Actividad antifúngica de extractos crudos de Bacillus subtilis contra fitopatógenos de soja (Glycine max) y efecto de su coinoculación con Bradyrhizobium japonicum
Bacillus subtilis crude extracts with antifungal activity against soybean (Glycine max) phytopathogens and Bradyrhizobium japonicum coinoculation effect
Gabriela C. Sarti, Silvia S. Miyazaki*
Área de Agroalimentos. Departamento de Biología, Aplicada y Alimentos. Facultad de Agronomía. Universidad de Buenos Aires. Avenida San Martín 4453. C1417. * Autor responsable (miyazaki@agro.uba.ar).
]]>Recibido: febrero, 2012.
Aprobado: marzo, 2013.
Resumen
Entre los microorganismos causantes de enfermedades pre y post cosecha en los cultivos de soja (Glycine max) están las especies fúngicas Fusarium solani y Pythium sp. Cuatro cepas del género Bacillus (B. subtilis ATCC6633, B. amylolyticus, B. subtilis var. natto, B. subtilis var. natto domesticado) se probaron para evaluar su respuesta inhibitoria en los hongos fitopatógenos mencionados. Los tratamientos de inoculación fueron: 1) semillas inoculadas con Bradyrhizobium japonicum y 2) semillas coinoculadas con B. japonicum y B. subtilis. Las plantas crecieron en cámara de cultivo termos-tatizada a 30 ±1 °C, humedad relativa 60 % y fotoperíodo 16/8 luz-oscuridad durante 35 d. Los datos se analizaron mediante ANDEVA y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05). Las pruebas in vitro de la cepa B. subtilis ATCC6633 redujeron el crecimiento micelial de Fusarium solani (50 %) y Pythium sp. (47 %) respecto a los testigos. La coinoculación de B. japonicum y B. subtilis estimuló el crecimiento de la planta completa en 125 %, parte aérea 100 %, raíz 235 %, número de hojas 20 % y número de nódulos 88 % respecto al testigo. La cepa de B. subtilis ATCC6633 sintetizó metabolitos de naturaleza proteínica y otros con capacidad biosurfactante. Cuando la bacteria se cultivó en medio mínimo salino, glicerol 1 % y concentraciones de ácido L-glutámico entre 40 y 55 mM, se obtuvo la concentración mayor de metabolitos de naturaleza proteínica (35 µg proteína mL-1) y la mayor formación de biopelícula. La formación de la biopelícula, la presencia de biosurfactantes y la liberación de metabolitos antifúngicos, posicionan a esta bacteria en una situación competitivamente ventajosa en relación al resto de la microbiota de la rizósfera en la planta de soja.
Palabras clave: Bacillus subtilis, Fusarium solani, Pythium, Glycine max., antifúngico, coinoculación.
Abstract
Fungal species Fusarium solani and Pythium sp. are among the microorganisms causing diseases in pre and post harvest crop soybean (Glycine max). Four strains of the genus Bacillus (B. subtilis ATCC6633, B. amylolyticus, B. subtilis var. natto, B. subtilis var. natto domesticated) were tested to evaluate the inhibitory response of them on the phytopathogenic fungi previously mentioned. The inoculation treatments were 1) seeds inoculated with Bradyrhizobium japonicum, and 2) seeds coinoculated with B. japonicum and B. subtilis. Plants were grown in a thermostated culture chamber at 30±1 °C, 60 % relative humidity and 16/8 light-dark photoperiod for 35 d. Data were analyzed by ANOVA and means were compared by applying the Tukey test (p≤0.05). The in vitro assays of the strain B. subtilis ATCC6633 reduced the mycelial growth of Fusarium solani (50 %) and Pythium sp. (47 %) compared to controls. The coinoculation of B. japonicum and B. subtilis stimulated the growth of the whole plant by 125 %, 100 % aerial part, 235 % root, 20 % number of leaves, and 88 % nodule number compared to control. The strain B. subtilis ATCC6633 synthesized metabolites of proteinaceous nature and others with biosurfactant capacity. When the bacteria were grown in minimal saline medium, glycerol 1 % and concentrations of L-glutamic acid between 40 and 55 mM, the highest concentration of proteinaceous metabolites (35 µg protein mL-1) was obtained and increased biofilm formation. Biofilm formation, the presence of biosurfactants and the release of antifungal metabolites positioned this bacterium in a situation competitively advantageous compared to the rest of the microbiota of the rhizosphere in the soybean plant.
