Células troncales mesenquimales: biología, caracterización y futuras aplicaciones en salud y producción de especies pecuarias. Parte I

Mesenchymal stem cells: biology, characterization and future applications to animal health and livestock production. Part I

Rosa M. Pérez-Serrano¹, Jesús J. Ramírez-Espinosa¹, Armando Shimada², Anaid Antaramian³, Enrique Piña⁴, Ofelia Mora^2*

¹ Programa de Posgrado en Ciencias de la Producción y de la Salud Animal, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). México.

³ Instituto de Neurobiología, UNAM. Blvd. Juriquilla 3001, Querétaro, estado de Querétaro. 76230, México.

⁴ Facultad de Medicina, UNAM. Circuito Interior, Ciudad Universitaria, Av. Universidad 3000, D. F. 0451, México.

Recibido: septiembre, 2011.
Aprobado: mayo, 2012.

Resumen

Las células troncales mesenquimales poseen características que las convierten en un modelo único para la investigación en el área biomédica. Su empleo como herramienta biotecnológica permite soluciones innovadoras a problemas de salud en humanos y animales. Estas células se caracterizan por una alta capacidad proliferativa siendo viables por periodos prolongados y por su multipotencialidad al diferenciarse a diversos linajes celulares, radicando en ello su valor para la ingeniería y reparación de tejidos, tratamiento de enfermedades y manipulación de la diferenciación celular, e incluso la producción animal. El presente ensayo abarca aspectos básicos de su biología y caracterización en las especies domésticas, enfatizando la necesidad de homogenizar los criterios que permitirían caracterizar estas células en las especies pecuarias y sus posibles aplicaciones en salud y producción pecuaria.

Palabras clave: células troncales mesenquimales, médula ósea, caracterización, diferenciación celular, reparación de tejido, multipotencialidad.

Abstract

Mesenchymal stem cells have characteristics that make them a unique model for research in the biomedical area. Its use as a biotechnological tool allows for innovative solutions for health problems in humans and animals. These cells are characterized by a high proliferative capacity of being viable for long periods and for their multipotent capacity to differentiate into a wide variety of cell lineages, having in it their value for tissue engineering and repair, treatment of diseases and manipulation of cell differentiation and even animal production. This paper covers basic aspects of their biology and characterization in domestic species emphasizing the need to homogenize the criteria that would allow to characterize these cells in the livestock species and their possible applications in health and livestock production.

Key words: mesenchymal stem cells, bone marrow, characterization, cell differentiation, tissue repair, multipotentiality.

INTRODUCCIÓN

Apartir del año 2000 el estudio de las células troncales tomó auge debido a sus diferentes aplicaciones biológicas, convirtiéndose en un modelo para estudiar la biología molecular, celular y los procesos de organogénesis. El mejor conocimiento de sus características favorecerá la manipulación de la diferenciación celular con el objetivo de resolver diversas problemáticas en múltiples aéreas, y aquí se enfatiza la clínica veterinaria y la zootecnia.

Biología

Las células troncales (CT) presentan la capacidad de pluripotencialidad o multipotencialidad al diferenciarse a linajes celulares diversos y proliferar en forma indiferenciada (Bianchi de Di Risio, 2004; Lindner et al., 2010); por su origen las CT se clasifican en embrionarias (CTE) y somáticas (CTS). Las CTE derivan de la masa celular interna del blastocisto, y a partir de ellas se originan las capas germinales en el embrión, por lo que se consideran células pluripotenciales capaces de diferenciarse hacia cualquier linaje celular en el organismo (Jiang et al., 2002). Las CTS son células multipotenciales (con capacidad de diferenciación limitada a algunos linajes celulares) provenientes de diversos tejidos y que, por su capacidad de autorrenovación, pueden ser cultivadas por largos periodos (Kuroda et al., 2010).

