Estudio comparativo entre la cepa de Pediococcus acidilactici aislada del rumen de borregos y un consorcio de bacteria ruminales

Comparative estudio between strain Pediococcus acidilactici aisolated from rumen sheep and a ruminal bacteria group

Alejandro Ley de-Coss^1*, Consepción Arce-Espino¹, Mario A. Cobos-Peralta², David Hernández-Sánchez², René Pinto-Ruiz³

¹ Cuerpo Académico Ganadería Tropical Sustentable, Facultad de Ciencias Agrícolas Campus IV, Universidad Autónoma de Chiapas. Carretera Costera y Estación Huehuetán. 30660, Huehuetán, Chiapas. (aleycoss@gmail.com). *Autor responsable.

³ Facultad de Ciencias Agronómicas Campus V, Universidad Autónoma de Chiapas. Km 84.5, Carretera Tuxtla Gutiérrez-Villaflores. 30475. Villaflores, Chiapas.

Recibido: febrero, 2012.
Aprobado: junio, 2013.

Resumen

El objetivo de este estudio fue evaluar Pediococcus acidilactici (PA) in vitro para determinar la producción de ácido láctico, acético, propiónico y butírico, así como los cambios de pH, cuando se adiciona a un medio de cultivo con proporción alta de carbohidratos no estructurales. El diseño experimental fue completamente al azar, se evaluó el cultivo liofilizado de PA (T1) y se comparó con un consorcio de bacterias del fluido ruminal (FR). Los inóculos fueron adicionados a un medio de cultivo anaerobio con D-(+)-glucosa (5 %) más una dieta alta en energía; además se evaluó la adición de monensina (MO) y lasalocida (LA) al medio. Los medios se incubaron a 38 ±0.5 °C por 3, 6 y 12 h; al terminar cada periodo se evaluó la concentración de ácido láctico, ácidos grasos volátiles (AGV), pH, concentración de bacterias totales (BT) y bacterias ácido lácticas (BAL). Los resultados se evaluaron mediante el procedimiento GLM y una prueba de suma de rangos de Wilcoxon para las concentraciones de BT y BAL. La producción de ácido láctico en los medios inoculados con PA y FR sin ionóforos fue mayor (p≤0.05), pero no cambió el pH a las 12 h de incubación, aunque se redujo desde las 3 h en todos los tratamientos, incluyendo los de producción menor de láctico (p≤ 0.05), mientras que la producción de AGV totales fue similar entre tratamientos. La cantidad mayor (p≤ 0.05) de BT se encontró en los medios sin ionóforos inoculados con FR, comparado con los inoculados con PA; la mayor cantidad de BAL se encontró en los tratamientos sin ionóforos. Bajo estas condiciones P. acidilactici tuvo una actividad heterofermentativa produciendo cantidades similares de ácido láctico, acético, propiónico y butírico con respecto al FR, además fue sensible a los ionóforos usados.

Palabras clave: rumen, bacterias totales, bacterias ácido lácticas, ácidos grasos volátiles, ionóforos.

The objective of this study was to evaluate Pediococcus acidilactici (PA) in vitro to determine production of lactic, acetic, propionic and butyric acids, as well as changes in pH, when added to a culture medium with high proportion of non-structural carbohydrates. The experimental design was completely randomized, the lyophilized culture of PA (T1) was evaluated and compared with a group of bacteria of the rumen fluid (RF). The inocula were added to an anaerobic culture medium with D-(+ )-glucose (5 %), plus a high-energy diet; besides the addition of monensin (MO) and lasalocid (LA) to the medium was evaluated. Media were incubated at 38± 0.5 °C for 3, 6 and 12 h; after each period it was assessed the concentration of lactic acid, volatile fatty acids (VFA), pH, concentration of total bacteria (TB) and lactic acid bacteria (LAB). The results were analyzed using the GLM procedure and by Wilcoxon rank-sum test for TB and LAB concentrations. Lactic acid production was greater (p≤ 0.05) in the media inoculated with PA and RF without ionophores, but pH at 12 h of incubation did not change, although pH was reduced since 3 h in all treatments including those with lower production of lactic acid (p≤ 0.05), whereas production of total VFA was similar among treatments. The greatest amount (p≤ 0.05) of BT was found in the media without ionophores inoculated with RF, compared to those inoculated with PA; the greatest amount of LAB was found in treatments without ionophores. Under these conditions P. acidilactici had a heterofermentative activity producing similar amounts of lactic, acetic, propionic and butyric acids regarding RF; in addition it was sensitive to the ionophores used.

