Identificación e incidencia de tres hongos fitopatógenos, de reporte nuevo, en avena (Avena sativa L.) en la meseta central de México

Identification and incidence of three phytopathogenic fungi of new report on oat (Avena sativa L.) at Mexico's central plateau

Elizabeth García-León¹, S. Gerardo Leyva-Mir², H. Eduardo Villaseñor-Mir³, M. Florencia Rodríguez-García³, J. Manuel Tovar-Pedraza¹*

¹ Fitopatología. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México.* Autor responsable

² Parasitología Agrícola. Universidad Autónoma Chapingo. 56230. Chapingo, Estado de México.

Recibido: abril, 2013.
Aprobado: octubre, 2013.

Resumen

La foya del tallo y la roya de la corona en el cultivo de avena (Avena sativa L.) son las enfermedades más destructivas en casi todo el mundo. Además, aumenta la incidencia de las enfermedades foliares causadas por un complejo de hongos patógenos. Durante los ciclos agrícolas primavera-verano de 2009 y 2010, síntomas severos de tizones foliares se observaron en lotes comerciales sembrados con avena en los estados de Hidalgo, Tlaxcala, Puebla, Morelos, Estado de México y Distrito Federal, México. Los objetivos de este estudio fueron identificar los agentes causales de los tizones foliares de la avena, así como determinar su incidencia y distribución en los valles altos de la Meseta Central de México. Hojas con síntomas de tizón foliar se recolectaron de 63 sitios en el ciclo 2009 y 100 sitios en el 2010. La determinación de los agentes causales de las enfermedades se realizó mediante los postulados de Koch. A través de un análisis morfológico, molecular y pruebas de patogenicidad se identificó a Alternaria alternata, Bipolaris victoriae y Bipolaris sorokiniana como los agentes causales de los tizones foliares. Las frecuencias de los hongos fueron 20.85, 12.26 y 9.2 % del total de los sitios visitados. Este es el primer reporte de estas especies de hongos fitopatógenos para México en avena. La incidencia de los tres hongos fue mayor en el ciclo 2010 y su distribución abarcó campos de avena en Tlaxcala, Hidalgo, Estado de México y Distrito Federal. La importancia de la presencia de estos hongos es que son patógenos que pueden disminuir la producción y producen micotoxinas dañinas para el ganado que consume la avena como forraje.

Palabras clave: Avena sativa, Alternaria alternata, Bipolaris victoriae, Bipolaris sorokiniana, Cochliobolus.

Abstract

Keyword: Avena sativa, Alternaria alternata, Bipolaris victoriae, Bipolaris sorokiniana, Cochliobolus.

INTRODUCCIÓN

En México la superficie sembrada con avena (Avena sativa L.) ha aumentado, aunque no se produce suficiente para abastecer las demandas, pues existe 50 % de déficit (SIAP, 2012). El área sembrada con avena en México en 2011 fue 1 004 526 ha (SIAP, 2012), distribuidas en todas las zonas agrícolas del país. Por su adaptación a condiciones ambientales diversas, la avena se considera un cultivo alternativo en los valles altos y en la región semiárida del norte-centro, particularmente cuando el inicio del período de lluvias se atrasa o la temperatura baja, pues la siembra de los cultivos tradicionales, como maíz (Zea mays L.) y frijol (Phaseolus vulgaris L.), se pone en riesgo (Villaseñor-Mir etal., 2003).

La roya del tallo (Puccinia graminis f. sp. avenae Eriks. & Henn.) y la roya de la corona (Puccinia coronata Fraser & Led.) en avena son las enfermedades más destructivas en casi todo el mundo. Las royas afectan significativamente la producción y la calidad del grano de avena en los valles altos de la Meseta Central de México (Leyva-Mir et al., 2004; Villaseñor-Mir et al., 2009); sin embargo, se conoce poco del complejo de patógenos (Bipolaris spp., Drechslera spp. y Alternaria spp.) causantes de manchas y tizones foliares. Según Zillinsky (1983), en infecciones severas causadas por el complejo de patógenos foliares en cereales de grano pequeño puede presentarse atraso del crecimiento de las plantas, manchado oscuro de los embriones y disminución del rendimiento del grano.