La metodología para obtener CTS desde la MO, estandarizada en la década de 1990, consiste en la aspiración de la MO de la cresta ilíaca o la epífisis femoral y la selección de células mediante gradientes de densidad. La MO es un tejido sinusoidal localizado en la cavidad medular de los huesos largos, esternón, huesos de la cadera y vértebras esponjosas; está compuesta por células endoteliales, reticulares, adipocitos, macrófagos, fibroblastos, células precursoras osteogénicas y células troncales somáticas (Majumdar et al., 1998). La función principal de la MO es proveer y movilizar CTS para reparar el tejido dañado en el organismo, por lo cual es el sitio con mayores reservas (Neuss et al., 2004).

Las CTS de MO se clasifican en dos grupos: células hematopoyéticas (CH) y CT mesenquimales (CTM). Las CH presentan multipotencialidad hacia eritrocitos, macrófagos, neutrófilos, basófilos, linfocitos y megacariocitos (Bianchi de Di Risio, 2004; Hombach-Klonisch et al., 2008), constituyen sólo una pequeña porción de las células nucleadas aisladas, aproximadamente una célula por cada 10⁴ a 10⁸ células, y pueden aislarse de MO, sangre periférica y sangre del cordón umbilical (Hombach-Klonisch et al., 2008).

Las CTM presentan multipotencialidad hacia tejidos conjuntivos como hueso (Dong et al., 2009), cartílago (Vidal et al., 2006), adiposo, muscular (Zeng et al., 2006) y neuronal, entre otros; son altamente proliferativas lo que permite mantener cultivos celulares durante largos periodos. Los cultivos in vitro constan de una población heterogénea (Bianco et al., 2001) y morfológicamente presentan forma espigada (denominada fibroblastoide), con un núcleo grande, alargado y céntrico con dos o tres nucléolos (Flores-Figueroa et al., 2006). En la Figura 1 se muestran las morfologias de las CTS de cuatro especies pecuarias obtenidas a partir de médula ósea y dermis, mostrando diferencias en el tamaño, forma y organización en el cultivo in vitro; sin embargo, conservan las caracteristicas morfológicas antes descritas.

Las funciones endógenas de las CTM en la reparación de tejido son poco claras. Sin embargo, se ha determinado que aumentan la proliferación y controlan la vasculogénésis mediante la secreción de citocinas y factores de crecimiento (interleucina 6 (IL-6), IL-11, factor inhibidor de leucemia y factor de estimulación de colonias de macrófagos y granulocitos) que permiten la regeneración del tejido dañado (Tuan et al., 2003).

Caracterización

Dominici et al. (2006), a nombre de la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT), señalan cinco criterios básicos para identificar una población celular como CTM.

Capacidad de adherencia al plástico

Las CTM presentan la habilidad de adherencia al plástico (Arévalo et al., 2007; Bianco et al., 2001) lo cual permite seleccionarlas de la población heterogénea de la que son aisladas (incluyendo las CH y células reticulares) y que carecen de esta capacidad (Chamberlain et al., 2007).

Las CTM pueden cultivarse in vitro por periodos prolongados en estado indiferenciado y alcanzan un periodo de vida de entre 15 y 50 duplicaciones celulares (Grove et al., 2004), por lo cual sólo pueden mantenerse durante un número limitado de subcultivos. Después ocurre una reducción progresiva de la proliferación, por lo que se les denomina Líneas Celulares Finitas (Freshney, 2006). Esta reducción en las CTM es más temprana en contraste a las CTE donde la capacidad proliferativa está altamente conservada debido a un mecanismo de transcripción inversa endógena que les permite conservar sus telómeros (Colleoni et al., 2005). Sin embargo, debido a que no existen líneas celulares de CTE de especies pecuarias y las CTM poseen características similares, son un modelo útil de estudio para la investigación y desarrollo de tecnologías en el mejoramiento genético, clonación y reproducción.

