Concentración de azadiractina, efectividad insecticida y fitotoxicidad de cuatro extractos de Azadirachta indica A. Juss.

Azadirachtin concentration, insecticide efficacy and phytotoxicity of four neem Azadirachta indica A. Juss. extracts

Gabriela Esparza–Díaz¹, José López–Collado¹, Juan A. Villanueva–Jiménez^1*, Francisco Osorio–Acosta¹, Gabriel Otero–Colina², Eloy Camacho–Díaz³

¹ Agroecosistemas Tropicales, Campus Veracruz. Colegio de Postgraduados. Km. 88.5. Carretera Xalapa–Veracruz, 91690, Municipio. Manlio F. Altamirano, Veracruz, Veracruz. México. * Autor responsable: (javj@colpos.mx).

² Fitosanidad. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México.

Recibido: Enero, 2010.
Aprobado: Septiembre, 2010.

Resumen

La preparación de bioinsecticidas efectivos a base de neem (Azadirachta indica A. Juss.) requiere extraer y concentrar sus activos, debido a que no se encuentran en altas cantidades de forma natural. Para ello se compararon los extractos de neem por extrusión simple, extrusión metanólica en frío (metanólico), Soxhlet–hexano (hexánico) y acuosa (acuoso) en cuanto a la concentración de azadiractina (AZA) y su efectividad insecticida sobre Aphis gossypii Glover, así como posibles efectos tóxicos sobre Ixora coccinea L. El diseño experimental fue completamente al azar, se realizó un análisis de varianza con los datos y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05). Los análisis de los extractos por HPLC mostraron concentraciones significativamente diferentes de 2478, 565, 422 y 150 ppm de AZA en el extracto metanólico, hexánico, oleoso y acuoso. El bioensayo para determinar el efecto insecticida y la fitotoxicidad de los extractos consistió en exponer 10 ninfas de A. gossypii a hojas de I.coccinea tratadas con cada extracto a dosis de 0.01, 0.1 y 0.2 mg de AZA en 5 cm², y un testigo con agua, con tres repeticiones. La mortalidad se midió a 24, 48 y 72 h. Sólo el extracto oleoso produjo lesiones en 35 % del área foliar tratada con daño medio y nivel 5 de fitoxicidad en I.coccinea. Se encontraron diferencias significativas en la mortalidad de A. gossypii por tipo de extracto, tiempo y dosis, así como en las interacciones dosis tiempo y dosis tipo de extracto. El extracto con el mayor potencial insecticida fue el metanólico (0.2 mg AZA), con 100 % de mortalidad a 48 y 72 h (p≤0.0001). La aplicación simultánea del metanol en extrusión extrae más AZA de la semilla de A. indica, lo cual promueve una mayor actividad insecticida.

Palabras clave: extracto metanólico, neem, tetranortriterpenoide.

Abstract

Key words: methanolic extract, neem, tetranortriterpenoid.

INTRODUCCIÓN

El árbol del neem Azadirachta indica A. Juss. contiene diversos componentes con actividad insecticida, de los cuales el más importante es la azadiractina (AZA), un tetranortriterpenoide natural (NIIR Board, 2004). Sin embargo, la concentración de los compuestos bioactivos del neem no es alta en las diferentes partes de la planta. La preparación de bioinsecticidas efectivos a base de neem requiere que el proceso de extracción separe e incremente el contenido de AZA y otros componentes relacionados con la actividad insecticida de los extractos. Para la extracción de AZA se han propuesto varios métodos y destacan aquellos que usan como solvente al etanol (Larson, 1985), hexano, acetona, acetato de etilo y metanol (Koul y Wahab, 2004). También se ha evaluado el uso de isopropanol con evaporación al vacío (Moorty y Kumar, 2004) o gases licuados (D'Andrea etal, 1994).

