Perfiles diferenciales de Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. en respuesta al CO₂: producción de conidios y amilasas

Differential profiles of Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. as a response to CO₂: production of conidia and amylases

Paul M. Garza-López¹, Mina Konigsberg², Gerardo Saucedo-Castañeda¹, Octavio Loera^1*

¹ Departamento de Biotecnología, Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa. 09340. San Rafael Atlixco 186. Colonia Vicentina, Iztapalapa, México, D. F. *Autor responsable: (loera@xanum.uam.mx).

Recibido: marzo, 2011.
Aprobado: septiembre, 2011.

Resumen

La producción de conidios del hongo entomopatógeno Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. se realiza en cultivo en medio sólido (CMS) utilizando productos agrícolas y sus residuos, como arroz (Oryza sativa) y bagazo de caña (Saccharum ojjicinarum), donde el CO2 puede acumularse como producto del metabolismo. En este estudio se usó arroz (Oryza sativa var. japonica) como sustrato usando dos composiciones atmosféricas: aire normal y otra enriquecida con CO₂ (5 %), a través de recambios cada 12 o 24 h. Se determinó el efecto de estos tratamientos en la producción de conidios y de enzimas amilasas por B. bassiana, mediante un diseño completamente al azar y análisis de varianza usando la prueba de Tukey-Kramer (p<0.05). La producción máxima de conidios por g de sustrato seco inicial (gssi) se obtuvo con la atmósfera normal (1.14×10⁹ conidios gssi^-1), mientras que con 5 % de CO₂ la producción de conidios disminuyó hasta 85 % (1.8×10⁸ conidios gssi^-1). Sin embargo, en este último tratamiento la actividad de amilasas se incrementó tres veces (16.58 UI gssi^-1) respecto a la atmósfera normal (5.41 UI gssi^-1). Estos resultados son importantes para la producción de conidios y de enzimas por hongos en CMS, con la recomendación de modificar la concentración de CO₂, según se requiera favorecer el tipo de producto.

Palabras clave: Beauveria bassiana, Oryza sativa, dióxido de carbono, cultivo en medio sólido, rendimiento de conidios, actividad enzimática.

Abstract

Key words: Beauveria bassiana, Oryza sativa, carbon dioxide, solid medium culture, yield of conidia, enzymatic activity.

INTRODUCCIÓN

En México aumenta el uso de bioinsecticidas debido a que muchas especies de insectos han desarrollado resistencia a insecticidas convencionales; además, el público ha adquirido más consciencia de preservar el ambiente y la salud humana (Batra, 1982; Glare, 2004). Por ello, los bioinsecticidas son una alternativa en la agricultura sostenible y manejo integral de plagas (Lacey y Goettel, 1995).

Existen alrededor de 2000 especies de microorganismos entomopatógenos, de los cuales 750 son especies de hongos (Candas y Bulla, 2002). La mayoría de estos microorganismos infectan únicamente a insectos y no son nocivos para otros organismos como aves, mamíferos o plantas (Alatorre-Rosas, 2007). Dentro de las especies de hongos usadas para formular bioinsecticidas se encuentra Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill., la cual infecta a varias especies de insectos plaga como picudo del algodonero (Anthonomus granáis), palomilla de la manzana (Cydia pomonella), barrenador del tallo de maíz (Diatraea saccharalis), gusano de la harina (Tenebrio molitor), broca del café (Hypothenemus hampei) y mosquitas blancas (Bemisia spp.) (Hernández-Velázquez y Berlanga-Padilla, 1999; Alves et al., 2002; De la Rosa et al., 2002; Montesinos-Matías et al., 2011).

La producción de conidios de B. bassiana se realiza en cultivo en medio sólido (CMS) y en cultivo líquido (CL). Para el CMS se usan soportes naturales como bagazo de caña (Saccharum officinarum), residuos de papa (Solanum tuberosum), salvado de trigo (Triticum aestivum) y arroz (Oryza sativa) (Neves y Alves, 2000; Dalla-Santa et al., 2004, 2005; Núñez-Gaona et al., 2010). Ye et al. (2006) desarrollaron una cámara de cultivo para producir conidios de B. bassiana a nivel de planta piloto, utilizando arroz como sustrato. Además de este sistema, hay procesos de producción de conidios de B. bassiana basados en paja de arroz y salvado de trigo (Kang et al., 2005). En otros estudios donde se usó arroz como sustrato para la producción de Metarhizium anisopliae y B. bassiana (Liu y Tzeng, 1999; Neves y Alves, 2000; Arzumanov et al., 2005). Sin embargo, no se ha considerado medir la actividad de amilasas, que son las enzimas más importantes para hidrolizar el almidón, el cual es la fuente de carbono más importante en el arroz. Por tanto, hay varios productos agrícolas y residuos agroindustriales usados en el mundo para producir conidios de este hongo entomopatógeno, los cuales son las unidades infectivas más importantes para la aplicación en campo.