Key words: rumen, total bacteria, lactic acid bacteria, volatile fatty acids, ionophores.

INTRODUCCIÓN

Las técnicas de identificación por secuenciación del gen 16S rARN permiten reclasificar o identificar nuevas especies de bacterias en el fluido ruminal (FR; Hazlewood y Teather, 1988; Dehority, 2003). El género Pediococcus tiene actividad homofermentativa con producción de ácido láctico (Hardie, 1986). Pero Cobos et al. (2011) aislaron del rumen de borregos con acidosis ruminal (pH 5.8) una cepa de Pediococcus acidilactici con actividad heterofermentativa, la cual produjo in vitro ácido láctico, acético, propiónico y butírico a partir de la fermentación de D-(+)-glucosa; además, fue sensible a monensina y lasalocida. La población de bacterias ácido lácticas (BAL) ruminales aumenta cuando la dieta consumida por los rumiantes contiene una proporción alta de carbohidratos de fermentación rápida (Goad et al., 1998; Dehority, 2003), que son transformados por la actividad homofermentativa de las BAL en ácido láctico principalmente (Yokoyama y Johnson, 1993; Dehority, 2003; Cobos, 2007). Por tanto, el objetivo de este estudio fue comparar in vitro los productos finales de la fermentación de carbohidratos no estructurales entre la cepa no comercial de P. acidilactici, con actividad heterofermentativa reportada, y el de un consorcio de bacterias del FR obtenido de borregos criollos, así como la susceptibilidad a monensina y lasalocida, para definir un perfil metabólico de la cepa aislada.

MATERIALES Y MÉTODOS

Este estudio se desarrolló en el Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma de Chiapas, y en el Laboratorio de Microbiología Ruminal y Genética Microbiana del Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, Texcoco, México.

Cepa y medio de cultivo

Tratamientos

Los tratamientos fueron: 1) PA=P acidilactici, 2) FR=fluido ruminal, 3) PA+MO = PA+monensina sódica, 4) FR+MO = FR+monensina sódica, 5) PA+LA=PA+lasalocida sódica, 6) FR+ LA= FR+ lasalocida sódica. Las dosis de ionóforos fueron 30 y 40 mg kg ¹ de MS de monensina y de lasalocida. Para ello 250 mg de Rumensin^® (20 % monensina) y 200 mg de Bovatec^® (15 % lasalocida) fueron disueltos en 100 mL de una solución al 25 % de etanol; 20 ,µL de la solución con monensina y 26 µL de la solución con lasalocida se adicionaron al medio de cultivo de cada tratamiento.

Tubos de 18X150 mm (PIREX^®, México) con 0.2 g de una dieta concentrada (Cuadro 1) se esterilizaron 15 min en una autoclave (Felisa, FE-397, México) a 121 °C y 15 psi. Luego se adicionó, bajo flujo de CO₂, 9.5 mL de medio de cultivo G-FR estéril y se incubaron 24 h para detectar esterilidad. Los tubos estériles se inocularon por triplicado con 0.5 mL de la cepa rehidratada de PA o FR; los medios se incubaron a 38 °C por 3, 6 y 12 h. Al terminar cada periodo se evaluó pH, concentración de ácido láctico, acético, propiónico, butírico, bacterias totales (BT) y BAL. La cepa de PA fue activada al adicionar 0.1 g del liofilizado en 9.9 mL de medio de cultivo G-FR estéril sin fuente de carbohidratos, y se incubó 12 h a 38 °C. Previa evaluación del liofilizado con la técnica del número más probable (NMP; Harrigan y McCance, 1979) y conteo directo en la Petroff-Hausser (Hausser #3900, Electron Microscopy Sciences, USA), se determinó que 12 h fue el tiempo necesario para reactivar la cepa, la cual alcanzó una concentración de 10⁸ bacterias mL^-1 de medio de cultivo, que fue la concentración bacteriana de cada inóculo (PA y FR).

Las diluciones de PA y FR se realizaron con el mismo medio anaerobio, lo que permitió igualar la concentración para ambos inóculos. El FR se extrajo mediante sonda esofágica de dos borregos (35 kg PV) criollos 2 h después de comer (60 % Cynodon plectotaschyus y 40 % dieta concentrada) (Cuadro 1).