]]> Keywords: Bacillus subtilis, Fusarium solani, Pythium, Glycine max., antifungal, coinoculation.
INTRODUCCIÓN
La demanda global de alimentos ha cambiado en los últimos 62 años al casi triplicarse la población mundial de 2500 millones en 1950 a 7000 millones en el 2012. Este problema aumentará ya que se proyecta un aumento de 38 % de la población mundial para el 2050. Este factor impulsa la demanda de alimentos como la soja (Glycine max) y sus derivados. Así, en Argentina, la superficie ocupada con este cultivo disminuyó la diversidad productiva y desplazó al girasol (Helianthus annuus), maíz (Zea mays), algodón (Gossypium hirstium), arroz (Oryza sativa) y sorgo (Sorghum vulgare). Actualmente es el tercer país productor de aceite y harina de soja en el mundo y el primer exportador de aceite y harinas de girasol y soja (Satorre, 2003; Villela etal., 2009).
La soja produce semillas con alto contenido proteínico y la práctica de cultivo para lograrlo es la inoculación con bacterias fijadoras de nitrógeno, en la cual intervienen microorganismos de los géneros Bradyrhizobium o Sinorhizobium. El sistema de cultivo en una vasta área de Argentina es la siembra de soja sobre soja (cultivo de siembra sin rotación), aumentando el desarrollo de las enfermedades de pre y post cosecha ("dumping-off"). El dumping off está causado por un complejo de hongos del suelo, tales como Pythium sp. Phytophthora sojae, Fusarium sp, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii y Phomopsis sp.
El costo de los agroquímicos y la demanda de productos libre de los mismos por los consumidores impulsó el desarrollo de nuevas tecnologías más amigables con el ambiente, como el control biológico (Compant et al., 2005; Siddiqui, 2006). Entre los grupos bacterianos más estudiados como biocon-troladores están las bacterias del género Bacillus que colonizan agua, aire y suelos. Bacillus subtilis no es patogénico o toxicogénico para humanos, animales o plantas, y produce moléculas bioactivas que tienen una fuerte capacidad antibiótica y antifúngica (Ongena et al., 2005; Sansinenea y Ortiz, 2011). Según las condiciones de cultivo, algunos miembros de este género bacteriano producen biopelículas, las cuales representan una comunidad interdependiente y pueden estar conformadas por una sola especie o una comunidad derivada de múltiples especies, que pueden adherirse sobre una gran variedad de superficies bióticas y abióticas (Rudrappa et al., 2008; Monds y O'Toole, 2009). Además de la masa microbiana, la biopelícula está constituida por una matriz de exopolisacáridos, proteínas y ácidos nucleicos (Stanley y Lazazerra, 2005). Esta biopelícula interviene en la inducción y la acumulación de lipopéptidos que cumplen funciones diversas; algunos poseen actividad antibacteriana y antifúngica (Rahman y Ano, 2009). Por tanto, los objetivos de este estudio fueron: 1) seleccionar una cepa bacteriana capaz de inhibir in vitro el desarrollo de los fitopatógenos Fusarium solani y Pythium sp. y cuya coinoculación con Bradyr-hizobium japonicum no disminuya la simbiosis con la leguminosa, y 2) determinar la concentración óptima de ácido L- glutámico para producir proteínas con actividad antifúngica y formación de biopelícula.
MATERIALES Y MÉTODOS
Experimento de antibiosis
Para estos experimentos se usaron las bacterias Bacillus subtilis ATCC6633 (de distribución común), Bacillus amylolytycus FA 13, Bacillus subtilis var natto FA 23, Bacillus subtilis var natto domesticado, Bradyrhizobium japonicum (Rizo-liq, Rizobacter) y los hongos fitopatógenos Fusarium. solani y Pythium sp. Los microorganismos son del cepario AGRAL FAUBA. Los hongos F. solani y Pythium sp. se cultivaron en medio agar papa glucosado y se extrajeron discos de 5 mm de diámetro que se colocaron en placas con agar nutritivo a 25 °C por 3 d. Después las placas fueron sembradas con una estría de los diferentes cultivos de Bacillus en su fase logarítmica a 45 mm de distancia del disco con el hongo en estudio. Los testigos fueron las placas no inoculadas con las bacterias. Las pruebas se realizaron por triplicado para cada bacteria durante 14 d.