Algunos factores tienen una influencia importante en la producción de conidios: transferencia de calor, tamaño y tipo de partícula del sustrato, actividad de agua, pH, temperatura e intercambio gaseoso (Saucedo-Castañeda et al., 1990; Alatorre-Rosas, 2007; Núñez-Gaona et al., 2010). En los procesos de producción de conidios se puede acumular el CO₂ en los reactores, como producto del metabolismo del propio hongo. El efecto de la concentración de CO₂ se ha descrito para varias especies de hongos filamentosos en CMS y en CL (Desgranges y Durand, 1990; McIntyre y McNeil, 1998). Lord (2009) realizó un estudio con una atmósfera con baja concentración de O₂ y elevada cantidad de CO₂, pero sólo durante los bioensayos con insectos infectados con B. bassiana.

El objetivo de este estudio fue comparar el efecto de dos composiciones atmosféricas, una normal (aire) y otra con 5 % de CO₂, durante el crecimiento, producción de conidios y amilasas de B. bassiana utilizando un soporte natural fácilmente manipulable como el arroz.

Se utilizó la cepa de B. bassiana Bb 882.5 perteneciente a la colección de la Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa (México, D. F.), propagada por picadura en matraces Erlenmeyer de 250 mL conteniendo 50 mL de agar Sabouraud-Maltosa al 2 % modificado (SMA) (agar 15 g L^-1, maltosa 20 g L^-1, peptona de caseína 2.5 g L^-1, extracto de levadura 0.5 g L^-1 y avena molida 15 g L^-1), esterilizados 15 min en autoclave a 15 PSI. Una vez inoculados, se incubaron 8 d a 28±1 °C con un fotoperiodo 12:12 h.

Cultivo en medio sólido

Como unidades experimentales se usaron botellas serológicas de 75 mL conteniendo 5 g de arroz pre-cocido, esterilizadas 15 min en autoclave a 15 PSI. Se preparó una suspensión de conidios adicionando 20 mL de una solución estéril de Tween 80 al 0.05 % a los matraces Erlenmeyer usados en la propagación. Luego se contaron conidios en cámara de Neubauer, realizando las diluciones necesarias, con Tween 80 al 0.05 %, para obtener una concentración de 5×10⁶ conidios por mL (con mL^-1). Finalmente se adicionó 1 mL de esta suspensión de conidios para obtener una concentración final de 1×10⁶ conidios por g de sustrato sólido inicial (con gssi ^-1), con la cantidad necesaria de una solución estéril de extracto de levadura (0.5 g L^-1) para obtener humedad inicial de 40 %.

Modificación de la atmósfera

Se utilizaron dos mezclas gaseosas: atmósfera normal (21 % O₂) y una enriquecida con CO₂ (21 % O₂ y 5 % CO₂). La mezcla enriquecida se adquirió de la compañía Praxair-México S. A. Todos los experimentos comenzaron con una fase pre-estacionaria, donde a cada unidad experimental se colocó un tapón de algodón. Al tercer día del cultivo se colocaron tapones de goma a las botellas destinadas al tratamiento enriquecido con CO₂ y se colocaron dos agujas, una para facilitar la salida de los gases y la segunda conectada al tanque que contenía la mezcla enriquecida con flujo de 20 cm³ s ^-1 por 1 min (Tlecuitl-Beristain et al., 2010). Los recambios gaseosos se realizaron a intervalos de 12 o de 24 h para determinar si existía un efecto por la frecuencia del recambio. El cultivo se incubó 8 d a 28 ±1 °C con un fotoperiodo 12:12 h, con tres repeticiones en cada tiempo de muestreo. La atmósfera normal se nombró AN, mientras que la mezcla enriquecida con CO₂ se denominó 21-5.