La avena, como otros cereales, es una de las alternativas principales para la rotación de cultivos, porque es poco susceptible al complejo de patógenos causantes de manchas y tizones foliares comunes en trigo y cebada (Casa y Reis, 2000). Sin embargo, en México hay incidencia y severidad alta de enfermedades ocasionadas por este complejo de hongos. Los objetivos de este estudio fueron identificar los agentes causantes de tizones foliares de la avena y determinar su incidencia en los valles altos de la Meseta Central de México.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo

Aislamiento y purificación del patógeno

Para aislar a los patógenos presentes en el tejido foliar se indujo la esporulación en tejido enfermo, en cámara húmeda. Para esto, piezas de aproximadamente 1 cm² de cada hoja (abarcando parte asintomática y sintomática) se desinfestaron 1 min en condiciones asépticas, en una solución de hipoclorito de sodio al 3 %, 1 min, se lavaron 3 min en agua destilada estéril y se secaron en papel absorbente esterilizado. Cinco piezas de tejido foliar se colocaron en cajas petri con papel filtro humedecido con agua destilada estéril. De cada recolecta se colocaron 10 piezas distribuidas en dos cajas petri y cada pieza fue una repetición. Las muestras se incubaron 24 a 72 h a 20 ±2 °C, iluminadas continuamente con luz blanca. Al formarse las estructuras de reproducción de los hongos en el tejido, se obtuvieron cultivos monospóricos mediante la transferencia directa de los conidios a cajas petri, con medios de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA) (Difco*, EE.UU.) y jugo de verduras (V8).

Identificación morfológica

La identificación preliminar de los hongos se basó en la morfología de la colonia y estructuras de reproducción asexual (conidios y conidióforos). Para esto, preparaciones realizadas con glicerina al 10 % se observaron en un microscopio compuesto y se registró la forma y tamaño de 25 conidióforos y 50 conidios de cada uno de los aislados obtenidos. La identificación del género se realizó con las claves de Barnett y Hunter (2006), y para identificar la especie se utilizaron las claves de Ellis (1971), Kwasna (1995) y Simmons (2007).

La incidencia de cada una de las tres especies de hongos por sitio se calculó con la siguiente ecuación: Ii = (Σni / Ni) • 100; donde: Ii = incidencia de cada especie de hongo en el momento i; ni = número de muestras con presencia de cada especie de hongo en el momento i; Ni = número total de muestras analizadas.

Pruebas de patogenicidad

La patogenicidad de un aislado representativo de cada una de las tres especies de hongos se verificó mediante la inoculación de plántulas de avena cv. Chihuahua de 15 d de edad. Para cada especie de hongos, cinco plántulas se asperjaron con una suspensión de conidios (1x10⁶ esporas mL^-1), a la cual se agregaron 5 gotas L^-1 de un surfactante (Sigma-Tween 20^®, EE.UU.) Tres plántulas asperjadas con agua destilada estéril sirvieron como testigo. Las plántulas se mantuvieron 48 h en cámaras de crecimiento a 25 °C y humedad relativa > 95 %. Luego, las plantas se transfirieron a un invernadero (18 a 20 °C) y se registró el desarrollo de síntomas cada 24 h. La prueba de patogenicidad para cada especie de hongo se realizó dos veces.

El ADN de cada especie de hongos usados en las pruebas de patogenicidad se extrajo desde colonias miceliales de aproximadamente 10 d de crecimiento en cajas petri con medio de cultivo PDA, iluminadas continuamente con luz blanca. La extracción se realizó con el kit Plant RNA Purification Reagent (Invitrogen^®, EE.UU.) de acuerdo al protocolo descrito por el fabricante: maceración de 0.1 g de micelio en un mortero a -50 °C, transferencia a un tubo de microcentrifuga, adición de 500 μL de una solución de lisis y centrifugación a 13 000 rpm por 2 min. Luego, se agregaron 100 μL de NaCl 5 M y 300 μL de cloroformo, se centrifugó 10 min a 13 000 rpm, se agregaron 400 μL de isopropanol, se colocó a -20 °C por 10 min, se agregó 1 mL de etanol frío al 70 %, se dio un pulso de vortex, se centrifugó 5 min a 10 000 rpm, se secó 15 min, se agregaron 100 f L de agua desionizada estéril y se recolectó el ADN. La presencia de ADN se comprobó con electroforesis en gel de agarosa al 0.8 %, con 0.3 mg de bromuro de etidio mL^-1.

Para la reacción de amplificación se utilizaron los iniciadores universales ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') e ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG- 3') (White et al., 1990). Los componentes de la reacción fueron: amortiguador (1x), MgCl₂ 3 μL, DNTPs 1 μL, iniciadores 2 μL de cada uno, y Taq polimerasa 0.4 μL. Las condiciones de amplificación fueron 95 °C por 5 min, 95 °C por 1 min, 55 °C por 1 min, 72 °C por 5 min y cada una se mantuvo 30 ciclos. Luego los tubos se colocaron a 72 °C por 5 min y finalmente a 4 °C.

