Células troncales mesenquimales: biología, caracterización y futuras aplicaciones en salud y producción de especies domésticas y pecuarias. Parte II

Mesenchymal stem cells: biology, characterization and future applications to animal health and production of domestic species and livestock. Part II

Rosa M. Pérez–Serrano¹, Jesús J. Ramírez–Espinosa¹, Armando Shimada², Anaid Antaramian³, Enrique Piña⁴, Ofelia Mora^2,1*

¹ Programa de Posgrado en Ciencias de la Producción y de la Salud Animal, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). México.

² Laboratorio de Rumiología y Metabolismo Nutricional (RuMeN). Facultad de Estudios Superiores–Cuautitlán, UNAM. Blvd. Juriquilla 3001, Querétaro, estado de Querétaro. 76230, México. *Autor responsable (ofemora66@unam.mx).

⁴ Facultad de Medicina, UNAM. Circuito Interior, Ciudad Universitaria, Av. Universidad 3000, D. F. 0451, México.

Recibido: septiembre, 2011.
Aprobado: julio, 2012.

Resumen

Las células troncales mesenquimales poseen capacidad proliferativa alta y potencial de diferenciarse a diversos linajes celulares. Estas cualidades las hacen un modelo biológico idóneo en el estudio y desarrollo de herramientas biotecnológicas para su uso en la medicina veterinaria y en la zootecnia. En este artículo se analiza la información disponible sobre las células troncales mesenquimales de especies domésticas y se discuten posibles usos actuales y futuros en la medicina veterinaria y la zootecnia en ingeniería y regeneración de tejidos, tratamiento de enfermedades crónicas, generación de animales con mejores características productivas, reproducción asistida de animales genéticamente superiores o en peligro de extinción y mejor entendimiento de los procesos de desarrollo y metabolismo tisular de las especies domésticas.

Palabras clave: células troncales mesenquimales, médula ósea, diferenciación celular, multipotencialidad, producción animal, terapia celular.

Mesenchymal stem cells are highly proliferative and have the potential to differentiate into several cell lineages. These qualities make them an ideal biological model in the study and development of biotechnological tools for use in veterinary medicine and animal production. This paper reviews the information available on mesenchymal stem cells in domestic species and their possible uses, present and future, for veterinary medicine and animal production: engineering and tissue regeneration, treatment of chronic diseases, generation of animals with better production characteristics, assisted reproduction of genetically superior animals or of endangered species and better understanding of the processes of tissue development and metabolism of domestic species.

Key words: mesenchymal stem cells, bone marrow, cell differentiation, multipotency, animal production, cell therapy.

INTRODUCCIÓN

Desde el descubrimiento de las células troncales en la década de 1950 y la identificación y caracterización posterior de las células troncales mesenquimales (CTM) se ha generado gran cantidad de información e investigación sobre la biología y las posibles aplicaciones de estas células, centrándose a la salud humana, y usando como modelos ratas y ratones o al propio humano. En otras especies domésticas la investigación se ha limitado principalmente en casos en los que alguna especie es un modelo compatible con la fisiología normal o algún padecimiento humano. La existencia de estos modelos ha promovido el estudio, aislamiento y caracterización de células mesenquimales de médula ósea (MO) de las principales especies de interés veterinario y pecuario (Cuadro 1).

Debido a su capacidad proliferativa alta y de diferenciación a diversos tejidos, las CTM se usan experimentalmente para evaluar el efecto de la terapia celular sobre infarto e isquemia de miocardio (Huang et al., 2006; Gandolfi et al., 2011), reconstrucción de válvulas cardiacas, degeneración de discos intervertebrales, reparación de fracturas, reemplazo de cadera, lesiones en médula espinal (Jung et al., 2009) o esclerosis (Bonfield et al., 2010).

