Solubilización in vitro de fosfatos por una cepa de Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson

In vitro phosphate solubilization by a strain of Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson

Tania I. Hernández–Leal, Gloria Carrión , Gabriela Heredia

Instituto de Ecología A. C. 91070. Carretera antigua a Coatepec 351, El Haya, Xalapa, Veracruz, México. (gloria.carrion@inecol.edu.mx) (isahernandezleal@gmail.com). *Autor responsable.

Resumen

El fósforo es un elemento con escasa disponibilidad en el suelo, la cual puede ser mejorada por hongos solubilizadores de fosfatos de calcio y hierro. Por tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar in vitro la solubilización de compuestos fosfatados por Paecilomyces lilacinus en medios de cultivo sólidos y líquidos. En medios sólidos se emplearon placas de agar con cada compuesto fosfatado, además de un testigo sin fosfatos, los cuales se inocularon con esporas del hongo. Se evaluaron los halos de solubilización y se calculó la eficiencia relativa de solubilización (ERS). En las pruebas con medios líquidos, P. lilacinus se inoculó en medios de cultivo con fosfato de calcio y de hierro sin agar, en los cuales se cuantificó el fosforo (P) soluble y el pH. En las placas de agar con fosfato de calcio se observaron halos de solubilización y la ERS fue 305 % a los 8 d, sin embargo en medios con fosfato de hierro no se formaron halos. En el medio líquido con fosfato de calcio se obtuvo mayor cantidad de P soluble (71.28±7.88 mg L^–1) en comparación con el medio con fosfato de fierro (1.75±0.32 mg L^–1). En presencia de fosfato de hierro, P. lilacinus inmovilizó la mayor parte del fósforo solubilizado y dejó una proporción disponible mínima. El pH de ambos medios de cultivo disminuyó con la presencia del hongo, por lo cual es probable que el principal mecanismo de solubilización sea la producción de ácidos orgánicos.

Key words: fósforo, hongos solubilizadores, fosfatos, Paecilomyces lilacinus.

Abstract

Phosphorus is an element with limited availability in the soil, which can be improved by solubilizing fungi of calcium and iron phosphates. Therefore, the objective of this study was to evaluate in vitro the solubilization of phosphate compounds by Paecilomyces lilacinus in solid and liquid culture media. In solid media agar plates were used with each phosphate compound, and a control without phosphates, which were inoculated with spores of the fungus. The halos of solubilization were evaluated and the relative efficiency of solubilization (ERS) was calculated. In tests with liquid media, P. lilacinus was inoculated in culture media with calcium and iron phosphate without agar, in which the soluble phosphorus (P) and pH were quantified. In agar plates with calcium phosphate solubilization halos were observed and ESR was 305 % at 8 d, but in media with iron phosphate halos were not formed. In the liquid medium with calcium phosphate a greater amount of soluble P (71.28 ±7.88 mg L^–1) was obtained compared with the medium with iron phosphate (1.75±0.32 mg L^–1). In the presence of iron phosphate, P. lilacinus immobilized most of the solubilized phosphorus and left a small proportion available. The pH of both culture media decreased in the presence of fungus, which is likely that the main mechanism of solubilization is the production of organic acids.

Palabras clave: phosphorus, solubilizing fungi, phosphates, Paecilomyces lilacinus.

Introducción

El fósforo es un elemento indispensable para la constitución celular y las reacciones bioquímicas de las plantas. Sin embargo, las formas químicas que pueden utilizar las plantas (ortofosfatos: y , principalmente) son escasas, a pesar del vasto contenido de fósforo total en la mayoría de los suelos (Turner et al., 2006). Uno de los principales motivos de la disponibilidad limitada se debe a la unión de los aniones fosfato con otros elementos, con los que forma complejos poco solubles, como los fosfatos de hierro (FePC₄) o aluminio (AlPO₄) en suelos ácidos y fosfatos de calcio [Ca₃(PO₄)2] en suelos alcalinos (Lavelle y Spain, 2001; Deubel y Merbach, 2005).

La disponibilidad del fósforo puede ser facilitada por la acción de algunos hongos y bacterias so–lubilizadores de fosfatos de calcio, hierro y aluminio (Tandon y Roy, 2004; Richardson et al., 2009). Estos microorganismos tienen importancia en la nutrición vegetal, ya que pueden incrementar la disponibilidad del fósforo en el suelo. En los últimos cien años se han desarrollado estudios enfocados al aislamiento, caracterización y evaluación del potencial para incrementar el rendimiento de los cultivos de hongos y bacterias solubilizadores de fosfatos (Goldstein, 2007).

