Polimorfismo genético de la β–lactoglobulina en la leche de vacas Holstein y criollo lechero tropical

Genetic polimorphism of β–lactoglobulin in cow's milk of Holstein and tropical milking criollo

Martín A. Meza–Nieto^1,2, Aarón F. González–Córdova¹, Carlos M. Becerril–Pérez³, Felipe J. Ruíz–López⁴, Pablo Díaz–Rivera³, Belinda Vallejo–Cordoba¹*

¹ Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. (CIAD). Carretera a La Victoria, Km. 0.6, Hermosillo, Sonora. 83000. México. * Autor responsable: (vallejo@ciad.mx).

² Centro de Investigación en Ciencia y Tecnología de los Alimentos (CICyTA). Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo. Abasolo 600 Col. Centro, Pachuca, Hidalgo. 43600. México.

⁴ INIFAP. Km 1. Carretera a Colón. Ajuchitlán, Colón, Querétaro. 76280. México.

Recibido: Marzo, 2009.
Aprobado: Diciembre, 2009.

RESUMEN

Las variantes genéticas (A y B) de la β–lactoglobulina en la leche se han asociado con propiedades tecnológicas importantes en el procesamiento de lácteos. Los objetivos de este estudio fueron determinar las variantes genéticas y estimar las frecuencias fenotípicas de la β–lactoglobulina (β–LG), en leche de vacas Holstein y Criollo Lechero Tropical (CLT), así como evaluar el efecto de los fenotipos en la concentración total de β–LG. El fenotipo se determinó en 382 muestras de leche de vacas Holstein y 64 de CLT. Las variantes genéticas identificadas por electroforesis capilar en zona libre fueron A y B, con genotipos AA, AB y BB. Las frecuencias genotípicas (0.14, 0.33 y 0.53 en CLT; 0.19, 0.57 y 0.24 en Holstein) se compararon usando la prueba de Chi–cuadrada (χ²) y fueron diferentes (p<0.01) entre ambas razas. La concentración total de la β–LG en leche fue mayor (p<0.05) cuando estuvo presente el alelo A. La concentración total de la β–LG de acuerdo con el fenotipo siguió el orden AB > AA > BB para ambas razas; estas diferencias fueron significativas en vacas CLT. El análisis de los resultados sugiere que las características fisicoquímicas y tecnológicas de la leche de vacas CLT podrían ser diferentes a las de las vacas Holstein.

Palabras clave: β–lactoglobulina A, β–lactoglobulina B, polimorfismo.

The genetic variants (A and B) of the β–lactoglobulin in cow's milk has been associated with important technological properties in dairy processing. The objectives of this study were to determine the genetic variants and to estimate the phenotypic frequencies of β–lactoglobulin (β–LG) in cow's milk of Holstein and Tropical Milking Criollo (TMC), as well as to evaluate the effect of the phenotypes on the total concentration of β–LG. The phenotype was determined in 382 milk samples of Holstein and 64 of TMC. The genetic variants identified by capillary electrophoresis in free zone were A and B, with genotypes AA, AB and BB. The genotypic frequencies (0.14, 0.33 and 0.53 in TMC; 0.19, 0.57 and 0.24 in Holstein) were compared using the Chi–squared test (χ²) and were different (p<0.01) in the two breeds. The total concentration of β–LG in milk was higher (p<0.05) when the allele A was present. The total concentration of β–LG according to the phenotype followed the order AB > AA > BB for both breeds; these differences were significant in TMC cows. The analysis of the results suggests that the physical–chemical and technological characteristics of TMC cow's milk could be different from those of the Holstein cows.

Key words: β–lactoglobulina A, β–lactoglobulina B, polymorphism.

INTRODUCCIÓN

En la leche hay dos tipos de proteínas que representan 3.0 a 3.5 % de la materia seca; de ésta 80 % son caseínas insolubles con un pH isoeléctrico de 4.6 y el resto son proteínas séricas solubles al mismo pH (Tienstra et al., 1992; de Jong et al., 1993). Las caseínas de la leche, así como las globulinas, se consideran polimórficas ya que sus variantes genéticas presentan sustitución o eliminación de un aminoácido a lo largo de la cadena polipeptídica (Ng–Kwai–Hang et al., 1990). Se han identificado diversas variantes de las proteínas α_s1–caseína, α_s2–caseína, β–caseína, κ–caseína, α–lactoglobulina y β–lactoalbúmina.

La proteína sérica β–lactoglobulina (β–LG) presenta tres variantes genéticas principales, A, B y C (Paterson et al., 1995a). La variante A difiere de la B en dos aminoácidos, ácido aspártico y valina en la posición 64 y 118 que son sustituidos por glicina y alanina (Bell et al., 1981). La variante C se genera por la sustitución de la glutamina por una histidina en la posición 59 de la variante B (Paterson et al., 1995a). Las diferentes formas polimórficas de las proteínas de la leche bovina están controladas por genes autosómicos, los cuales son heredados de acuerdo con las leyes de Mendel (Baker y Maxwell, 1980; Creamer et al., 1996; Ng–Kwai–Hang, 1998). Las variantes A y B de la β–LG se encuentran en vacas Holstein, Ayshire y Pardo Suizo (Ng–Kwai–Hang et al., 1987; Paterson et al., 1995a; Ng–Kwai–Hang y Kim, 1996), mientras que la variante C está en vacas Jersey, aunque con menor frecuencia que las A y B (Paterson et al., 1995b).