Las CTM in vitro presentan un ciclo celular de tres periodos durante el cultivo: 1) Periodo de Retraso, dura 12 a 24 h, las células reconstituyen el citoesqueleto y secretan proteínas de matriz extracelular para adherirse al plástico; 2) Fase Exponencial donde la población celular se duplica, ocurriendo varias veces durante el cultivo; 3) Fase Estacionaria, momento idóneo para la inducción de la diferenciación celular al reducir su crecimiento.

Para determinar la capacidad de proliferación durante el cultivo se evalúan tres características: 1) número de duplicaciones celulares que es la cantidad de duplicaciones que ocurren en las células cultivadas en un tiempo determinado (Vidal et al., 2006) y en experimentos con CTM de bovinos y porcinos hubo 40 a 50 duplicaciones acumuladas después de 10 a 15 subcultivos (Colleoni et al., 2005); 2) tiempo de duplicación celular que es el tiempo necesario para la duplicación de una célula y en CTM de equino es 4.9±1.6 d para células del primer subcultivo (Vidal et al., 2006); 3) una curva de crecimiento celular acumulativa que muestra el comportamiento de las células a lo largo del cultivo respecto a su capacidad de proliferación.

En muestras de células aisladas de MO, la evaluación de estas tres características permite determinar la capacidad de autorrenovación, característica indispensable para ser consideradas como CTM. En varias investigaciones se reporta tiempos de duplicación celular para las CTM de algunas especies domésticas; sin embargo, no existen criterios uniformes sobre las características de proliferación siendo necesaria la investigación y la estandarización de dichos criterios.

Detección de proteínas de superficie

Para identificar los marcadores de superficie de las CTM se usan técnicas basadas en el uso de anticuerpos específicos como citometría de flujo, inmunocitoquímica (ICQ), western blot e inmunomicroscopía electrónica. La mayor limitante de esas técnicas es la falta de una molécula específica conocida que permita la identificación correcta y es necesario usar una serie de anticuerpos contra antígenos expresados de manera preferencial (aunque no exclusiva) en las CTM. Es importante tipificar la población aislada, para lo cual la ISCT publicó en el 2006 un listado que incluye anticuerpos para identificar las CTM y las CH (Cuadro 1).

Ese listado no identifica exclusivamente a las CTM, pero tomando en cuenta el origen y tipo de tejido aislado, se puede deducir su presencia (Dominici et al., 2006).

Los anticuerpos probados para determinar la identidad de las CTM de varias especies son usados como modelos de estudio para problemáticas clínicas del ser humano (Cuadro 2). Las investigaciones en medicina veterinaria y zootecnia son reducidas y no se han determinado los anticuerpos específicos de las CTM para cada especie, por lo cual se usan anticuerpos diseñados para los modelos animales estudiados más frecuentemente (rata, ratón y humano). Lo anterior genera un área de oportunidad en la ciencia veterinaria para determinar los antígenos expresados en las especies domésticas y después diseñar los anticuerpos específicos, para facilitar la identificación de las CTM. Esto resolvería la controversia generada en investigaciones donde la falta de reactividad a los anticuerpos por las CTM puede deberse a que carecen de la expresión de tales marcadores o el anticuerpo usado no lo reconoce. Rozemuller et al. (2010) en un panel de 43 anticuerpos determinaron que reaccionan positivamente en varias especies, y reportaron los anticuerpos CD271, W8B2, W4A5, CD56, W3C4 (CD349), W5C4 y 58B1 con reacción positiva en mono, cabra, borrego, cerdo y perro.

Expresión de factores de transcripción

Sin embargo, el factor de transcripción vinculante 4 (Oct 4) está presente en las CTE y en las CTM. En células tumorales se ha determinado la expresión de Oct4 y Nanog lo que confirma su alta capacidad proliferativa y viabilidad durante periodos prolongados (Jeter et al., 2009; Kong et al., 2010). Además se ha determinado la expresión de estos genes en diferentes especies (Cuadro 3).

