Diversidad genética del tizón tardío de la papa [Phytophthora infestans (Mont) de Bary] en Chapingo, México

Genetic diversity of potato late blight [Phytophthora infestans (Mont) de Bary] at Chapingo, México

Norma M. Alarcón-Rodríguez, Héctor Lozoya-Saldaña^*, Ernestina Valadez-Moctezuma, Ma. del Rosario García-Mateos, María T. Colinas-León

¹ Instituto de Horticultura, Departamento de Fitotecnia, Universidad Autónoma Chapingo. 56230. Chapingo, México. (picti87@gmail.com). *Autor responsable.

Recibido: mayo, 2012.
Aprobado: junio, 2013.

Resumen

En el altiplano central mexicano, el tizón tardío (Phytophthora infestans) presenta alta incidencia, severidad y diversidad genotípica, debido en parte a sus progenies derivadas sexualmente. El objetivo de este estudio fue evaluar el tipo de apareamiento, el perfil aloenzimático y el haplotipo mitocondrial de 88 aislamientos de P. infestans obtenidos de lesiones simples al azar de clones de papa en el campo agrícola experimental de la Universidad Autónoma Chapingo, México, durante 2008, 2009 y 2010. Predominó la población homotálica (A1/ A2), con una frecuencia de 0.761. Las frecuencias de los tipos A1 y A2 fueron 0.125 y 0.114. Se identificaron 25 genotipos de aloenzimas, con los alelos 100 y 122 para las peptidasas (Pep), y 86, 90, 100, 111 y 122 para glucosa fosfato isomerasas (Gpi). El genotipo más común fue A1/A2, Pep 100/100 y Gpi 86/100 (frecuencia 0.216). El índice de diversidad genotípica fue 1.8 y sólo se identificó al haplotipo mitocondrial Ia. Pocos genotipos se pudieron ubicar con precisión en alguna de las clasificaciones existentes, por lo que se consideran únicos en el área o no presentes en otras regiones. Por su diversidad genética es necesario una clasificación más amplia, que incluya a la mayoría de alelos multilocus detectados por aloenzimas y a la condición homotálica.

Palabras clave: Solanum tuberosum L., haplotipo mitocondrial, isoenzimas, compatibilidad.

Abstract

In the Mexican central highlands, late blight (Phytophthora infestans) has high incidence, severity and genotypic diversity, due in part to its sexually derived progeny. The objective of this study was to evaluate the mating type, allozyme profile and mitochondrial haplotype of 88 isolates of P. infestans obtained from simple random lesions of potato clones at the experimental agricultural station of the University of Chapingo, México, in 2008, 2009 and 2010. Homothallic population (A1/A2) predominated, with a frequency of 0.761. A1 and A2 frequencies were 0.125 and 0.114, respectively. Twenty five allozyme genotypes were identified, with alleles 100 and 122 for peptidase (Pep), and 86, 90, 100, 111 and 122 for glucose phosphate isomerase (Gpi). The most common genotype was A1/A2, Pep 100/100 and Gpi 86/100 (frequency 0.216). The genotypic diversity index was 1.8 and only the Ia mitochondrial haplotype was identified. Few genotypes could be located accurately in any of the existing classifications, so they are considered unique in the area or not present in other regions. For their genetic diversity a broader classification is needed, including most of multilocus alleles detected by alloenzymes and homothallic condition.

INTRODUCCIÓN

Phytophthora infestans (Mont.) de Bary es un microorganismo perteneciente al reino Stramenopila (Chromista), Phylum Oomycota (http://tarwi.lamolina.edu.pe/~gligli/OO.pdf), que posee una gran plasticidad genética y es un patógeno de importancia económica en solanáceas, como la papa (Solanum tuberosum L.). Es una amenaza para la seguridad alimentaria mundial por causar el tizón tardío, enfermedad de la papa responsable de la hambruna en Irlanda en el siglo XIX. Causa manchas en hojas, tallos, pecíolos y tubérculos, que conducen a necrosis y muerte (Pérez y Forbes, 2008); por tal motivo P. infestans es uno de los organismos más estudiados en su reproducción, fisiología y procesos infectivos. Es necesario conocer la diversidad genética de las poblaciones de las regiones infectadas porque está relacionada con la eficacia y la eficiencia de los métodos de manejo. Entre los métodos para caracterizar su diversidad están los marcadores fenotípicos y genotípicos y los más empleados son los patrones aloenzimáticos de glucosa fosfato isomerasas (Gpi) y peptidasas (Pep), el tipo de apareamiento o compatibilidad (A1, A2), la sonda RG57 y la evaluación de haplotipos de ADN mitocondrial (ADNmt) (Griffith y Shaw, 1998; Gómez-Alpizar, et al., 2007; Jaimasit y Prakob, 2010).