Producción de conidios y medición de pH

Los conteos de conidios se hicieron tomando muestras de las botellas serológicas. Para ello, se adicionaron 20 mL de Tween 80 al 0.05 %, se agitaron 10 min y se contaron conidios en cámara de Neubauer. La suspensión de biomasa (conidios y micelio) restante se vertió en tubos Falcon de 50 mL para determinar los valores de pH con un potenciómetro Conductronic^TM pH 120. La producción de conidios se reporta por g de sustrato seco inicial (gssi).

Determinación de proteína extracelular

Se utilizó el método de Bradford (1976) con una curva estándar de seroalbúmina bovina y se leyó la absorbancia a 595 nm en espectrofotómetro (Beckman^TM DU-640). Para la determinación de proteína de las muestras se obtuvo un extracto adicionando 1 mL de la suspensión de biomasa a tubos Eppendorf y se centrifugó 1 min a 8000 x g. Se colocaron 800 µL del sobrenadante en tubos de ensayo de 10 mL y se adicionaron 200 µL de reactivo de Bradford (Sigma^TM). Los tubos se agitaron en un vórtex y transcurridos 5 min se leyó la absorbancia a 595 nm.

Debido a que el componente principal del arroz es el almidón, se determinó la cantidad de amilasas totales mediante la cuantificación de los azúcares reductores por el método del ácido dinitrosalicílico o DNS (Miller et al., 1960). Se hizo una curva estándar de glucosa que se trató como se describe posteriormente para las muestras.

Para cuantificar la actividad de amilasas en las muestras se utilizó una solución de almidón soluble al 1 % (p/v) como sustrato, disuelto en amortiguador de fosfatos (0.1M, pH= 6.1). Los extractos enzimáticos se obtuvieron como se describe previamente. En tubos de 10 mL se preparó un blanco general (BG) con 0.9 mL de sustrato y 0.1 mL de amortiguador, así como tubos para blancos de muestra (BM) y análisis de muestras (AM) adicionando 0.9 mL de sustrato. Luego se pusieron todos los tubos en baño de agua a 40 °C y después de 1 min se agregó 0.1 mL de extracto a los tubos (AM), mientras que en los tubos (BG) y (BM) se adicionaron 1.5 mL de reactivo DNS. Los tubos se incubaron 30 min antes de agregar 1.5 mL de reactivo DNS (sólo a los tubos AM) para detener la reacción. En los tubos del BM se agregó 0.1 mL de extracto crudo enzimático y todos los tubos se pusieron a ebullición 5 min, luego se colocaron en agua con hielo por 5 min, y se retiraron hasta alcanzar la temperatura ambiente. Finalmente se leyó la absorbancia a 640 nm en un espectrofotómetro (Beckman™ DU-640). Una unidad internacional de amilasas se definió como la cantidad de enzima que libera un µmol de glucosa por min bajo las condiciones del ensayo.

Análisis estadístico

El diseño experimental fue completamente al azar y la determinación de las variables se realizó cada 24 h. Con los datos se realizó un análisis de varianza utilizando la prueba de Tukey-Kramer (p<0.05), para lo cual se usó el programa estadístico SPSS 13 para Windows.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Perfiles de producción de conidios y de pH

En la Figura 1 se observa que al aumentar la concentración de CO₂ la producción de conidios disminuyó 70 % al final del cultivo. La cantidad máxima de conidios (1.14×10⁹ con gssi^-1) se obtuvo con el tratamiento AN, mientras que con el tratamiento 21-5 y recambio cada 24 h fue de 1.80×10⁸ con gssi^-1, siendo significativamente distintos (p<0.05).

El efecto del CO₂ se observó desde las primeras 24 h posteriores al inicio del recambio. Además, el tiempo de máxima producción de conidios para la atmósfera AN fue al día 7, mientras que para los tratamientos con CO₂ fue 24 h después (Figura 1).

Dalla-Santa et al. (2005) usaron bagazo de caña y residuos de papa para producir conidios de B. bassiana; sin embargo, el inóculo inicial (10⁷ con gssi^-1) fue un orden de magnitud superior al del presente estudio, y después de 10 d de cultivo estos autores reportan una producción máxima de 1.1×10¹⁰ con gssi ^-1. El efecto que tiene el nivel de inóculo sobre el rendimiento y productividad de conidios fue descrito por Nuñez-Gaona et al. (2010).