A excepción de las investigaciones realizadas en CT de cerdos, aves y equinos (Violini et al., 2009), en las demás especies domésticas la determinación de estos factores de transcripción se ha limitado a CTE. La identificación de la expresión de dichos factores en las CTS en las especies domésticas brindaría mayor información sobre las capacidades de autorrenovación y diferenciación de estas células, así como los patrones de expresión que determinan tales capacidades. Además, el uso de los factores de transcripción para la generación de células pluripotenciales, inducidas mediante tecnologías de ADN recombinante, permitirá la generación de líneas celulares de CTS con una mayor capacidad de proliferación y diferenciación. Las líneas generadas de esta forma tendrían aplicaciones en el estudio de los mecanismos implicados en la regulación del metabolismo, ingeniería de tejidos y diferenciación celular.

Multipotencialidad

Las CTM poseen la capacidad de diferenciarse a diversos tejidos, considerándose básica la capacidad adipogénica, osteogénica y condrogénica; pero no está limitada a estos linajes. Diversas investigaciones han logrado la diferenciación a cardiomiocitos (Akavia et al., 2008), miocitos esqueléticos (Dezawa et al., 2005; Akavia et al., 2008) y lisos (Narita et al., 2008), células endoteliales, hepatocitos (Zeng et al., 2006), células β pancreáticas (Liu et al., 2010), células gliales y neuronas (Shiota et al., 2007; Bi et al., 2010).

Para inducir la diferenciación es necesario imitar el microambiente de los tejidos in vivo usando medios de cultivo con nutrientes, hormonas, citocinas, factores de crecimiento (incluidos en sueros animales o adicionados) y algunos compuestos sintéticos.

En la diferenciación de CTM a osteocitos al medio de cultivo se agregan suero fetal bovino, dexametasona, β-glicerofosfato y ácido ascórbico; la diferenciación a condrocitos se induce con los factores de crecimiento transformante β1 y 3 (TGF-β1, TGF-β3), proteína morfogenética 4 (BMP4), insulina, transferrina y selenito de sodio (ITS); y la diferenciación adipogénica utiliza dexametasona, indometacina, insulina e isobutil-metil xantina (IBMX) (Pittenger et al., 1999).

La evaluación de la capacidad de diferenciación de las CTM se lleva a cabo con técnicas de laboratorio e incluyen el uso de tinciones específicas para microscopía de campo claro (MCC), pruebas de actividad enzimática, técnicas inmunoquímicas [Western blot (WB), inmunocitoquímica (ICQ)] e inmunomicroscopía electrónica (MET, I-MET) y biología molecular [RT-PCR, PCR en tiempo real o cuantitativo (qPCR) y microarreglos de ADN] (Cuadro 4).

CONCLUSIONES

La validación de los resultados obtenidos en experimentos con células troncales mesenquimales es necesaria y es importante usar diferentes métodos para su caracterización. Dentro de esta caracterización, la capacidad de adherencia al plástico, la capacidad proliferativa y multipotencialidad están bien definidas para las células troncales mesenquimales, mientras que la expresión de marcadores de superficies y factores de transcripción es controversial, porque no se conoce un marcador específico y a dichos genes se consideran como marcadores de células troncales embrionarias.

Sin embargo, las propiedades de las células troncales mesenquimales las hacen un modelo idóneo para la investigación en zootecnia donde se pueden usar en estudios sobre calidad de carne y comportamiento productivo, así como en el área clínica para la regeneración e ingeniería de tejidos. Los puntos anteriores serán abarcados en la segunda parte del presente ensayo.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio fue financiado por el Proyecto PAPIIT IN200910 (UNAM, México). Este trabajo es parte de la tesis doctoral (UNAM) de los dos primeros autores, quienes contribuyeron de igual forma a su realización. Ambos agradecen al CONACYT la beca otorgada en la Facultad de Estudios Superiores-Cuautitlán, UNAM, México.

LITERATURA CITADA

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