Los hongos solubilizadores más estudiados son Penicillium y Aspergillus (Chun–Chao et al., 2007; El–Azouni, 2008; Pandey et al., 2008). Uno de los mecanismos de solubilización empleado por estos hongos es la producción de diversos ácidos orgánicos, como el cítrico, oxálico, málico y glucónico, y la quelación de los minerales que forman los complejos insolubles con el fósforo (Alam et al., 2002; Chun–Chao et al., 2007; Dighton, 2007).

La actividad solubilizadora de fosfatos de los hongos nematófagos ha sido poco evaluada. Algunos como Arthrobotrys oligospora Fresen. tienen la capacidad de solubilizar fosfatos de Ca (Duponnois et al., 2006) y otros como Paecilomyces spp. solubilizan tanto fosfatos de Ca como de Fe (Vera et al., 2002). Los hongos nematófagos con estas características además de disminuir la densidad de nematodos fitoparásitos, pueden contribuir a la nutrición del cultivo incrementando la disponibilidad del fósforo.

Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson es uno de los hongos más estudiados y utilizados en el control de nematodos fitoparásitos (Saxena, 2004). En invernadero y en campo, se ha detectado infectando 50100 % de nematodos fitoparásitos como Meloidogyne incognita (Kofoid & White, 1919) Chitwood, 1949 (Jonathan et al., 2000; Brand et al., 2004;), M. javanica (Treub, 1885) Chitwood, 1949 y Heterodera avenae Wollenweber (Khan et al., 2006), Radopholus similis (Cobb, 1893) Thorne, 1949 (Mendoza et al., 2007) y Rotylenchulus reniformis Linford & Oliviera, 1940 (Walters y Barker, 1994). Sin embargo, no hay información específica sobre su capacidad de solubilizar fosfatos.

Con la hipótesis de que P. lilacinus solubiliza tanto fosfato de calcio como de hierro, el objetivo del presente estudio fue conocer mediante pruebas in vitro la actividad solubilizadora de P. lilacinus en medios sólidos y líquidos con suplementos de fosfato de calcio y de hierro. En los medios sólidos también se analizó el efecto de los compuestos fosfatados en el crecimiento y la esporulación del hongo.

Materiales y Métodos

Se usó una cepa de P. lilacinus (IE–430), nativa del Cofre de Perote, Veracruz, México, aislada de juveniles de Globodera rostochiensis y depositada en el cepario del Instituto de Ecología A. C., cuya determinación morfológica fue realizada con la clave de Samson (1974). El medio de cultivo sólido utilizado fue un indicador cualitativo de la acción solubilizadora de fosfatos de un hongo y se puede observar al formarse un halo claro alrededor del micelio (Sundara y Sinha, 1963). El medio de cultivo Pikovskaya–agar modificado (Nopparat et al., 2009), consistió en una solución base: (NH₄)₂SO₄(0.5 g), KCl (0.2 g), MgSO₄–7H₂O (0.1 g), MnSO₄ · H₂O (0.004 g), NaCl (0.2 g), D–Glucosa (10 g), FeSO₄ –7H₂O (0.002 g) (Sigma–Aldrich), extracto de levadura (0.5 g, Bioxon), cloranfenicol (0.1 g, Pfizer), agar (18 g, Bioxon) y agua destilada (900 mL). A esta mezcla se le añadió una solución de fosfato: goma arábiga (0.5 g, Kremer), fosfato de calcio (β–fosfato de tricalcio, Ca₃(PO₄)₂, Sigma–Aldrich, 0.5 g) o hierro (fosfato férrico, FePO₄ · H₂O, Química–Barquim, 0.5 g) y agua destilada (100 mL). Se preparó un medio de cultivo testigo sin compuesto fosfatado. La mezcla base y la solución de fosfato se esterilizaron por separado en autoclave durante 15 min a 22 psi y 121 °C. Cuando la temperatura de ambas fue tolerable para ser manipuladas, se mezclaron y vertieron en cajas Petri formando una capa delgada. El pH inicial del medio con fosfato de calcio fue de 5.45 y 4.68 para el medio con fosfato de hierro. Al final del experimento se usaron tiras indicadoras para medir el pH de la superficie de las placas del medio de cultivo.