Los extractos comerciales de la semilla de A. indica se valoran primordialmente por el contenido de AZA en sus formas estructurales (Sharma et al., 2003), pero rara vez por los terpenoides que ejercen efectos aditivos a la acción insecticida (Siddiqui et al., 2002). Adicionalmente, los aceites contenidos en los extractos de neem les confieren propiedades penetrantes y de sinergia con la AZA y otros componentes (Stark y Walter, 1995).

El efecto de la AZA depende de su dosis y de la especie plaga a controlar, ya que puede reducir la alimentación, supervivencia, viabilidad de ninfas, progenie, e incluso puede producir toxicidad aguda. Aunque la AZA se ha usado para controlar áfidos, se requieren concentraciones mayores a 100 ppm para inducir un efecto primario antialimentario (Nisbet et al, 1993), el cual se puede deber a su escasa movilidad en el floema (Schmutterer, 1985). Además de una disminución en la alimentación, los sustratos impregnados con AZA pueden reducir la supervivencia de Macrosiphum rosae L. y Macrosiphoniella sanbornii Guíete (Koul, 1999). Según Nisbet et al. (1994), se reduce la cantidad de ninfas viables producidas por adultos ápteros con una dieta con 25 ppm de AZA durante 24 a 52 h. Incluso, Lowery e Isman (1996) indican que las aplicaciones de 1 % de aceite de A. indica redujeron la progenie de Myzus persicae Sulzer en 82 % y la de Nasonovia ribisnigri Mosley en 66 %. El extracto acuoso de semilla de A. indica provoca mortalidad de Aphis nerii Boyer, aunque no logra prevenir que éste transmita el virus de la mancha anular del papayo (Hernández–Castro et al., 2005).

El pulgón del melón (Aphisgossypii Glover) es una plaga que ataca numerosos cultivos, entre ellos plantas ornamentales del género Ixora (Rubiaceae) (Imenes et al., 2002), y se presenta comunmente sobre arbustos de Ixora coccinea L. Esta planta es importante para la industria de jardinería y floristería, y representa un recurso para las aves silvestres (Pérez–Rivera, 2000). Aunque I.coccinea es un hospedero habitual para A. gossypii en la zona Centro de Veracruz, no hay estudios sobre su control en esta planta y el manejo de este áfido en otros cultivos se ha basado en insecticidas químicos convencionales. Para el control de A. gossypii se buscan productos menos agresivos al ambiente, incluyendo a la AZA obtenida por diferentes procesos, por lo que se han probado los extractos de neem (Dos Santos et al., 2004). Khalequzzaman y Nahar (2008) señalan una CL₅₀ de 0.34 μg cm^–2 de AZA para A gossypii, mientras que el NIIR Board (2004) presenta una CL₅₀ de 10 ppm de AZA para el extracto etanólico de neem en campo, contra esta especie. Según Dos Santos et al. (2004), la supervivencia y la fecundidad de ninfas del pulgón del melón se reducen con el extracto acuoso de semillas de neem. Así, la mortalidad de este áfido puede estar relacionada con la dosis de AZA e incluso con el tipo de extracto de la semilla de neem.

Los objetivos de esta investigación fueron: 1) comparar la concentración de azadiractina en los extractos oleoso, acuoso, metanólico y hexánico de semillas de A indica A. Juss.; 2) evaluar su efectividad insecticida sobre A. gossypii Glover y su efecto fitotóxico en la planta ornamental I.coccinea L.

Semilla de neem

En el presente estudio se usó semilla de A. indica de la cosecha 2004 de una plantación de árboles de 13 años, ubicada en el Campus Veracruz del Colegio de Postgraduados, en el Municipio de Manlio F. Altamirano, Veracruz, México (19° 11.658' N y 96° 20.069' O), 27 m de altitud y clima cálido subhúmedo Aw₀(w) (e). Todos los extractos se obtuvieron de 20 kg de semilla de neem con endocarpio, previamente despulpada, seca y molida (en lo sucesivo, semilla–endocarpio o semilla). Se realizó un análisis por triplicado del contenido de AZA de una muestra compuesta de 1.0 kg de semilla endocarpio, con endocarpio, de la misma cosecha destinada a las extracciones; la semilla se trató con metanol y se usó la metodología HPLC (Schneider y Ermel, 1987) con el sistema modular Perkin Elmer certificado por ISO–9000. El contenido de AZA en la semilla–endocarpio fue un valor de referencia para comparar los extractos.