La curva de crecimiento de PA se obtuvo con la concentración de bacterias por mililitro de medio de cultivo. Para ello en tubos de 18X150 mm se rehidrató la cepa PA, usando la técnica descrita antes; luego, tubos de 13X100 mm con 4.9 mL de medio de cultivo G-FR fueron inoculados con 0.1 mL de la cepa rehidratada, se incubaron a 38 °C por 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0 y 4.5 h, y al terminar la incubación se tomó por triplicado una muestra (0.5 mL) de cada tubo para determinar la concentración de bacterias usando una cámara Petroff-Hausser con un área de 0.0025 mm², una profundidad de 0.02 mm y un microscopio de contraste de fases (Biológico BX51, Olympus, EE.UU.). La concentración bacteriana se calculó con la fórmula: concentración de bacterias = (promedio) (factor de dilución) (2X10⁷). La tasa de generación se determinó usando la formula N=N₀2ⁿ (1), donde N= número final de células, N₀= número inicial de células y n= número de generaciones transcurridas durante el periodo de crecimiento exponencial. Por tanto, el tiempo de generación (g) de la población bacteriana se calculó como t/n, donde t= tiempo y se determina con los datos de la fase de crecimiento exponencial, y n se calcula mediante una transformación logarítmica de la ecuación 1:

n = 3.3 [log N-log N₀] (Madigan et al, 2003).

Concentración de ácidos grasos volátiles (AGV)

Concentración de ácido láctico

Al terminar cada periodo de incubación (3, 6 y 12 h) y después de centrifugar, se mezcló 1 mL del sobrenadante con 1 mL de H₂SO₄ (Alquimia, 98 % pureza); 1 mL de esta mezcla se diluyó en 20 mL de agua bidestilada desionizada, se tomó 0.5 mL y mezcló con 3 mL de H₂SO₄ e incubó 10 min en agua a 100 °C. Cuando la temperatura de la muestra se redujo a 25 °C se adicionaron 50, µL de CuSO4-5H2O (Meyer) y 100, µL de p-fenilfenol (ACN, Aplicaciones Cientificas del Norte) y se mezclaron en un vortex. Las muestras reposaron 30 min y se midió la absorbancia a 570 nM en un espectrofotómetro UV-Vis (Lamda-40, Perkin-Elmer™, USA), calibrado con un método (r² = 0.99) de concentración de láctico (Kinberley yTaylor, 1996).

Variables microbiológicas

Al finalizar cada periodo de incubación (3, 6 y 12 h), 0.5 mL de medio de cultivo fue retirado de cada tratamiento e inoculado en un caldo a base de glucosa-celobiosa-almidón más FR (GCA-FR) para determinar la cantidad de BT, la cual se evaluó bajo flujo de CO₂ y esterilidad en tubos de cultivo mediante la técnica NMP. Los medios inoculados fueron incubados 24 h a 38 °C, tomando como positivos los medios que mostraron turbidez. La concentración de BAL se determinó en medio MRS (Bioxon), de acuerdo con De Man et al. (1960). El pH se ajustó a 6.4±0.02 con HCl 0.1 N (VWR) y se midió con un potenciómetro (Orion A250, Orion Research, Inc. USA). El medio MRS fue esterilizado 15 min a 121 °C y 15 psi, y se depositaron 4.5 mL de medio en tubos de cultivo (13X100 mm, PIREX^®, México). Los medios estériles se inocularon con 0.5 mL de medio de cultivo de los tratamientos, al finalizar cada tiempo de incubación. Después de agregar el inóculo los tubos se mantuvieron 24 h a 38 °C; los medios positivos fueron los que mostraron turbidez y la cantidad de BAL se determinó con la técnica de NMP.

Diseño y análisis estadístico

El diseño experimental fue completamente al azar. Los datos de concentración de ácido láctico y de AGV y pH de los medios de cultivo se analizaron con el procedimiento GLM de SAS. Para los datos de concentración de BT y BAL se usó la prueba de Kruskal-Wallis y el procedimiento GLM con datos de rangos independientes (Wilcoxon) de SAS (2001). Las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤ 0.05).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La cepa de PA y el consorcio de bacterias del FR fermentaron ácido láctico, acético, propiónico y butírico a partir de carbohidratos de rápida degradación (actividad heterofermentativa); sin embargo, según Garvie (1986), Hardie (1986) y Ennahar et al. (2003), Pediococcus es homofermentativa. Los resultados de esta investigación concuerdan con los publicados por Cobos et al. (2011), quienes reportan actividad heterofermentativa de esta cepa no comercial de P. acidilactici, la cual fue aislada del rumen de borregos, en las mismas condiciones de cultivo (temperatura y pH) reportadas por Fitzsimons et al. (1992). La cepa evaluada en este estudio tuvo un crecimiento exponencial de 1.5 a 2.0 h ^-1, similar al observado en un medio a base de D-(+ )-glucosa por Hardie (1986) y Kunene et al. (2000). Además, la tasa de generación fue 19 min, valor dentro del intervalo reportado por Garvie (1986) de 15 a 30 min para bacterias del género Pediococcus.