Se emplearon 10 cajas Petri para cada medio de cultivo, en cuyo centro se inocularon con agujas esterilizadas 15×10⁴ esporas de la cepa IE–430 de P. lilacinus. Las cajas se mantuvieron en oscuridad a 25 °C. Para evaluar el crecimiento del hongo con diferentes fuentes de fósforo, se midió el diámetro de la colonia a los 4, 5, 6, 8 y 10 d posteriores a la inoculación. La Eficiencia Relativa de Solubilización (ERS) se calculó con el diámetro de la colonia y del halo formado alrededor del micelio al octavo y décimo día mediante la fórmula: Diámetro de la solubilización/ Diámetro de la colonia×100 (Vera et al., 2002). Este índice indica el radio de acción del hongo sobre el sustrato, expresado en porcentaje, en relación al tamaño del micelio.

Para conocer el efecto de los dos compuestos fosfatados sobre la esporulación de P. lilacinus, después de 15 d, de cada tratamiento se cortó un círculo de 5 mm de diámetro en el centro de la colonia. Cada disco se introdujo en un vial con 1 mL de agua, al cual se le agregó Tween 80 y se agitó vigorosamente. Posteriormente se hicieron diluciones de 1:10 a partir de las cuales se realizaron tres conteos de esporas con una cámara de Neubauer. Los resultados se expresan en número de esporas mL^–1 y son el promedio de los tres conteos.

Cuantificación de fósforo soluble en medio líquido

Se cuantificó la cantidad de fósforo solubilizado por P. lilacinus en un determinado periodo de tiempo, según Chun–Chao et al. (2007) y Pandey et al. (2008). Se preparó medio de cultivo sin agar con fosfato de calcio (P–Ca) y con fosfato de hierro (P–Fe), de la forma descrita en los medios sólidos. Para cada tratamiento se emplearon tres matraces (250 mL) con 150 mL del caldo de cultivo, cada uno se inoculó con tres discos de agar avena (5 mm de diámetro) tomados del margen de un cultivo puro de P. lilacinus con 4 d de crecimiento (8×10⁶ conidiosporas/disco). Se utilizaron matraces con medio sin inóculo como testigos, también por triplicado. Todos los matraces (N=12) se mantuvieron a temperatura ambiente (25 °C), en constante agitación a 130 rpm.

Se tomaron alícuotas de 10 mL de cada matraz, antes de inocularlos y cada 2 d después de agregar el hongo. En el medio P–Ca las alícuotas se tomaron hasta los 12 d y en P–Fe hasta los 18 d, debido a que éste último fue menos soluble. En cada toma, los extractos se filtraron con papel Whatman 42 para separar el micelio sobrenadante y con las soluciones resultantes se cuantificó el fósforo soluble por colorimetría de complejos molibdo–fosfóricos reducidos con ácido ascórbico (AOAC, 1980), realizando las lecturas a 880 nm en un espectrofotómetro (Genesys 20, ThermoSpectronic, EUA). Los resultados son el promedio de las tres réplicas y se expresan en mg L^–1. En cada evaluación el pH de los extractos se midió con un potenciómetro (Conductronic PC45, México). Al finalizar los periodos de revisión se analizó la cantidad de Fe y Ca soluble en todos los matraces, con un espectrofotómetro de absorción atómica y emisión de flama (Shimadzu AA–6501, Japón).

La concentración inicial de P introducido como Ca₃(PO₄)₂ fue de 99.88 mg L^–1 y en FePO₄ fue 91.75 mg L^–1, calculada de acuerdo a su peso molecular. La solubilidad de estos dos compuestos se calculó tomando en cuenta la constante del producto de solubilidad y el peso molecular de cada uno (Garzón, 1991).

Diseño experimental y análisis estadísticos

El diseño experimental en las pruebas con los medios sólidos y líquidos fue completamente al azar. Para determinar las diferencias en el crecimiento del hongo entre los distintos medios sólidos [Ca₃(PO₄)₂, FePO₄ y testigo] se realizaron comparaciones en cada día de evaluación. Para determinar las diferencias entre los tratamientos se empleó un ANDEVA de una vía y la prueba de Tukey (p<0.05), cuando los valores presentaron una distribución normal y homogeneidad de varianza (valores del crecimiento del micelio al cuarto y décimo día de evaluación). En caso contrario se utilizó la prueba de Kruskal–Wallis (valores del quinto, sexto y octavo día de evaluación) y después la comparación múltiple por rangos (p<0.05). En relación al P soluble en los medios líquidos, se aplicó la prueba U de Mann–Whitney para determinar diferencias entre los tratamientos. Por último, se llevó a cabo una correlación de Spearman entre el pH y la cantidad de P soluble en los medios líquidos inoculados con P. lilacinus. Todos los análisis se efectuaron con el programa Statistica 8.0 para Windows (StatSoft, 2007).