]]>Experimentos de coinoculación
Preparación de los inóculos bacterianos
Bradyrhizobium japonicum creció en caldo YM (Somasegaran y Hoben, 1985) y B. subtilis en caldo Tripteína Soja a 30 °C, ambos con agitación a 100 rpm por 72 h. Una concentración de 1×108 UFC mL-1 de cada bacteria fue usada para embeber las semillas germinadas (Molla et al., 2001).
Condiciones de cultivo y experimento de coinoculación en plantas de soja
Una solución libre de nitrógeno fue usada: KH2PO4 1 mM, K SO 1.4 mM y CaCl H O 1 mM; y 2 mL L-1 de medio de una solución de micronutrientes conteniendo [(g L-1) (MgSO4 7H2O 13.5; MnSO4 4H2O 8.5; ZnSO4 7 H2O 1.5; CuSO4; 5H2O 0.8; H3BO3 0.5; CoSO4 7H2O 0.3; Na2MoO4 2H2O, 0.15] y 1.7 mL de 3 µM Fe EDTA pH 6.5. El experimento se realizó en tubos (15 cm x 2.2 cm) con una mezcla de perlita vermiculita 30:70, y en cada tubo se agregaron 20 mL de la solución anterior y se depositó en la superficie una semilla germinada por cada tubo.
Los tratamientos fueron: 1) semillas inoculadas con B. japonicum (10 tubos), y 2) semillas coinoculadas con B. japonicum y B. subtilis ATCC6633 (10 tubos). Las plantas crecieron 35 d en cámara de cultivo termostatizada a 30 ± 1 °C, humedad relativa 60 % y un fotoperíodo 16/8 luz-oscuridad. Los experimentos se realizaron por triplicado para cada tratamiento.
Medición de la actividad antifúngica de los sobrenadantes bacterianos
Bacillus subtilis ATCC6633 creció en un medio mínimo salino conteniendo K2HPO4 30 g, KH2PO4 10 g, NH4Cl 5 g, NH4NO3 1 g, Na2SO4 1 g, MgSO4 7H2O 0.1g, MnSO44H2O 0.01 g, Fe SO47H2O 0.01g, CaCl2 0.00 5 g. csp 1000 mL pH 6.8-7. Esta solución se diluyó 1:10 y se agregó EDTA (0.01g) L-1, glicerol 1 % y 35 mM de ácido L-glutámico a 30 °C durante 144 h. Porciones del sobrenadante se tomaron cada 24 h, centrifugadas 10 min a 13 000 g, filtradas y liofilizadas. El residuo seco fue resuspendido en 3 mL de agua destilada para evaluar poder antifúngico. El mismo procedimiento se usó para cuantificar proteínas totales (Bradford, 1976), se usó el mismo medio salino descrito con glicerol 1 %, y diferentes concentraciones de ácido L-glutámico a 30 °C por 96 h.
Experimentos de actividad antifúngica
]]> La actividad antifúngica de los sobrenadantes bacterianos (extracto crudo libre de células) se realizó con el método de difusión en agar sobre discos de papel. El disco de agar papa glucosado (5 mm diámetro) con el hongo F. solani o Pythium sp. se colocó en el centro de placas de petri con medio agar papa glucosado. Un disco de papel filtro (10 mm diámetro) se colocó a 2 cm de cada uno de los hongos y asépticamente se impregnó en tres repeticiones con 20 flL del residuo seco resuspendido en agua destilada. Como testigo se usó papel de filtro con agua destilada estéril y las placas fueron incubadas 14 d a 25 °C.Cuantificación de la biopelícula
Las placas de 96 pocillos con cultivos de 24 h de un medio mínimo salino, glicerol 1 % y las siguientes concentraciones de ácido L-glutámico, se incubaron 24 h a 30 °C: 3.5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 y 80 mM. Después se cuantificó la biopelícula formada con la técnica de tinción con cristal violeta en microplacas (lectora BIOTEK), absorbancia a 570 nm (O'Toole y Kolter, 1998).