Desgranges y Durand (1990) estudiaron el efecto del incremento de CO₂ sobre dos especies de Aspergillus y una de Trichoderma en CMS y encontraron que con un incremento de 4 % la producción de conidios de Aspergillus disminuyó al menos 50 %; en contraste, no hubo efecto sobre la cepa de Trichoderma. Esto indica que la sensibilidad al CO₂ es muy distinta entre especies de hongos filamentosos. Asimismo, a una concentración de CO₂ de 20 %, se observó inhibición en la conidiación en las tres especies de hongos utilizadas.

Respecto a los perfiles de pH, se observaron variaciones en los tres tratamientos durante el cultivo, aunque en el día 8 los valores (pH = 5.7) no fueron significativamente distintos (p> 0.05) (Figura 2). En general, para obtener conidios de B. bassiana se han estandarizado los valores iniciales de pH entre 6 y 7 (Dalla-Santa et al., 2005; Rodríguez-Gómez et al., 2009). Además, los valores de pH podrían disminuir debido a la producción elevada de intermediarios del ciclo de Krebs, por la regulación directa del CO₂ sobre algunas enzimas de esta ruta metabólica (Cordon y Schwartz, 1962; McIntyre y McNeil, 1998).

Perfiles de actividad de amilasas

Los perfiles de actividad específica de amilasas muestran que la producción de estas enzimas se incrementó al aumentar la cantidad de CO₂, sin importar la frecuencia del recambio (Figura 3). Se observaron picos de actividad al día 6 del cultivo para todos los tratamientos; aunque sí hubo un efecto debido a la periodicidad de los recambios, ya que al realizarlo cada 12 h se logró la mayor actividad específica (6.54 UI mg^-1 proteína), lo cual representa un incremento del 100 % (p< 0.05) respecto al valor obtenido con el tratamiento AN (3.21 UI mg^-1 proteína).

Los rendimientos de amilasas aumentaron constantemente hasta el final del cultivo, en mayor medida desde que inició el recambio atmosférico con CO₂ (Figura 4). El mayor rendimiento (16.58 UI gssi^-1) se obtuvo con el tratamiento 21-5 y recambio cada 12 h, siendo tres veces mayor al valor obtenido con la atmósfera AN (5.41 UI gssi^-1). Estos resultados contrastan con lo reportado para hongos del género Aspergillus donde se observó que la producción de amilasas no se modificó al aumentar hasta 20 % la concentración de CO₂ (Desgranges y Durand, 1990).

El efecto del CO₂ sobre el crecimiento, producción de metabolitos secundarios y producción de enzimas se ha estudiado con distintos hongos filamentosos en CL y CMS. En este sentido, la presencia de CO₂ puede alterar la síntesis de enzimas y la actividad de las mismas (Desgranges y Durand, 1990; McIntyre y McNeil, 1998). Respecto a amilasas, la actividad de α-amilasa disminuye al reducir la concentración de O₂ (Rahardjo et al., 2005). Además, la medición de la actividad de dichas enzimas se realiza con extractos libres de micelio obtenidos por filtración, lo cual sugiere que la actividad medida corresponde a enzima extracelular (Goto et al., 1998; Mitidieri et al., 2006; Salas-Hernández et al., 2006). Sin embargo, se ha determinado la presencia de amilasas intracelulares en especies de los géneros Aspergillus, Cryptococcus y Saccharomycopsis (van der Kaaij et al., 2007). Para hongos entomopatógenos, no se conoce el efecto del CO₂, acumulado por el metabolismo o añadido de manera exógena, sobre las enzimas requeridas para degradar los sustratos, como arroz en este estudio. Respecto a hongos entomopatógenos, Lord (2009) modificó la atmósfera (16 % O₂ y 40 % de CO₂), y esta modificación sólo se aplicó durante bioensayos con Tribolium castaneum (Herbst); el resultado fue que la presencia de CO₂ aumentó la mortalidad de los insectos infectados con B. bassiana.

CONCLUSIONES

El incremento de CO₂ debe considerarse en la producción de enzimas debido al efecto positivo en la actividad específica y en el rendimiento de las amilasas totales, con énfasis en los recambios más frecuentes.

Una contribución del presente estudio fue mostrar la respuesta diferencial de Beauveria bassiana a la acumulación de CO₂ en el rendimiento de conidios y de amilasas, lo cual no se ha descrito hasta el momento.

AGRADECIMIENTOS

Al CONACYT por la beca otorgada a P. M. Garza-López y por el proyecto de Ciencia Básica 152420-Z, a la UAM-Iztapalapa y a la Red Promep por el financiamiento conjunto para esta investigación.

LITERATURA CITADA

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