Phytophthora infestans es un organismo heterotálico porque requiere los tipos de apareamiento A1 y A2 para reproducirse sexualmente. El grupo de compatibilidad A1 se dispersó por el mundo desde la hambruna irlandesa de mediados del siglo XIX, y el tipo A2 se identificó en México en la década de los cincuenta, donde permaneció limitado por varias décadas más. En 1981 se encontró en Europa, Oriente Medio, Asia y Sur América, aumentando su importancia debido a su rápida dispersión y alta virulencia, adaptándose a nuevas condiciones ambientales y hospederos (Spielman et al., 1991; Goodwin et al., 1995a; Gilchrist et al., 2009). En México se han identificado todos los haplotipos mitocondriales (Fernández et al., 2005; Grünwald et al., 2001), y Garay et al. (2007) encontraron el haplotipo lb en Tlaxcala. La mayor diversidad genotípica mundial se encuentra en el altiplano central mexicano, considerado el lugar de origen de P. infestans (Grünwald et al., 2001; Grünwald y Flier, 2005), y el área de Chapingo al oriente del lago de Texcoco es el segundo centro de diversidad del oomiceto después del valle de Toluca (Goodwin, 1996). Esta diversidad se ha evaluado con aloenzimas, polimorfismo de fragmentos largos de restricción (RFLP) y los tipos de compatibilidad, así como mediante métodos bioquímicos y moleculares (Goodwin, 1996). El empleo de estas metodologías llevó a determinar que las poblaciones de P. infestans están subestructuradas a partir de linajes clonales, frecuentemente denominados por las iniciales del país donde se identificaron y por un sufijo numérico que representa linajes derivados del original. Por ejemplo, se considera que los aislamientos que participaron en la primera migración masiva de P. infestans de México hacia Europa y EE.UU. pertenecen al linaje US-1, mientras que aquellos reportados en Ecuador se denominan EC-1, EC-2 y EC-3 (Adler et al., 2004).

Debido a la relevancia del patógeno y a la necesidad de relacionar criterios de clasificación, el objetivo de esta investigación fue determinar la variabilidad genética de P. infestans en poblaciones obtenidas de clones de papa en Chapingo, México, al oriente del lago Texcoco y al pie del cerro Tláloc, y establecer su posible relación con clasificaciones existentes.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento del patógeno

Durante los ciclos de cultivo de temporal de 2008, 2009 y 2010, se recolectaron aislamientos de P. infestans al azar, de lesiones simples, jóvenes, de hojas y tallos de lotes de 2500 genotipos pertenecientes a 100 clones de cada una de 25 familias de diversos progenitores cada año (7500 clones de 75 familias por los tres años), del Departamento de Agricultura de EE.UU. (USDA), y de la variedad Alfa como testigo susceptible y fuente de inóculo, sin fase fenológica específica, tomando el tejido con la lesión una vez que ésta aparecía por la infección natural del patógeno, en el campo agrícola experimental de la Universidad Autónoma Chapingo (UACh), Municipio de Texcoco, Estado de México, México, a 2240 m de altitud, clima templado, con temperatura media anual de 15.9 °C y una precipitación pluvial superior a los 500 mm, de junio a septiembre (http://www.bvsde.ops-oms.org/bvsaar/e/proyecto/generales/casos/texcoco.html). Los tejidos enfermos se colocaron sobre rodajas de papa sana (var. Alpha) desinfestada con hipoclorito de sodio al 2 % en agua (v/v) en cajas petri (10 cm de diámetro) para permitir el crecimiento de micelio a través del tejido, a temperatura ambiente. Al tercer día se observó el crecimiento de micelio al microscopio, y se confirmó la presencia del patógeno mediante observaciones morfológicas en preparaciones fijas. El micelio purificado se transfirió a medio sólido agar-centeno y se incubó a 21 °C para su caracterización (Grünwald et al., 2001).

La compatibilidad se determinó cruzando los aislamientos de P. infestans con una cepa tipo de compatibilidad conocida (A1 o A2) proporcionada por el Programa Internacional Cooperativo del Tizón Tardío de la Papa (PICTIPAPA A. C.), en Metepec, México. En medio agar-centeno, en caja petri (10 cm de diámetro), se sembraron la cepa desconocida y la del tipo conocido en lados opuestos para que crecieran hacia el centro de la caja. Después de dos a tres semanas a 21 °C, la presencia de oosporas donde se entrecruzaron los micelios con el tipo A1, identificó al aislamiento desconocido como A2, y en el cruzamiento con el tipo A2 indicó que el aislamiento desconocido era A1. Si el mismo aislamiento formaba oosporas al cruzarse con las dos cepas de tipo conocido, se consideró homotálico (Gilchrist et al., 2009).