Extractos de neem

Los solventes usados para elaborar los extractos fueron alcohol metílico (metanol 99.96 %) y hexano (n–hexano, peb @ 55–63 °C), ambos de grado industrial, y agua destilada. El extracto de neem por extrusión simple se obtuvo con un equipo piloto de diseño vertical, que consiste en un cilindro de acero inoxidable con capacidad para 1 kg de semilla–endocarpio, con un sistema hidráulico manual (presión de 20 kg cm^–2); el cilindro tiene un orificio de salida y un recolector del extracto oleoso. Para extraer por extrusión con metanol en frío, la muestra de 1 kg de semilla–endocarpio de A indica se sumergió 30 min en 0.15 L de metanol y se efectuó la extracción por extrusión descrito para el extracto metanólico.

La extracción con el método Soxhlet–hexano se efectuó con 0.5 L de hexano, de acuerdo al procedimiento 936.15 de la AOAC (1990). Hubo cuatro ciclos de contacto entre el solvente y la semilla–endocarpio de A. indica, se evitó la caída del solvente y se retiró el matraz con la solución. Al final se evaporó el solvente para obtener el extracto hexánico.

Para la extracción acuosa se humedeció 1 kg de semilla–endocarpio de A. indica en 1.76 L de agua por 24 h. La suspensión cruda se filtró con malla metálica de 2 mm Ø, seguida de papel filtro rápido Whatman 41^® y se obtuvo el extracto acuoso.

El porcentaje en peso (EO) de la cantidad de extracto obtenido (WE; g) para la cantidad de semilla procesada (WS; g) se calculó como rendimiento con la ecuación (1) (Happel y Jordan, 1981):

Se obtuvieron tres extracciones a temperatura ambiente en el laboratorio para cada disolvente.

La concentración de AZA en cada extracto se determinó para comparar la eficiencia de extracción, en el Laboratorio de Alta Tecnología de Orizaba, Universidad Veracruzana (Orizaba, México). Las condiciones de corrida en cromatografía para las soluciones metanólicas de AZA fueron: columna 125 mm x 4 mm; tasa de flujo: F 2 mL min^–1; detector: UV–VIS; longitud de onda: λ 214 nm; volumen de muestra: 20 μL; fase móvil: acetonitrilo, H₂O; tiempo de retención relativo tR: 2.504 min. Como estándar se usó azadiractina al 95 % (Sigma^®) (C₃₅, H₄₄, O₁₆; w.m. 720.72). Se determinó la concentración de AZA (ppm) en tres muestras de cada extracto. El diseño experimental fue completamente al azar con tres repeticiones. Para conocer el efecto del proceso de extracción se comparó su relación con la concentración estandarizada (ppm) de AZA mediante ANDEVA y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05).

Las concentraciones de AZA en la semilla–endocarpio (AZAS) y en los extractos (AZAE) sirvieron para calcular el porcentaje de AZA extraída como rendimiento (p/p; AZAR), presente en la cantidad de extracto (WE, g) por cada 100 g de semilla–endocarpio (WS), con la ecuación (2) (Happel y Jordan, 1981):

El porcentaje de AZA extraída (AZAR) en los procesos fue cuantificado por triplicado para cada extracto y examinado, previa transformación ln, mediante ANDEVA y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05). Los valores de AZAR presentados son los datos no transformados.