Poder biosurfactante de Bacillus subtilis ATCC 6633
La capacidad desestabilizante de las membranas biológicas se determinó usando placas de agar sangre preparadas con 5 mL de medio mínimo con glicerol y L-glutámico y 0.5 mL de sangre bovina en agar. Se realizó una estría de la bacteria sobre las placas y se incubó 48 h a 30 °C (Nakano et al., 1988).
Diseño experimental y análisis estadístico
El diseño experimental fue completamente al azar con los tratamientos: 1) semillas inoculadas con B. Japonicum, y 2) semillas coinoculadas con B. japonicum y B. subtilis. Los resultados fueron analizados mediante ANDEVA y se usó la prueba de Tukey (p≤0.05) para comparar las medias de los tratamientos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Selección de cepas bacterianas con actividad anti-fúngica contra Fusarium solani y Pythium sp.
]]> Dos de las cuatro cepas del género Bacillus (Cuadro 1) redujeron (p<0.05) el crecimiento (diámetro de la colonia) de los hongos patógenos F. solani y Pythium sp., B. subtilis ATCC 6633 en 50 y 47 %, y B. subtilis var natto en 31 y 23 %. Los resultados evidencian el elevado potencial de las bacterias del género Bacillus para el control biológico in vitro de numerosos hongos fitopatógenos, el cual ha sido reportado por Ongena et al. (2005), Wang et al. (2007) y Ghasemi et al. (2010) a través de diferentes mecanismos de biocontrol.Efecto de la coinoculación de Bradyrhizobiun japonicum y Bacillus subtilis ATCC6633 sobre planta entera de soja, parte aérea, raíces y nodulación
La cepa B. subtilis ATCC6633 tiene actividad biocontroladora in vitro y además actuó sinérgicamente con Bradyrhizobium japonicum (Figuras 1 y 2). La coinoculación de B. subtilis con B. japonicum benefició la infectividad de esta última, aumentando el número de nódulos en las raíces de las plantas de soja. Dicho aumento favoreció el desarrollo de la parte radicular y aérea de la planta, con un aumento en el crecimiento de la planta completa 125 %, parte aérea 100 %, raíz 235 %, número de hojas 20 % y número de nódulos 88 %, respecto al testigo.
En la coinoculación de B. japonicum con B. sub-tilis ATCC6633 aumentó el número de nódulos y el peso de la raíz aumentó 235 %, mostrando que la coinoculación con B. subtilis ATCC6633 actuó también potenciando la efectividad de B. japonicum. En un estudio de coinoculación con diferentes Bacillus y B. japonicum 532C sobre plantas de soja en invernadero y a campo con diferentes temperaturas, la infectividad y efectividad fue sólo 34 % mayor que el testigo con respecto al número de nódulos por planta y 30 % con respecto al peso de la raíz por efecto de la presencia de Bacillus, y una mayor infectividad provocada por la coinoculación (Bai et al., 2003). Según Correa et al. (2009), la coinoculación con B. amyloliquefaciens BN M122 sólo tiene una actividad biocontroladora contra fitopatógenos de soja y no se encontró ninguna actividad sinérgica bajo dichas condiciones de trabajo.
Poder antifúngico de los sobrenadantes bacterianos
Los metabolitos con poder antifúngico producidos por esta bacteria se extrajeron en fase acuosa y no se observó actividad antifúngica en extractos no acuosos (extracciones con acetato de etilo).
]]> La mayor inhibición del crecimiento micelial en placa de los hongos F. solani y Pythium sp. corresponde al extracto crudo (sobrenadante bacteriano) obtenido a las 96 h de cultivo. Este poder inhibitorio se correlaciona con la fase estacionaria de la curva de crecimiento del cultivo (Figura 3). Cuando el sobrenadante corresponde a cultivos de más de 120 h (fase estacionaria tardía) el desarrollo del micelio fúngico aumenta.Gordillo et al. (2009) señalan que el Bacillus sp. IBA33 produce metabolitos activos antifúngico hasta las 72 h de cultivo; después hay sustancias inactivas aún en su fase estacionaria de crecimiento. En Bacillus ATCC6633 los metabolitos son activos hasta las 120 h con un pico de actividad a las 96 h; después de 120 h la bacteria inició su etapa de esporulación, orientando su metabolismo energético a tal fin y no sintetiza metabolitos antifúngicos activos.