Caracterización de células troncales mesenquimales de médula ósea de especies domésticas

Caninos

Csaki et al. (2007) caracterizaron CTM de MO de perro y encontraron una reacción positiva a los marcadores de CTM CD105 y CD90 y negativa para los marcadores de células hematopoyéticas (CH) CD34 y CD45. Además diferenciaron las células aisladas a osteocitos, condrocitos y adipocitos. En ese estudio, las células diferenciadas a condrocitos se observaron ordenadas en nódulos con células redondeadas en el centro y células de morfología fibroblastoide en la periferia, similar a la morfología del cartílago in vivo.

Martin et al. (2002) aislaron y caracterizaron CTM de MO felina y la frecuencia de esas células fue 1 en 4.7 × 10⁴ a 1 en 5.9 × 10⁵ células del total de células aisladas. Las células expresaron los marcadores de CTM CD9 y CD44 y fueron negativas para el marcador de CH CD45, además de diferenciar estas células a adipocitos y osteocitos. Quimby et al. (2011) reportan resultados similares con esta especie para la diferenciación a adipocitos y osteocitos, y también a condrocitos.

Equinos

En equinos, Vidal et al. (2006) determinaron la capacidad de proliferación y diferenciación de las CTM y el tiempo de duplicación celular fue 1.4±0.26 d, alcanzando 30 ±2.4 duplicaciones celulares para el décimo pasaje. Asimismo, se diferenciaron las CTM aisladas a los linajes adiposo y óseo.

Porcinos

Las células mesenquimales de MO de los porcinos incrementan su número a un ritmo regular hasta el décimo pasaje y en los pasajes subsecuentes disminuye hasta el décimo quinto pasaje, cuando el crecimiento celular se detiene, alcanzando alrededor de 40 duplicaciones (Colleoni et al., 2005). Las células aisladas mostraron capacidad de diferenciación adiposa y ósea, mientras que cultivos tratados con 5' azacitidina, además de presentar acúmulo de gotas lipídicas formaban multicapas en el cultivo y algunas células presentaron vacuolas en su citoplasma, las cuales indican diferenciación adiposa en estas células. Otras tratadas con el mismo reactivo se observaron bi o multinucleadas, además de expresar el gen para la cadena pesada de miosina, un marcador de la diferenciación muscular (Colleoni et al., 2005).

Las CTM de muestras de MO pre y posnatales poseen una capacidad de proliferación superior a las 30 duplicaciones celulares (Zeng et al., 2006). Un hallazgo importante fue que algunas de las clonas aisladas de muestras prenatales expresan Oct3/4, un factor de transcripción de gran importancia en el mantenimiento de la pluripotencialidad de las células durante la etapa embrionaria (Abu–Remaileh et al., 2010), y dicha expresión se mantiene estable aún después de 90 duplicaciones celulares en estas clonas. Las células aisladas por Zeng et al. (2006) mostraron capacidad de diferenciarse a una amplia gama de linajes celulares: adipocitos, condrocitos, osteocitos, células musculares lisas, células endoteliales, hepatocitos y células del neuroectodermo.

Ovinos y caprinos

En caprinos, Quintavalla et al. (2002) observaron la capacidad de diferenciación condrogénica y osteogénica de células de la MO. Además, Eslaminejad et al. (2007, 2009) evaluaron la capacidad de proliferación y diferenciación de las CTM de MO de ovinos y caprinos. Ellos encontraron que las células aisladas de ambas especies tienen capacidad osteogénica, adipogénica y condrogénica, mientras que el tiempo de duplicación celular fue 24.94±2.67 h para caprinos y 24.9 h para ovinos.

Según McCarty et al. (2009), la abundancia de CTM con muestras obtenidas de ovinos adultos fue 4.6±0.7 células por cada 1 × 10⁵ células mononucleares, que expresan los marcadores de CTM: CD44, CD166 y CD29 y poseen capacidad osteogénica, condrogénica y adipogénica y carecen de la expresión de los marcadores Stro–1, CD146, CD90, y CD105 de CTM, y CD14, CD31 y CD45 de CH.