Bioensayos de extractos de neem sobre A. gossypii

El pie de cría de A. gossypii Glover se obtuvo de brotes de I. coccinea en Tolome, estado de Veracruz, México. Plantas adicionales de esta especie se cultivaron en macetas de 2 L en una casa sombra libre de plaguicidas, se regaron periódicamente y se agregaron ácidos fúlvicos QF^® para mantener su vigor. Se depositaron 30 ejemplares no parasitados de A. gossypii en tres jaulas de 1.0 m³ cubiertas de malla antiáfidos, en tres plantas de I. coccinea, las que se sustituyeron por plantas sanas según fue requerido. Los ensayos se realizaron cuando la cría contaba con 20 a 25 generaciones del áfido.

Hojas de I. coccineacon pecíolo se desinfectaron en una solución 0.035 % de hipoclorito de sodio y lavadas con agua destilada. El pecíolo de cada hoja fue introducido en tubo de ensaye con 10 mL de solución nutritiva Murashige y Skoog (Sigma^® MS5524); la boca del tubo se selló con Parafilm^® para evitar la evaporación de la solución nutritiva. La evaluación se realizó a 24.8±0.7 °C, HR de 70±6 % y fotoperiodo de 12: 12 h luz: oscuridad.

Los extractos se aplicaron con micropipeta en 5 cm² de hojas de I. coccinea, en dosis equivalentes a 0.01, 0.02 y 0.2 mg de AZA. En el extracto metanólico se usó dietilienglicol como excipiente inactivo en relación 1:4, para lograr la dosis equivalente de AZA después del secado. Una hora después de aplicar el extracto se colocaron 10 ninfas de tercer instar de A. gossypii sobre la hoja tratada en una caja–clip (Villanueva–Jiménez et al., 1992). Este proceso se repitió cinco veces para cada dosis en los cuatro extractos. Como testigo se usaron hojas tratadas con agua destilada. Un áfido se consideró muerto cuando perdió la capacidad para moverse a las 24, 48 y 72 h de exposición al insecticida. Este experimento tuvo un diseño factorial con cuatro tipos de extracto, tres dosis de AZA y tres tiempos de exposición, con la mortalidad de A. gossypii como variable respuesta. El análisis estadístico se realizó mediante el procedimiento GLM (SAS Institute Inc., 1999); las comparaciones de medias se realizaron con contrastes no ortogonales (p≤0.05).

Fitotoxicidad de extractos de neem

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Concentración de azadiractina en la semilla de neem

La semilla con endocarpio presentó una concentración promedio de 1820 ppm de AZA, valor que está dentro del intervalo de 430 a 3830 ppm de AZA, obtenido en semilla de la región Andhra Pradesh en la India (Pattnaik et al, 2006), incluso mayor a la encontrada en 12 estados del mismo país (200 a 1600 ppm) (Kaushik et al, 2007), pero menor a la de algunas zonas de Tailandia (3430 ppm) donde la semilla se usa para proceso industrial (Sanguanpong, 2003). De acuerdo con lo anterior, la concentración de AZA de la semilla proveniente del lote de Veracruz es adecuada para uso industrial como bioinsecticida.

Concentración de AZA en los extractos de neem

La mayor concentración de AZA en los extractos de neem (p≤ 0.0001) se obtuvo con el extracto metanólico (2478 ppm), respecto a los otros extractos (Cuadro 2) los cuales presentaron valores similares de AZA (p>0.05). El proceso de extrusión con metanol produjo un porcentaje de extracto significativamente menor al obtenido por Soxhlet–hexano o la extracción acuosa (p≤0.0001), pero el porcentaje de AZA extraída fue tan alto como el de ambos extractos (p>0.05) (Cuadro 2). Este proceso promueve la extracción de la AZA contenida en semilla–endocarpio mediante la interacción de los grupos hidroxilos presentes en AZA y en metanol (Schroeder y Nakanishi, 1987).