Patrones aloenzimáticos

La identificación de genotipos por aloenzimas se realizó con el método descrito por Goodwin et al. (1995a). Micelio de dos a tres semanas de crecimiento activo se transfirió a un tubo de microcentrífuga con 30 µL de agua destilada estéril y se maceró con una broca de plástico. Después de reposar 5 min se tomaron 10 u L para colocarlos en placas de acetato de celulosa (Titan III, Helena Laboratories). La electroforesis se realizó en amortiguador Tris-Glicina (pH 8.5) y cada enzima se reveló de acuerdo con la metodología reportada por Hebert y Beaton (1993). Para determinar la diversidad genotípica se usó el índice de Shannon-Wiener, que se basa en el concepto de equidad, adquiere valores entre cero cuando hay una sola especie y el logaritmo de S cuando todas las especies están representadas por el mismo número de individuos (Moreno, 2001):

H' = -∑_Piln _Pi

donde Pi=abundancia proporcional de la especie i, es decir, el número de individuos de la especie i dividido entre el número total de individuos de la muestra; ln= logaritmo base 10.

Extracción de ADN

Esta extracción se realizó mediante dos métodos. Primero, el propuesto por Griffith y Shaw (1998). El micelio crecido 10 d de cada aislamiento se maceró con 800 µL de amortiguador de extracción (NaCl 100 mM, Tris-HCl 100 mM pH 8, NaCl 1.4 M, CTAB 2 %, EDTA 20 mM pH 8), se incubó 1 h a 65 °C, se adicionaron 600 µL de cloroformo saturado con agua, la mezcla se agitó 15 s por inversión, se centrifugó 12 min a 17 900 xg, el sobrenadante se transfirió a un tubo limpio y se adicionó ARNsa 10 µg mL^—1. Después se incubaron 1 h a 37 °C, se adicionaron 400 µL de isopropanol incubándose 20 min a —20 °C, se centrifugó 12 min a 15 700 xg, el sobrenadante se decantó y el sedimento se lavó con 500 µL de etanol a 70 % (v/v), se volvió a centrifugar eliminando el sobrenadante y el precipitado se secó a temperatura ambiente. Se resuspendió en solución amortiguadora TE (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8) y se guardó a —20 °C.

El segundo método fue el propuesto por Goodwin et al. (1992). El micelio se maceró con 900 µL de amortiguador de extracción (EDTA 0.5 M, Tris 1 M pH 8, NaCl 1.4 M, SDS 20 % y β-mercaptoetanol). Después de incubar 1 h a 65 °C, se adicionaron 450 µL de acetato de amonio 7.5 M y la mezcla se mantuvo 20 min en hielo. Se centrifugó 10 min a 12 300 xg, el sobrenadante se transfirió y se incorporaron 800 µL de isopropanol para precipitar en hielo por 30 min, se centrifugó 5 min a la misma velocidad, se decantó el isopropanol y el precipitado se lavó con etanol a 70 % (v/v) y la pastilla se secó invirtiendo el tubo a temperatura ambiente. El precipitado se resuspendió con 450 µL de amortiguador TE (Tris 10 mM pH 8, EDTA 0.5 M) y 1 µL de ARNsa A, y reposó toda la noche a 4 °C. Al otro día se adicionaron 450 µL de la mezcla de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Se centrifugó 5 min a 17 900 xg, el sobrenadante se precipitó con la adición de 45 µL de acetato de sodio 3 M y 1 mL de etanol a 95 % (v/v) por 60 min, se centrifugó la mezcla a la misma velocidad por 5 min y el precipitado se resuspendió en 100 µL de amortiguador TE pH 7.5.

Haplotipos mitocondriales

Análisis estadístico

Los patrones aloenzimáticos se codificaron en una matriz de presencia y ausencia, se analizaron con el método UPGMA lo cual permitió la agrupación de los genotipos a partir de la población total, mediante el coeficiente Simple Matching (SM o coincidencias simples), en el programa NTSYS 2.2.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislamiento del patógeno

En los tres años de recolección se seleccionaron 88 aislamientos (Cuadro 1) y presentaron características morfológicas típicas de la especie, como micelio cenocítico, morfología del esporangio, evolución del anteridio y oogonio para formar la oos pora, y las diferencias de los flagelos de las zoosporas (pluma y látigo; Pérez y Forbes, 2008; Jaimasit y Prakob, 2010). En las pruebas realizadas en el ciclo 2008 no se observaron diferencias entre los aislamientos de hoja y tallo; por tanto, en los siguientes ciclos solamente se hicieron aislamientos del follaje.