La concentración de ácido láctico (Cuadro 2) fue mayor (p≤0.05) durante las 12 h de incubación en los tratamientos inoculados con PA y FR sin ionóforos, mientras que en los tratamientos con ionóforos la cantidad de láctico fue menor (p≤0.05) en los medios inoculados con PA, debido a un posible efecto bacteriostático de estos compuestos. Además, en el consorcio de bacterias del FR, los ionóforos sólo afectaron a las BAL ya que hubo menos ácido láctico en los medios, sin afectar la cantidad de BT en las primeras 3 h (Cuadro 4). En medios inoculados con P. acidilactici la concentración de ácido láctico fue similar (17.07 mM L ^-1), pero se redujo hasta 80 % cuando se adicionaron ionóforos (Cobos et al., 2011).

Los resultados de este estudio indican que los ionóforos afectaron (p≤0.05) la producción de ácido láctico, lo cual es similar a lo reportado por Burrin y Britton (1986) y Coe et al. (1999) quienes encontraron que la adición de monensina (150 y 300 mg animal^-1 d^-1) redujo la cantidad de lactato (1.25 mM L^-1) en el rumen. Según Nagaraja et al. (1981), monensina y lasalocida (1.3 mg kg^-1 PV) previnieron una acidosis láctica (testigo, 519.5 mg dL^-1; monensina, 217.8 mg dL^-1; lasalocida, 15.5 mg dL^-1); sin embargo, aunque hubo mayor efecto bactericida con este ionóforo, la concentración molar de AGV aumentó y la relación acético/propiónico se redujo. Pero Knowlton et al. (1996a y 1996b) reportaron que 360 mg lasalocida animal ^-1 d^-1 no evitó el aumento de ácido láctico y la caída de pH. Esta variabilidad de resultados se puede atribuir a diversos factores; en sistemas de cultivo in vivo e in vitro, el efecto de monensina y lasalocida sobre los microorganismos del rumen y sus variables es afectado por la resistencia bacteriana (Dennis y Nagaraja, 1981; Russell y Strobel, 1989), presencia de nuevas BAL sensibles en el rumen (Cobos et al., 2011), dieta y tiempo de adaptación (Green et al., 1999; Mutsvangwa et al., 2002) y tiempo de muestreo después de comer (Goad et al., 1998).

No hubo diferencia (p>0.05) en el pH de los medios (5.1 ±0.46) a las 12 h de incubación entre los tratamientos, similar a lo reportado por Fitzsimons et al. (1992). Pero a las 3 y 6 h el pH fue diferente (p≤0.05) entre tratamientos PA, PA+MO y FR+ LA, y tratamientos PA, PA+ MO, FR+ MO y PA+ LA. Esto implica que la acumulación de ácido láctico (Cuadro 4) no redujo el pH en los medios con o sin ionóforos; así, posiblemente la acumulación de AGV u otro ácido orgánico no determinado en este estudio causó la disminución en el pH de los medios. Según Mutsvangwa et al. (2002) y Beauchemin et al. (2003), la incidencia de acidosis y reducción del pH no es causada por la acumulación de ácido láctico, sino por la concentración AGV totales en el medio. Martin (1998) señala que la mayor concentración de D y L láctico y el menor pH (4.27) ocurrió a las 36 h de incubación en los tratamientos sin ionóforos, pero no para los tratamientos con monensina y lasalocida, lo cual no coincide con esta investigación donde a las 12 h de incubación todos los tratamiento tenían pH similar.