El equipo piloto de extracción para la extrusión con metanol logró concentrar 1.4 veces la AZA contenida en la semilla–endocarpio, mayor al desempeño de un equipo desarrollado en Tailandia para extracción metanólica (RIT–pilot), con 3430 ppm de AZA en el extracto a partir de 5200 ppm de AZA en la semilla (Sanguanpong, 2003). En la mayoría de los casos, los extractos comerciales de neem sólo contienen 0.3 % de AZA (Ramesh y Balasubramanian, 1999). Así, la aplicación simultánea del solvente metanol y la extrusión permite extraer más AZA de la semilla de A. indica. Hasta ahora ambos procesos se habían usado por separado, dejando a la AZA sin otras moléculas que potencialmente aumentan la actividad insecticida.

La mortalidad de A. gossypii en el bioensayo (Figura 1) no fue afectada significativamente por la interacción extracto dosis tiempo (p=0.74) ni la interacción extracto tiempo (p=0.051). Las interacciones dosis tiempo (p≤ 0.0001) y dosis extracto (p≤ 0.0001) fueron significativas. En cuanto a los efectos principales, el tiempo de observación (p≤0.0001), el tipo de extracto (p≤0.0001) y la dosis de AZA (p≤ 0.0001) tuvieron efectos significativos en la mortalidad. Sin embargo, debido a las interacciones significativas encontradas, fue necesario analizar los efectos simples para cada interacción.

La interacción dosis tiempo se explica por la prevista escasa mortalidad en el testigo (0.0 mg AZA) durante los tres periodos de observación, mientras que en las demás dosis la mortalidad aumenta con el tiempo (Cuadro 3). La mortalidad de A. gossypii se incrementa tanto al aumentar la dosis como el tiempo, excepto en la dosis más alta del extracto metanólico donde su mortalidad máxima se alcanza desde las 48 h, lo cual posiblemente se debe a que la dosis alta de AZA pudo haber entrado al sitio activo más rápidamente gracias al solvente, pudiendo perturbar el desarrollo del pulgón del melón desde un día antes. Además, el efecto antialimentario se ha registrado en varias especies de insectos, lo que significa un deterioro en la alimentación primaria y secundaria del insecto, con el aumento de su mortalidad (Koul yWahab, 2004).

Aunque los áfidos son menos susceptibles al efecto antialimentario primario por la AZA, el efecto fisiológico ocurre y se manifiesta con una reducción de la reingesta (efecto antialimentario secundario) (Nisbet etal, 1993; Koul y Wahab, 2004). En el presente estudio se observó que la mortalidad de A. gossypii aumentó con el tiempo y con la cantidad de AZA. La mortalidad se incrementó con la dosis en todos los tiempos de observación, con los valores más altos de mortalidad promedio (74 y 75 %) a las 72 h, con 0.02 y 0.2 mg de AZA (Cuadro 3).

En la interacción significativa dosis extracto, la mortalidad ocasionada por los extractos metanólico y acuoso también se aumenta con la dosis, aunque no fue así en los extractos hexánico y oleoso cuyo efecto decayó en la mayor dosis (Cuadro 4). En el extracto hexánico hubo una baja mortalidad con un valor promedio (31 %) en la dosis intermedia (0.02 mg AZA) y mayor (61 %) para el extracto oleoso. Con la dosis más alta (0.2 mg AZA) todos los extractos mostraron valores de mortalidad significativamente diferentes, con 88 % para el metanólico, seguido por el oleoso, acuoso y hexánico. Con las dosis de 0.01 y 0.02 mg de AZA se observaron dos grupos: con alta mortalidad el oleoso y metanólico, y con baja el acuoso y hexánico.

La mortalidad ocasionada por el extracto oleoso no se puede considerar satisfactoria para plaguicidas comerciales; quizás por eso el NIIR Board (2004) lo señala como inactivo en el pulgón del melón a pesar de tener una proporción importante de AZA. Con la extrusión simple el extracto oleoso tuvo 422 ppm de AZA, una concentración mayor a la lograda por extractos oleosos derivados de procesos por bipartición vía solvente, como el aceite comercial de neem TB 184^® (lote: 3027), que al ser analizado de forma paralela en este estudio presentó únicamente 160 ppm de AZA. Quizás se deba a que durante los procesos de extracción que inician con el exprimido de la semilla (Lidert et al., 1995; Sanguanpong, 2003), la AZA arrastrada no se recupera posteriormente.