Resultados y Discusión

Solubilización de fosfatos en medio sólido

Paecilomyces lilacinus mostró actividad solubilizadora hacia el fosfato de calcio desde el cuarto día después de su inoculación, cuando se observó la formación de halos alrededor de la colonia en las placas de agar (Figura 1). Por el contrario, para el fosfato de hierro no se formaron los halos. Al respecto, Jones et al. (1991) y Whitelaw (1999) mencionan que la ausencia de halos de solubilización en los medios de cultivo sólido no necesariamente indica que el organismo carezca de habilidad solubilizadora, sino que posiblemente este tipo de medios son insensibles para detectar la actividad de algunos microorganismos. Por lo cual es necesario recurrir a los medios líquidos para obtener resultados más precisos.

La ERS promedio del hongo en el sustrato con fosfato de calcio fue de 298 % al décimo día, sin embargo el máximo valor de este índice se presentó en el octavo día con 305 %. Estos resultados indican que el área de solubilización del hongo fue aproximadamente tres veces más extensa que el tamaño de su micelio (Cuadro 1). Al comparar estos datos con los resultados obtenidos por Vera et al. (2002), quienes emplearon un medio de cultivo muy similar, se concluye que la cepa de P. lilacinus empleada en este trabajo posee una eficiencia de solubilización superior que la mayoría de las cepas probadas (Trichoderma spp., Paecilomyces spp., Aspergillus spp., entre otras) por los autores mencionados, las cuales tuvieron ERS menores a 250 %.

El crecimiento de P. lilacinus fue mayor (p<0.05) en el medio de cultivo testigo en comparación con los medios con fosfato de calcio y hierro (Figura 2). El diámetro del micelio fue 22.15 ±1.75 mm ( ± DE) en el medio testigo al décimo día (pH=3), mientras que en el tratamiento con fosfato de calcio y de hierro fue 19.82±1.19 (pH=4) y 16.88±0.82 mm (pH = 2.5). No hubo diferencias significativas en el crecimiento del hongo entre los medios con calcio y hierro, con excepción del décimo día de evaluación (F(2, 27)=37.88, p<0.01), en el cual el diámetro del micelio fue significativamente mayor en el medio con fosfato de calcio (Figura 2). Estos resultados indican un gasto de energía para el hongo debido a la disolución de los compuestos fosfatados [Ca₃(PO₄)₂o FePO₄]. La fuente de C, N y P del medio de cultivo influyen notablemente sobre la solubilización y el crecimiento de los hongos, la producción de las sustancias implicadas en la solubilización requiere la absorción de nutrientes, sobre todo de carbono (Nahas, 2007). Aún cuando se registraron pH muy ácidos en la superficie de las placas del medio de cultivo Pikovskaya–agar modificado, éstas mantuvieron su forma y consistencia.

El número de esporas producidas en el medio con fosfato de calcio fue 90.8±3.2×10⁶ esporas mL^–1 ±DE, superior al resto de los demás medios de cultivo (fosfato de hierro=41.6±4.9×10 y testigo = 50.4±6.7×10⁶ esporas mL^–1). La mayor esporulación obtenida en el medio con fosfato de calcio se debió a la presencia de los iones de Ca⁺² libres en el medio, lo cual coincide con lo descrito por Mosley et al. (1989), Shaw y Hoch (2007) y Koslova et al. (2010).

Solubilización de fosfatos en medio líquido

P. lilacinus solubilizó 71.28 mg L ¹ de fósforo en el medio con fosfato de calcio a los 12 d de crecimiento, lo cual representó 71 % del contenido de P inicial introducido como Ca₃(PO₄)₂. En comparación con su testigo, el medio inoculado con el hongo presentó mayor cantidad de P soluble (p<0.05) a partir del cuarto día, la mayor concentración del elemento se obtuvo en el último día de lectura (Cuadro 2). Al finalizar el experimento, la concentración de Ca en el tratamiento con el hongo fue 219.16 ±20.63 mg L^–1, superando el contenido de los matraces testigo (16.94±0.33 mg L^–1).