Los productos de la reacción de PCR se separaron con electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % y secuenciaron con el Genetic Analizer modelo 3100 (Applied Biosystem®, EE.UU.). Las secuencias obtenidas se depositaron en la base de datos del GenBank (NCBI, 2012) con número de acceso JQ867017, JQ867018 y KC012912.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislados

En las muestras evaluadas se obtuvieron hongos reportados comúnmente como patógenos y saprófitos en plantas de avena (datos no mostrados). Además, se caracterizaron dos especies de Bipolaris y una del género Alternaria (Figura 1 A-C).

Identificación morfológica

Las colonias de Alternaria en las lesiones de las hojas presentaron cadenas largas de conidios con coloración café clara (Figura 1 D) y las de Bipolaris exhibieron formación abundante de conidióforos y conidios color café oscuro (Figuras 1 E, F). En medio PDA, las colonias de Alternaria eran negras, con crecimiento en forma de anillos concéntricos y esporulación abundante a los 6 d de incubación (Figura 1G). El análisis morfológico mostró conidióforos simples, erectos, oliváceos-café claro, de 35 a 48x3 a 4 μm, con uno o varios poros apicales; conidios formados en cadena, elipsoidales a ovoides, oliváceos-café claro, septados transversalmente (4 a 6 septos) y con pocos o ningún septo longitudinal, de 15 a 35x6 a 11 μm (Figura 1J). Todas las características coincidieron con la descripción de A. alternata (Fr.) Keissl. reportada por Simmons (2007). Alternaria alternata es la especie productora de micotoxinas más importante y se ha identificado en cereales, girasol, olivo y otros frutos (Barkai-Golan, 2008). Según Simmons (2007), las especies de Alternaria reportadas en avena en el mundo son: A. alternarina, A. avenicola, A. cerealis, A. uredinis y A. utile. Por tanto, éste es el primer reporte de A. alternata causando tizón foliar de la avena en campo.

Las colonias de la segunda especie de Bipolaris presentaron crecimiento micelial gris oscuro-negro, compuesto por masas densas de estructuras asexuales en medio V8 (Figura 1I). Los conidióforos fueron solitarios, rectos o flexuosos, café claros y de 140 a 210x6 a 9 /ím. Los conidios fueron ligeramente curvos y rectos, fusiformes a elipsoidales, lisos, café oliváceo-oscuro, más anchos en la parte media, de 55 a 110x16 a 26 /ím, con extremos redondeados y con 5 a 9 células con forma de barril (Figuras 1L, M). Estas características morfológicas concuerdan con las de B. sorokiniana (Sacc.) Shoem. (Teleomorfo: Cochliobolus sativus) descritas por Ellis (1971) y Kwasna (1995).

Prueba de patogenicidad

Diez días después de la inoculación (ddi), todas las plantas inoculadas con la suspensión de conidios de A. alternata presentaron manchas circulares necróticas a manera de anillos y halo amarillento; después coalescieron y necrosaron el tejido totalmente. Las hojas asperjadas con conidios de B. victoriae mostraron 9 ddi manchas oval-alargadas, café, apariencia rayada con margen clorótico a rojizo y formación de estructuras (conidios) color oscuro en el tejido. La presencia de seudotecios de C. victoriae no se observó en los medios de cultivo ni en los tejidos infectados artificialmente en el invernadero. Todas las hojas asperjadas con conidios de B. sorokiniana 8 a 12 ddi desarrollaron manchas pequeñas café oscuro, redondas y elípticas, que cubrieron después toda la hoja; así mostraron un aspecto de necrosis total, con esporulación abundante. Las plantas con síntomas tempranos presentaron defoliación. La formación de seudotecios de C. sativus no se presentó en el medio de cultivo ni en los tejidos infectados artificialmente.

A partir del tejido infectado de plantas inoculadas con cada hongo, se reaislaron las tres especies de hongos, con características morfológicas similares a los aislados de las plantas en el campo.

Identificación molecular

La comparación en el BLAST de la secuencia JQ867017 mostró 100 % de similaridad con la secuencia de A. alternata (Genbank No. de acceso HQ014678); la secuencia JQ867018 mostró 98 % de similaridad con la secuencia de Cochliobolus victoriae (Anamorfo: Bipolaris victoriae) (Genbank No. de acceso EF452448) y la secuencia KC012912 fue 100 % similar a la secuencia EF452447 de Cochliobolus sativus (Anamorfo: Bipolaris sorokiniana). Esto confirmó los resultados de la identificación morfológica.