En bovinos, Colleoni et al. (2005) determinaron que las células aisladas se pueden duplicar 50 veces. Las CTM aisladas tenían capacidad osteogénica, mientras que cultivos tratados con 5' azacitidina mostraron capacidad adipogénica (presencia de gotas lipídicas) y miogénica (expresión de cadena pesada de miosina). Según Bosnakovski et al. (2005), las CTM de bovinos poseen capacidad osteogénica, condrogénica y adipogénica, además de características morfológicas particulares de estos linajes. Los cultivos diferenciados a osteocitos tenían una morfología cuboidal, las células tratadas con medio condrogénico mostraron morfología redondeada y un aumento en la densidad celular con formación de multicapas, y las células diferenciaciadas a adipocitos tenían vacuolas lipídicas.

Aves

Los estudios son escasos y centrados principalmente en pollos. Khatri et al. (2009) caracterizaron CTM aisladas de MO de pollo y mediante PCR encontraron la expresión de los marcadores de superficie CD44, CD90, CD105 y de los factores de transcripción PouV (homólogo a Oct4 de mamíferos), Sox2 y Nanog que controlan el desarrollo y diferenciación de las CTM. Estos investigadores indujeron la diferenciación a los linajes adiposo, cartilaginoso y óseo.

Estos estudios muestran la caracterización parcial de las CTM de MO de diferentes especies. En este sentido, la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT) sugiere los criterios mínimos para las células aisladas: 1) capacidad de adherencia al plástico, 2) expresión de marcadores de identidad y 3) potencial de diferenciación a adipocitos, osteocitos y condrocitos (Dominici et al., 2006).

Respecto a la capacidad de adherencia y potencial de diferenciación, todas las especies domésticas estudiadas comparten estas características con los modelos de roedores (rata y ratón) y humano. Sin embargo, respecto a la expresión de marcadores los datos obtenidos de especies pecuarias son inconclusos. La ISCT sugiere que las CTM deben expresar por lo menos los marcadores CD105, CD90 y CD73, pero en especies pecuarias sólo se reportan algunos de estos marcadores y otros más asociados a las CTM.

En contraste, Rozemuller et al. (2010) con un panel de 43 anticuerpos probados en mono, caprinos, ovinos, porcinos y caninos determinaron que todos ellos reaccionan positivamente a los anticuerpos CD271, W8B2, W4A5, CD56, W3C4 (CD349), W5C4 y 58B1, pero McCarty et al. (2009) no encontraron expresión de CD90 y CD105 en ovinos. En estos experimentos se usaron anticuerpos diseñados para reaccionar a los antígenos de humanos o roedores, lo cual puede explicar la falta de reactividad en otras especies. Es necesario diseñar anticuerpos específicos para cada especie, así como una caracterización más completa de la expresión de diferentes marcadores asociados a las CTM para determinar los patrones de expresión de las especies estudiadas. La expresión de factores de transcripción (Oct3/4, Nanog o Sox2) indica multipotencialidad en las células aisladas y es una característica que se debe determinar en estas especies porque permitiría una mejor identificacón de las CTM de MO. Esto se ha determinado en aves (Khatri et al., 2009) y equinos (Violini et al., 2009), pero está pendiente en otras especies pecuarias.

Aplicaciones de las CTM de MO en medicina veterinaria y zootecnia

La información generada en los estudios de las CTM de las especies domésticas respecto a su capacidad de proliferación y diferenciación, abre posibilidades para el tratamiento de traumatismos, enfermedades inflamatorias y crónico degenerativas, la generación de animales más eficientes o resistentes a enfermedades, una mayor comprensión del desarrollo y diferenciación de los tejidos muscular y adiposo, así como la conservación y preservación de especies silvestres y razas de especies domésticas en peligro de extinción.

Terapéutica

En caninos hay estudios sobre el uso de CTM de MO y tejido adiposo en casos clínicos de osteoartritis del codo y de la articulación coxofemoral (Black et al., 2007, 2008). En el primer estudio se trataron 14 perros de diferentes razas con CTM de tejido adiposo en la articulación del codo. Un seguimiento de seis meses de la evolución de la discapacidad para desplazarse mostró una mejora de 34 ± 4.7 %.

