plant Dis. 87: 75-77.         [ Links ]