Concentración de ácidos grasos volátiles

La cantidad de acético, propiónico, butírico y AGV totales a las 12 h de incubación no fue diferente (p> 0.05), resultado similar al reportado por Cobos et al. (2011) para AGV totales al adicionar P. acidilactici a un medio de cultivo con o sin monensina y lasalocida por 72 h. La adición de ionóforos al medio disminuyó la producción de láctico debido a la acción bacteriostática de éstos sobre las BAL en el FR y sobre P. acidilactici. La reducción de la producción de láctico con la adición de ionóforos debería aumentar la concentración de acético, propiónico, butírico y AGV totales en el medio (Martin, 1998; Dehority, 2003). Aunque estos cambios no ocurrieron en este estudio la actividad homofermentativa de P. acidilactici observada en este estudio y en los resultados reportados por Cobos et al. (2011) indicarían que esta cepa PA tuvo actividad heterofermentativa. Sin embargo, sólo se evaluó la producción de acido láctico, acético, propiónico y butírico, por lo cual se debe evaluar el perfil metabólico completo de la cepa aislada para determinar la variedad de ácidos orgánicos que podría estar produciendo.

No hubo diferencia (p> 0.05) entre la cantidad total de AGV producidos por P. acidilactici y por el consorcio de bacterias del FR. Al respecto, Cobos et al. (2011) señalan que la adición de monensina y lasalocida al medio de cultivo inoculado con P. acidilactici redujo la proporción acético: propiónico a las 72 h de incubación. Pero según Coe et al. (1999), la cantidad de AGV totales fue 104.7 contra 108.9 mM L^-1 entre un testigo y un tratamiento con monensina. En el presente estudio la relación acético: propiónico fue alta (> 4.3), lo cual contradice la reducción señalada por Coe et al. (1999) (Cuadro 3).

Variables microbiológicas

A las 3 h de incubación no hubo diferencia (p>0.05) en la concentración de BT entre los tratamientos inoculados con FR, y en los tratamientos inoculados con P. acidilactici la menor concentración se encontró en los medios con ionóforos. Después de 6 h de incubación hubo mayor concentración (p≤ 0.05) de BT en los medios inoculados con FR, incluso en los tratamientos sin ionóforos, pero no en los tratamientos con lasalocida. Los ionóforos redujeron la concentración de P. acidilactici, mientras que en el consorcio de bacterias del rumen el efecto fue menor. Este resultado coincide con el de Tung y Kung (1993), quienes indican que la monensina no afectó al consorcio bacteriano ruminal porque se mantuvieron los niveles de AGV, pero Callaway y Martin (1996) señalan que la monensina afectó la mezcla de bacterias ruminales inoculadas, ya que se redujo la producción de AGV y ácidos orgánicos.

Según Goad et al. (1998), hay cambios en la concentración inicial (>10⁹ bacterias mL^-1) de BT después de 24 h de incubación, mientras que en el presente estudio las concentraciones de BT fueron superiores a 10⁹ (Cuadro 4), excepto para los medios con P. acidilactici donde la concentración fue menor (p≤ 0.05) a las 12 h de incubación en los tratamientos con ionóforos y se observó el efecto bacteriostático sobre la cepa de PA. Además, cuando el inóculo fue FR, la concentración de BT fue superior a 10⁹, posiblemente por una sucesión bacteriana y un cambio de bacterias sensibles a los ionóforos por bacterias resistentes (Dennis y Nagaraja, 1981; Russell y Strobel, 1989).

CONCLUSIONES

Pediococcus acidilactici es una bacteria amilolítica con una actividad heterofermentativa que produjo cantidades similares de ácido láctico, acético, propiónico y butírico, respecto a un consorcio de bacteria procedentes de fluido ruminal. Además bajo estas condiciones de cultivo ambos inóculos acidifican un medio de cultivo que contiene carbohidratos de fermentación rápida, y aunque hubo sensibilidad bacteriostática a los ionóforos (monensina y lasalocida) que redujeron su proliferación, se produjeron metabólicos secundarios que bajaron el pH en todos los medio de cultivo con y sin ionóforos. Por tanto, la cepa de PA aislada del rumen de borregos debe ser evaluada considerando un perfil metabólico completo para determinar todos los productos de la fermentación de carbohidratos no estructurales.

AGRADECIMIENTOS

Este experimento fue patrocinado por la Secretaria de Educación Pública mediante el Programa de Mejoramiento del Profesorado (PROMEP) con el proyecto PROMEP/103.5/10/4666 con registro 06/AGV/PMP/070/11 intitulado "Plantas nativas con potencial uso forrajero que mitigan la producción de metano en el rumen".

LITERATURA CITADA

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