En el tratamiento con fosfato de hierro, P. lilacinus solubilizó menor cantidad de fósforo en comparación con el fosfato de calcio (Cuadro 3). El tratamiento inoculado con el hongo inicialmente tuvo una concentración de 4.28 ±0.07 mg de P L^–1 representando 4.66 % del fósforo incorporado como FePO₄ · H₂O; sin embargo, al cuarto día se presentó una disminución en la concentración de dicho elemento (0.42± 0.14 mg L^–1). En las siguientes evaluaciones se registró un ligero incremento del fósforo soluble, aunque siempre fue menor al tratamiento testigo, terminando con una concentración de 1.75±0.32 mg de P L^–1 (1.91 % del P inicial) (Cuadro 3). En el tratamiento testigo, el contenido de fósforo soluble no tuvo variación durante todo el experimento. La concentración de hierro soluble en el último día de evaluación fue mayor en el medio tratado con el hongo (52.39± 3.25 mg L^–1) que en el testigo (13.83±0.24 mg L^–1). Estos resultados indican que hubo disolución de fosfato de hierro, aunque la concentración de fósforo soluble disminuyó en los matraces inoculados con el hongo, como lo reportan Jones et al. (1991) en sus experimentos de laboratorio.

La mayor capacidad de P. lilacinus para solubilizar fosfato de calcio que fosfato de hierro, puede estar relacionada con el grado de solubilidad de ambos compuestos químicos. El Ca₃(PO₄)₂ tiene mayor solubilidad (2.21×10^–4 g L^–1) que el FePO₄ (1.78×10^–9 g L^–1), por lo que el primer compuesto se solubiliza con mayor facilidad (Reyes et al., 1999 a y b; Barroso y Nahas, 2005).

Es probable que la cantidad de fósforo que P. lilacinus solubilizó en el medio líquido con fosfato de hierro, fue incorporada a su propio metabolismo. Reyes et al. (1999a) en estudios con Penicillium rugulosum Thom atribuyen la disminución del P soluble a su inmovilización por el crecimiento del micelio. Estos mismos autores indican que utilizando nitrato () como fuente de nitrógeno y sacarosa como suplemento de carbono se obtiene mayor solubilización de fosfatos de hierro que con el amonio y glucosa utilizados en este experimento (Reyes et al., 1999a,b). El fósforo es indispensable en las funciones celulares de todos los seres vivos, como la producción de ATP, ADN y ARN. Los hongos pueden almacenar este elemento como sustancia de reserva, en forma de polifosfatos dentro de las vacuolas celulares (Beever y Burns, 1980; Carlile et al., 2001).

El pH de los medios con fosfato de calcio y de hierro bajó durante el experimento, mientras que en los matraces testigo no hubo variación (Cuadros 2 y 3). La acidificación de ambos medios de cultivo con respecto al testigo fue consecuencia de la actividad del hongo, ya que uno de los principales mecanismos empleados por los hongos solubilizadores para disolver los complejos fosfatados es la produción de ácidos orgánicos (Gómez–Guiñán y Zabala, 2001; Pradham y Sukla, 2005; Chun–Chao et al, 2007).

Se encontró una correlación negativa significativa entre la cantidad de fósforo soluble y el pH del medio con fosfato de calcio inoculado con P. lilacinus (r_S= 0.801, p<0.05). Lo anterior coincide con otros estudios en los cuales se indica que al disminuir el pH (5.5–2.4), aumenta la concentración de P soluble (0.32–110 mg L^–1) (Thomas et al, 1985; Pandey et al., 2008; Xiao et al., 2009). Sin embargo, en el cultivo con fosfato de hierro no se halló correlación entre las variables citadas (rS = 0.053, p>0.05), la disminución del pH no significó un aumento de P soluble. La acidez registrada en los medios de cultivo y la solubilización de fosfatos dependen de varios factores, como la capacidad solubilizadora del organismo, los ácidos orgánicos producidos, el tipo de compuesto fosfatado, así como la fuente de C y N (Barroso y Nahas, 2005; Pradham y Sukla, 2005; Souchie et al., 2006).

Conclusiones

La eficiente capacidad solubilizadora de Paecilomyces lilacinus hacia los fosfatos de calcio y en menor medida hacia los fosfatos de hierro fue comprobada in vitro. Este hongo nematófago usado con fines de control biológico tiene el potencial para favorecer la disponibilidad de fósforo en el suelo, en presencia de fosfatos de calcio. Sin embargo, es necesario realizar experimentos en condiciones de invernadero y campo, para evaluar la solubilización de los compuestos fosfatados al interactuar con los microorganismos del suelo.

Agradecimientos

Agradecemos a la M. en C. Ariadna Virues del Laboratorio de Ecología Funcional, INECOL, por la asesoría técnica brindada en la determinación del fósforo soluble. La primera autora agradece al CONACYT por la beca otorgada (224640) para realizar los estudios de Maestría en Ciencias. Este trabajo se llevó a cabo en las instalaciones del INECOL, en el laboratorio Hongos de la Red de Biodiversidad y Sistemática (20030–10138).

Literatura Citada

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