Tipo de compatibilidad

Patrones aloenzimáticos

Los genotipos obtenidos se describieron en términos de la movilidad relativa de las bandas en un campo eléctrico, donde el alelo más común es el que presenta la movilidad de 100 (Hernández y Gómez, 2005). En el presente estudio se observó una gran cantidad de genotipos de aloenzimas en los aislamientos, identificándose los alelos 92, 100 y 122 para las peptidasas (Pep), y 86, 90,100, 111 y 122 para glucosa fosfato isomerasa (Gpi). El genotipo más frecuente presentó bandas 100/100 para Pep y 86/100 para Gpi. Al considerar el tipo de apareamiento junto con los alelos aloenzimáticos reportados, se identificaron 24 genotipos multilocus (Cuadro 2). De estos, sólo algunos no homotálicos se han reportado para el valle de Toluca (Godwin et al., 1992; Flier et al., 2003; Lozoya et al., 2005). Sin embargo, para los aislamientos homotálicos no se encontraron reportes; solamente el genotipo Gpi 100/100 y Pep 100/100 en Saltillo, Coahuila, el Gpi 100/100 en Polonia y Gpi 90/100 en Holanda (Gavino y Fry, 2002).

Ninguno de los genotipos identificados se puede ajustar a las clasificaciones actuales del patógeno, aunque hay muchos perfiles. La diversidad genotípica calculada para los aislamientos de Chapingo fue 1.8, usando el índice de Shannon, lo cual muestra una gran diversidad genética, a pesar de ser un valor menor al reportado para el valle de Toluca (Grünwald et al., 2001). Esta disminución se explica por el carácter homotálico de índole clonal presentado por la mayoría de los aislamientos de este estudio; sin embargo, la diversidad duplicó al 0.92 reportado para Chapingo (Goodwin, 1996), lo cual coincide con la afirmación de Gilchrist et al. (2009) de que al transcurrir el tiempo aumenta la diversidad en las poblaciones del patógeno. El alelo 122 de Gpi está presente en EE.UU. (Goodwin et al., 1995b), mientras que en México se encuentra en aislamientos heterotálicos y homotálicos (Grünwald et al., 2001; Fernández et al., 2005; Lozoya et al, 2005). El genotipo A1/A2 90/100 para Gpi fue reportado en Polonia, el genotipo A1,A2 100/100 Gpi y 100/100 Pep fue descrito para Saltillo, Coahuila, y el genotipo A1 86/100, 100/100 se identificó en Canadá y Perú, todos ellos durante la década de 1980 a 1990 (Gavino y Fry, 2002).

La diversidad genética observada en este estudio constata lo reportado para la región central de México en general, y ahora para el área de Chapingo, donde predomina la reproducción sexual del patógeno, se observó la gran heterogeneidad de las poblaciones de P. infestans en los 24 genotipos identificados a partir de 88 aislamientos en el área de estudio. Esto es muy semejante a las 15 variantes reportadas por Matuszak et al. (1994) a partir de 33 aislamientos de un solo campo de papa.

De los genotipos identificados en este estudio, se puede asociar el genotipo A1 86/100 Gpi, 100/100 Pep con el US-1; el genotipo A1 100/100, 92/100 se asoció con el US-5, (Gavino y Fry, 2002; Wangsomboondee et al., 2002) y con US-6 (Forbes et al., 1998). La diferenciación entre éstos se basa en fragmentos de restricción (RFLP). El genotipo identificado en Chapingo como A2 86/100, 100/100, sería el equivalente al CA-3. Otros genotipos tipo A2 se pueden asociar con el US-14 y US-8 (Goodwin et al., 1998). Sin embargo, la mayoría de genotipos no se integran a las clasificaciones actuales del patógeno (Cuadro 2), porque tanto el sistema de clasificación norteamericano "US" como otros sistemas sólo integran a genotipos heterotálicos, y aunque hay homotálicos en la región central de México, en Michoacán y en Saltillo, se han mencionado para Polonia y Holanda durante la década de 1980 y 1990 (Gavino y Fry, 2002, Fernández et al. 2005), pero sin incluir a los aislamientos encontrados en el presente estudio.

Los patrones de Gpi, Pep y grupos de compatibilidad se analizaron mediante el coeficiente Simple Matching (SM o coincidencias simples), en el programa NTSYS 2.2, el cual permitió la asociación de 24 grupos (genotipos) a partir de los 88 aislamientos estudiados (Cuadro 2).