Crecimiento y liberación de proteínas con poder antifúngico en Bacillus subtilis
La mayor liberación de proteínas de los cultivos en fase estacionaria se observó con las concentraciones de ácido L-glutámico de 40 a 65 mM (Figura 4). Cuando la concentración de proteínas fue mayor de 30 mg mL-1 se produjo la inhibición más alta del desarrollo del micelio de F. solani y Pythium sp con radios de crecimiento fúngicos de 16 y 15 mm (Figura 5). Según Araújo et al. (2005), Kavita et al. (2005) y Sun et al. (2006), para obtener péptidos con actividades antifúngicas contra distintos fitopatógenos las bacterias debieron crecer en medios complejos. En el presente estudio B. subtilis ATCC6633 sólo utilizó una única fuente carbonada de tres carbonos como glicerol y sales minerales para la síntesis de proteínas con alta actividad antifúngica, mostrando un mecanismo metabólico más complejo para la síntesis de metabolitos activos.
Concentración óptima de L-glutámico para la formación de la biopelícula en un cultivo de Bacillus subtilis
Concentraciones de ácido L-glutámico entre 35 y 55 mM causaron la mayor formación de biopelícula, coincidiendo con el pH final más bajo, de 5.5 (Figura 6). Valores de pH cercanos a la neutralidad conforman una película fina fácilmente disgregable (datos no mostrados).
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Morikawa et al. (2006) utilizaron como fuente carbonada glicerol y ácido L- glutámico, debieron incorporar sales de manganeso en el medio de cultivo para obtener la biopelícula y no consideraron la regulación de pH. En B. subtilis ATCC6633 el control del pH fue un factor crucial para la producción de una biopelícula estable y no fue necesario incorporar sales de manganeso u otro catión para la formación de la misma, lo cual indicaría que las enzimas involucradas no son metalo dependientes.
Capacidad de Bacillus subtilis como desestabilizante de membranas biológicas
Bacillus subtilis ATCC6633 liberó moléculas con capacidad hemolítica, lo cual fue evidente por la destrucción del grupo hemo y consecuente desaparición del color rojo característico de la hemoglobina de los glóbulos rojos en el medio de cultivo (el cual contenía sangre bovina) (Figura 7). Esto sugiere que se liberaron sustancias con propiedades biosurfactantes que acompañaron a la formación de una biopelícula gruesa. La cepa B. subtilis 168 cultivada en medio estático produce una biopelícula delgada y frágil y al incorporar los genes que sintetizan lipopéptidos con propiedades surfactantes y antibióticas, la bacteria transformada B. subtilis RM/iSd16 produce una bio-película más gruesa (Rahman et al., 2007). Esto indica que la formación de biosurfactantes en B. subtilis 168 RM/iSd16 y en B. subtilis ATCC6633 estaría comprometida en la arquitectura de la biopelícula.
CONCLUSIONES
La coinoculación de Bacillus subtilis ATCC6633 con la cepa Bradyrhizobium japonicum aumentó su infectividad y efectividad, sin interferir en el proceso de fijación biológica de nitrógeno en plantas de soja (Glycine max) cultivadas in vitro. Bacillus subtilis ATCC6633 en experimento de antibiosis presentó actividad antifúngica contra los fitopatógenos Fusa-rium solani y Phytium sp. Estos hongos proliferan en los cultivares de soja por la implementación del sistema de cultivo de siembra sin rotación.
]]> En el extracto crudo proveniente de un medio mínimo salino cuya única fuente carbonada fue glice-rol 1%, la óptima producción de moléculas proteicas con actividad antifúngica y formación de biopelícula se logró ajustando la concentración del aminoácido L-glutámico entre 40 y 55 mM.En Bacillus subtilis ATCC6633, la presencia de biosurfactantes estaría involucrada en la formación de una biopelícula gruesa y estable lo cual, junto con la liberación de moléculas proteicas antifúngicas posicionan a esta bacteria en una situación ventajosa en relación a la competencia que existe en la microbiota del suelo.
LITERATURA CITADA
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