Además de estas aplicaciones de la terapia con células mesenquimales y dado que los animales de compañía padecen enfermedades similares a las del ser humano, se investiga su uso en diabetes, cardiomiopatías (Minguell et al., 2010), lesiones en médula espinal (Olby, 2010), enfermedades inmunológicas, lesiones en piel y mucosas (El–Menoufy et al., 2010; Hall et al., 2010) y enfermedad renal crónica (Quimby et al., 2011). Las investigaciones sobre el uso terapeútico de las CTM en animales de compañía y equinos es escasa pero sus resultados son positivos. Al igual que en la caracterización de las CTM, se requiere desarrollar y usar modelos específicos para desarrollar las estrategias adecuadas del uso de CTM en la medicina veterinaria.

Producción pecuaria

Desarrollo y metabolismo de músculo y tejido adiposo

Hoy se conocen los mecanismos básicos del desarrollo de ambos tejidos en modelos murinos y humanos (Buckingham et al., 2003; Chargé y Rudnicki, 2004; Rosen y MacDougald, 2006). Los estudios del desarrollo y diferenciación de células musculares y adiposas en especies pecuarias se enfocan principalmente a sus precursores celulares inmediatos, las células satélite y los preadipocitos (Hausman et al., 2009; Dodson et al., 2010) o bien al desarrollo y expresión génica de estos tejidos durante el periodo fetal (Davoli et al., 2011) y posnatal (Ropka–Molik et al., 2011).

El estudio in vitro de la capacidad de diferenciación de CTM provenientes de especies pecuarias hacia células musculares y adiposas permitirá conocer los mecanismos y factores implicados en el desarrollo de estos tejidos, usando como modelo células multipotentes como las CTM que se encuentran en un estado indiferenciado y no comprometidas a un linaje celular definido como es el caso de las células satélite y los preadipocitos.

El conocimiento de los eventos que conducen a la diferenciación muscular o adiposa en las CTM permitirá desarrollar técnicas y compuestos para manipular la diferenciación de estos tejidos desde etapas tempranas del desarrollo, o estimular la diferenciación de células quiescentes presentes en los tejidos. El uso de las CTM como modelo de adipogénesis y miogénesis permitirá la evaluación de componentes no nutricionales (fitoquímicos) de las dietas de los animales y de sustancias sintéticas, como los fibratos y las tiazolidinedionas (Nakano et al., 2007; Sato et al., 2009) que puedan modificar el metabolismo y expresión génica de estos tejidos y por tanto la respuesta productiva.

Reproducción, transferencia nuclear, tecnologías de ADN recombinante y transgénesis

La transferencia nuclear (remoción del núcleo de un ovocito y su sustitución por el núcleo de una célula somática) es una técnica que requiere una fuente de células donantes, una fuente de ovocitos adecuada y hembras receptoras para llevar a cabo la gestación (Tecirlioglu et al., 2006). Esta técnica se puede usar para preservar especies en peligro de extinción como el lobo (Oh et al., 2008) o el borrego cimarrón (Williams et al., 2006). En las especies domésticas puede utilizar para clonar animales genéticamente superiores, rescatar razas con poblaciones escasas (Jang et al., 2009) y mascotas (Vanderwall et al., 2006; Oh et al., 2011).

La utilización de las CTM en las técnicas de transferencia nuclear, aprovechando sus características de proliferación y su estado indiferenciado, permitiría obtener una gran cantidad de células donadoras de núcleo para transferencia; mientras que su uso en técnicas de ADN recombinante y transgénesis permitiría emplearlo en técnicas de transferencia nuclear para generar animales transgénicos. Por ejemplo, pollos transgénicos que expresan proteína verde fluorescente (Green Fluorescent Protein, eGFP) a partir de la cruza de padres a los que se transplantaron directamente a los testículos CTM de MO transfectadas con eGFP y que se diferenciaron a células germinales capaces de producir espermatozoides. Después, con semen obtenido de estos animales se inseminó artificialmente a gallinas normales y de estas cruzas se obtuvieron tres aves eGFP, de un total de 309, a partir de cuatro machos con semen eGFP (Heo et al., 2011). La eficiencia para producir este tipo de animales es baja, pero ya hay medios para generarlos. El perfeccionamiento de las técnicas necesarias (uso de CTM como células donadoras), permitirá en un futuro cercano su uso para generar animales con características deseables.