La mortalidad más alta promedio de los tres tiempos de observación (88 %) se presentó en la dosis mayor de AZA (0.2 mg) del extracto metanólico, la cual fue significativamente diferente de los demás extractos. La mortalidad por cada tiempo de observación (Figura 1D) es cercana a 100 % desde las 48 h y significativamente diferente (p≤0.0001) al resto de los extractos; lo mismo ocurre a las 72 h (p≤0.004). La mayor mortalidad del extracto metanólico puede atribuirse a su alto contenido de AZA, además, este extracto contiene a los ácidos palmítico, esteárico, oleico y linoleico (Kaushik y Vir, 2000) producto de la extrusión de la semilla, componentes oleosos que, conjuntamente con el metanol, podrían extraer otros activos importantes de la semilla y del endocarpio, como nimbina, salanina, nimbidina y otros limonoides (Bahena–Juárez y García–Chávez, 2007). Dichos compuestos oleosos también pudieron fungir como agentes penetrantes que mejoran el desempeño insecticida (Stark y Walter, 1995).

Aunque A. gossypii fue expuesto a las mismas dosis de AZA hubo diferencias significativas en la mortalidad entre extractos, lo cual fue observado por Gauvin et al. (2003) y Kumar et al. (2003), quienes señalan que no hay una relación proporcional entre la cantidad de AZA y el efecto insecticida. Estas diferencias en la mortalidad en A. gossypii podrían resultar de la presencia en diferentes concentraciones de compuestos bioactivos de la semilla y el endocarpio, como salanina, nimbina (Mitchell et al., 1997) y azadiractol (Malathi et al., 2002), que pueden modificar el efecto insecticida. Además, los ácidos grasos de la semilla pueden actuar en sinergia con la AZA (Kurose y Yatagai, 2005) en la mortalidad de A. gossypii. Este punto de vista ha redirigido la investigación e industrialización de la AZA hacia el aprovechamiento integral del extracto de neem con la inclusión de salanina, nimbina y otros compuestos de la fracción oleosa de la semilla. Por lo anterior, se comparte la opinión de Gauvin et al. (2003), quienes enfatizan la importancia de evaluar la actividad insecticida de cada extracto de neem considerado como un complejo de ingredientes activos, lo que supera la visión de considerar únicamente al contenido de AZA.

El proceso de extrusión en frío con metanol produce un extracto con mayor contenido de AZA y mayor efecto insecticida, prometedor para su escalamiento industrial. El efecto insecticida de los extractos oleoso, acuoso y metanólico sobre A. gossypii concuerda con resultados de ensayos realizados por Dos Santos etal. (2004) y NIIR Board (2004). Los extractos oleoso y acuoso sólo causaron una moderada mortalidad en A. gossypii, lo que junto con su baja concentración de AZA podría limitar su utilización industrial.

Efecto fitotóxico de los extractos de neem en Ixora coccinea

CONCLUSIONES

El proceso de extracción en frío con metanol de la semilla molida con endocarpio de Azadirachta indica A. Juss., concentró más azadiractina que los otros procesos. Además produjo el mayor efecto insecticida en Aphis gossypii Glover, sin causar fitotoxicidad asociada en Ixora coccinea L.

El extracto oleoso de A. indica produjo una mortalidad menor que el extracto metanólico y ocasionó un efecto fitotóxico en hojas de I. coccinea.Tanto el extracto acuoso como el hexánico contuvieron menos azadiractina que el extracto metanólico y su actividad insecticida fue menor.

AGRADECIMIENTOS

Esta investigación tuvo el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, del Colegio de Postgraduados, y de los investigadores Héctor Debernardi De la Vequia, Rebeca Peña Martínez y Juan Villanueva Barradas^†.

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