Incidencia de hongos por ciclo agrícola

En el ciclo primavera-verano de 2009 se obtuvieron frecuencias significativamente menores de las tres especies de hongos, respecto a 2010 (Figura 2). Esto podría deberse a la dispersión natural de los patógenos en el tiempo.

Incidencia de hongos por localidad

La incidencia de los patógenos en los sitios fue significativamente diferente (Cuadro 2) y su presencia en el follaje se relacionó con la similitud entre las regiones agroecológicas. Esto coincidió con lo señalado por Kurowski y Wysocka (2009), de que las condiciones ambientales y los factores de cada sitio en conjunto son determinantes para la presencia de los diferentes hongos que infectan a la avena.

Alternaria alternata se detectó en 20.85 % del total de las muestras y se distribuyó en Tlaxcala, Hidalgo, Estado de México y Distrito Federal. Kiecana y Cegielko (2007) y Kurowski y Wysocka (2009) identificaron A. alternata como la especie fungosa más frecuente en las semillas de avena recolectadas en campos de Polonia. Esto indica que el patógeno puede dispersarse con la semillas infectadas.

Bipolaris victoriae se identificó en 12.26 % de los sitios estudiados y se detectó en Tlaxcala, Hidalgo y Estado de México (Cuadro 2). Este es un porcentaje de frecuencia alto, en comparación con otros hongos causantes de tizones. Este patógeno y la producción alta de toxinas, dañinas para el ganado que consume el forraje, parece tener importancia limitada (Sivanesan, 1987; De Saeger, 2011).

Bipolaris sorokiniana se recolectó en 9.2 % de las muestras y estuvo presente en campos de avena del Distrito Federal, Tlaxcala, Estado de México e Hidalgo (Cuadro 2). Lo anterior contrastó con lo reportado por Zillinsky (1983), quien indicó que B. sorokiniana afecta comúnmente a los cereales de grano pequeño, pero que raramente infecta avena.

Alternaria alternata no se presentó en la variedad Ópalo, B. sorokiniana no se detectó en la variedad Obsidiana y B. victoriae no se encontró en las variedades Ópalo, Obsidiana y Gema. Esto es relevante, pues las variedades señaladas podrían exhibir tolerancia o resistencia a la infección de esos hongos. Para confirmar lo anterior se necesita realizar estudios y determinar la susceptibilidad de cada variedad a cada patógeno, como lo realizado en tallos de avena por Mariscal-Amaro et al. (2009) para la roya causada por Puccinia graminis f. sp. avenae.

En los estados de Morelos y Puebla se siembran las mismas variedades de avena que en los demás estados de los valles altos de México, y en muestras con síntomas de tizón foliar provenientes de estos dos estados no se detectaron A. alternata, B. victoriae y B. sorokiniana. Lo anterior pudo deberse a que se recolectaron muestras únicamente de siete sitios de Morelos y seis de Puebla, alejados de las regiones productoras de avena de los otros estados de los valles altos de México. Es posible que los tres hongos no se hayan dispersado a esas áreas.

La presencia de los tres hongos y su relación con la altitud de los sitios de recolecta indicó que los tizones causados por A. alternata, B. victoriae y B. sorokiniana se distribuyeron en las zonas productoras localizadas entre 2250 y 3340, 2240 y 2836 y 2270 y 3340 msnm, respectivamente. Esto indica que B. victoriae no causó enfermedad en altitud superior a 2900 m, lo que debe estudiarse para conocer el efecto de la altitud en la incidencia y severidad de los síntomas ocasionados por el hongo.

Las royas son consideradas como los patógenos causantes de enfermedades foliares más importantes de la avena y los complejos de Bipolaris spp. y Alternaria spp. son patógenos potenciales, que podrían causar daños y pérdidas severas. Además, las tres especies reportadas en este estudio producen toxinas dañinas para el ganado consumidor de avena (Sivanesan, 1987; Barkai-Golan, 2008; De Saeger, 2011).

CONCLUSIONES

Alternaria alternata, Bipolaris victoriae y Bipolaris sorokiniana fueron identificados mediante análisis morfológico, molecular y pruebas de patogenicidad como los agentes causales de tizones foliares en campos de avena de los valles altos de la Meseta Central Mexicana. La incidencia de los hongos fue 20.85, 12.26 y 9.2 %, respectivamente, en los 163 sitios analizados. Este es el primer reporte de la presencia de las tres especies causantes de tizones foliares en el cultivo de avena en México.

La incidencia de las tres especies fue mayor en el año 2010 que en 2009 en los campos de avena de Tlaxcala, Hidalgo, Estado de México y Distrito Federal.

LITERATURA CITADA

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