Producción de carne in vitro

La producción de carne in vitro se ha propuesto como una alternativa para reducir los riesgos y costos de la producción industrial de carne: bienestar animal, diseminación de enfermedades, contaminación ambiental, competencia por alimentos con el hombre y eficiencia de la producción (Langelaan et al., 2010). El desarrollo de esta tecnología permitirá la producción de carne diseñada con una composición especifica para las necesidades y preferencias del consumidor (mediante tecnología de ADN recombinante y transgénesis), disminuir el número de animales, el tiempo de producción y el riesgo de enfermedades de origen alimentario; además, producir esta carne en espacios menores a los utilizados por la producción industrial de animales (Bhat y Fayaz, 2011). Pero aún están en desarrollo los métodos y tecnologías necesarios para su implantación, como obtener células adecuadas para el cultivo continuo y la estandarización de las condiciones ambientales para el crecimiento y diferenciación de las células utilizadas (Mironov et al., 2009; Langelaan et al., 2010).

El modelo ideal para esta tecnología son las células troncales embrionarias (CTE); sin embargo, las únicas líneas celulares de este tipo provienen de roedores y primates. En el caso de animales para producción de carne no hay líneas celulares bien establecidas (Telugu et al., 2010). No obstante, Brevini et al. (2010) reportan la obtención de líneas de CTE en cerdos. Además, el uso de células troncales pluripotenciales inducidas (Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC) es otra alternativa, pero la generación de estas células desde células somáticas requiere la transfección de los factores de transcripción Oct4, Sox–2 y de los factores relacionados a tumores Klf4 y c–Myc (Takahashi, 2006) para recuperar la pluripotencialidad. La transfección con estos factores se realiza uno a la vez, por lo cual la técnica es riesgosa y lenta. Por ello, para los estudios de esta nueva tecnología se usan células satélite provenientes del tejido muscular, cuya desventaja es un número reducido de duplicaciones celulares (Langelaan et al., 2010). En este caso, el uso de CTM de MO ofrece una alternativa interesante para continuar el desarrollo de esta tecnología, porque posee una mayor capacidad de duplicación que las células satélite usadas ahora, así como la capacidad de diferenciación para dar origen a diferentes linajes celulares.

CONCLUSIONES

El uso y aplicación de las CTM es importante en producción animal y medicina veterinaria debido a su estado indiferenciado, alta capacidad proliferativa y capacidad de diferenciación a diferentes linajes celulares. En la terapia celular se pueden usar en el tratamiento de lesiones del aparato locomotor, insuficiencia renal, infarto de miocardio o lesiones de la médula espinal. Asimismo son un modelo útil para investigar los mecanismos que controlan la diferenciación y el metabolismo de los tejidos muscular y adiposo, así como en el desarrollo y estudio de nuevos fármacos o sustancias naturales. En técnicas de reproducción y transgénesis permitirá obtener de una muestra una gran cantidad de células para transferencia nuclear, clonación y generación de animales transgénicos.

En la producción de carne in vitro el uso de las CTM de MO es una de las mejores opciones debido a sus características de proliferación y multipo–tencialidad en comparación con las células satélite. Estas células están limitadas por su baja capacidad de proliferación, lo cual obliga a un aporte constante y en mayor frecuencia de nuevas células aisladas para sustituir a las células que han detenido su proliferación.

Este estudio fue financiado por el Proyecto PAPIIT IN200910 (UNAM, México) y es parte de la tesis doctoral (UNAM) de los dos primeros autores, los cuales contribuyeron de igual forma a su realización. Ambos agradecen al CONACYT la beca otorgada en la Facultad de Estudios Superiores–Cuautitlán, UNAM, México.

LITERATURA CITADA

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