Haplotipos mitocondriales

Extracción de ADN

Resultados mejores se obtuvieron con el método descrito por Griffith y Shaw (1998), porque se extrajo 140 hasta 400 ng µL ^—1, con una calidad de 1.7 hasta 1.9 (Abs 260/280). Por el contrario, con el método de Goodwin et al. (1992) se extrajo menor cantidad de ADN (11 a 200 ng µL^—1), y la calidad varió de 1.4 hasta 1.8 (Abs 260/280). También hubo mejores amplicones con el ADN obtenido con el primer método, por lo cual en los estudios posteriores se usó el método de Griffith y Shaw (1998).

Para los iniciadores P1 se obtuvo una amplificación monomórfica para todas las muestras y el resultado fue un fragmento de 1118 pb (Figura 1A). Para realizar la digestión del producto de P1 se empleó la enzima Hha I. El tamaño de los fragmentos fue de 211pb y 907 pb (Figura 1B). Estos fragmentos fueron similares a lo reportado por Griffith y Shaw (1998), asociándose con el haplotipo Ia o Ib.

Para los iniciadores P2 (F2, R2) hubo dos bandas, una claramente definida de 1070 pb, y otra poca intensa de 750 pb (Figura 2A). La digestión del fragmento de 1070 pb se realizó usando la enzima de restricción Msp I y se obtuvieron los fragmentos de 203 y 641 pb (Figura 2B), lo cual indicó una relación con el haplotipo Ia (Griffith y Shaw, 1998; Botez et al., 2007). Para lograr una mejor resolución de fragmentos de digestión y verificar que no se presentara la banda de 79 pb que mencionan Griffith y Shaw (1998) como ausente para este haplotipo, se hizo un corrimiento en un gel de poliacrilamida al 8 % en el que no se obtuvo dicha banda; este gel no se presenta en los resultados.

La amplificación del producto de P3 (F3, R3) también fue monomórfica en todas las muestras. El tamaño del producto amplificado fue 1308 pb (Figura 3A). Para su digestión se utilizó la enzima Eco RI y se obtuvieron bandas de 230 pb y 1078 pb (Figura 3B), las cuales se asociaron a los haplotipos Ia o Ib.

De acuerdo con los patrones de restricción de los cuatro fragmentos, el haplotipo se identificó como Ia, ya reportado para el centro de México (Gavino y Fry, 2002; Flier et al., 2003). Este haplotipo está relacionado con el linaje EC-3 y el tipo de apareamiento A1 y A2 (Adler et al., 2004; Gavino y Fry, 2002) y con el linaje EC-1 (Silva et al., 2009). Sin embargo, aquí se presentó tanto para los tipos A1, A2 como para homotálicos (A1/A2) con distintos genotipos aloenzimáticos.

Hay tres factores que favorecen y explican la gran diversidad genética de P. infestans en el altiplano central mexicano: 1) la presencia de grupos de compatibilidad sexual del microrganismo que favorece el intercambio genético (Grünwald et al., 2001); 2) la abundancia de especies silvestres del hospedante natural del oomiceto, el género Solanum, principalmente desde la sierra tarasca, en Michoacán, hasta los altos de San Cristóbal de las Casas, en Chiapas, donde el hospedero y el patógeno cohabitan y coevolucionan simultáneamente (Spooner et al., 2004); 3) el clima ideal de gran altitud (más de 1500 m) con temperaturas entre 10 y 20 °C y abundantes y confiables lluvias en el verano, con humedad relativa superior al 90 %, ideal para el desarrollo del tizón (Krause et al., 1975).

La variabilidad encontrada en la población del patógeno en Chapingo era predecible, pero esta diversidad no se había cuantificado. Este nuevo conocimiento puede servir para diseñar estrategias de manejo y control en la región, si en estudios futuros se asocia la variabilidad del patógeno con su resistencia a fungicidas. Además se evidenció la necesidad de establecer criterios de clasificación más amplios e incluyentes, que puedan ubicar a distintos genotipos detectados en el presente estudio y a los aislamientos homotálicos, debido a que los sistemas actuales (US para EE.UU.; EC para Ecuador; CA para Canadá) no los incorporan porque no se tienen en los lugares geográficos o países donde se diseñaron dichos sistemas.

CONCLUSIONES

La población de Phytophthora infestans recolectada en el presente estudio presenta gran diversidad genética en la zona de Chapingo, México (índice de 1.8), correspondiente a 24 genotipos de aloenzimas, con el haplotipo mitocondrial Ia y alta frecuencia de homotalismo. La mayoría de los perfiles identificados no coinciden con los de clasificaciones establecidas en otros países.

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