La raza Criollo Lechero Tropical (CLT) derivó de poblaciones de bovinos introducidos a América durante la conquista y se utiliza en las tierras bajas de la vertiente del Golfo de México (Rosendo–Ponce y Becerril–Pérez, 2002). Este ganado muestra resistencia a plagas y enfermedades, por lo que se adapta a condiciones tropicales adversas; además, tiene alta fertilidad y buena capacidad para producir leche (De Alba y Kennedy, 1994; González–Cerón et al., 2009). Sin embargo, no se encontraron estudios respecto a las variantes genéticas de las proteínas en leche de CLT.

La determinación del polimorfismo genético de las proteínas de la leche puede contribuir al mejoramiento de la producción y calidad de la leche, y de los productos lácteos (Ng–Kwai–Hang, 1998). En particular, la variante B de la β–LG está asociada con un mayor rendimiento de queso y a una menor producción de leche (Ng–Kwai–Hang, 1998). Por tanto, es importante determinar las variantes de la β–LG en la leche bovina. Los objetivos de este estudio fueron determinar las variantes genéticas y estimar las frecuencias fenotípicas de la β–LG en leche de vacas Holstein y CLT, así como evaluar el efecto de los fenotipos en la concentración total de β–LG.

Muestreo

Se analizaron muestras de leche de 382 vacas Holstein de dos hatos ubicados en el estado de Querétaro, adscritos a la Asociación Holstein de México, y de 64 vacas CLT del campo experimental del Colegio de Postgraduados ubicado en Tepetates, Veracruz.

Las muestras de leche (100 mL) fue cantidades iguales de las ordeñas matutina y vespertina en vacas Holstein, y en las CLT sólo de la ordeña matutina. En cada muestra de leche fresca se adicionó bronopol 2–bromo–2–nitro1, 3 propanediol como conservador. Las muestras fueron almacenadas a –20 °C hasta su análisis.

Reactivos

Los estándares de proteínas alfalactoalbúmina (α–LA; 85% pura), variante A de la β–LG (β–LG A; 100% pura) y variante B de la β–LG (β–LG B; 100% pura), y además bronopol 2–bromo–2 nitrol, 3 propanediol, y el detergente Tween 20, fueron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA); amortiguador de boratos (0.3 M, pH 8.5) con polímero modificado de Bio–Rad Laboratorios (Hercules, CA, USA).

Preparación de las muestras

En un tubo de ensayo 5.0 mL de leche fueron acidificados (pH 4.6)con 90 µL de HCl 4 N. La muestra fue centrifugada 15 min a 3000 g, el sobrenadante (suero) se filtró (Millipore 0.22 µm) hasta obtener por lo menos 1.5 mL del cual se tomó una alícuota de 1.0 mL y se diluyó con 4.0 mL (1:4) en solución amortiguadora para muestra (boratos 8.25 mM, 0.1 % Tween 20, pH 8.0). Se tomaron 200 µL de suero diluido y se vertieron en un vial de plástico para su análisis por electroforesis capilar.

Determinación de fenotipos de variantes genéticas de la β–LG

La separación de las variantes genéticas de la β–LG se hizo en zona libre (ECZ) según Olguin–Arredondo y Vallejo–Cordoba (1999), por electroforesis capilar (HP 3D, Hewlett–Packard, Wilmington, DE, USA), provisto de un capilar de sílice no recubierto (72 cm×50 mm diámetro interno) con una longitud efectiva de 63.5 cm a la ventana. Las muestras fueron inyectadas a presión con N (50 mbar por 10 s). El capilar se mantuvo a una temperatura constante de 40 °C. La separación se realizó aplicando 25 KV en una solución amortiguadora (boratos 50.0 mM, 0.1 % Tween 20, pH 8.0). La detección fue a 214 nm mediante un detector de arreglo de diodos (DAD). El capilar se lavó entre muestra con agua grado HPLC, solución capilar limpiadora (NaOH 0.1 M), agua HPLC y nitrógeno por 360 s cada una. Todas las soluciones se filtraron (0.22 µm). La identificación de la β–LG para determinar fenotipos en las muestras de leche se realizó adicionando estándares analíticos comerciales.

Se construyeron curvas de calibración para cada una de las proteínas séricas identificadas, preparadas individualmente en solución amortiguadora (boratos 8.25 mM, 0.1 % Tween 20, pH 8.0). El estándar de la proteína α–LA se preparó a 0.1, 0.25, 0.50, 1.0 y 1.5 mg mL^–1, y las proteínas β–LG A o β–LG B a 0.1, 0.25, 0.75, 2.0 y 3.0 mg mL^–1 y cada una fue inyectada por duplicado.

Análisis estadístico

La comparación de las frecuencias fenotípicas y alélicas de las variantes genéticas de la β–LG en leche entre las dos razas, se realizó mediante un análisis de Chi–cuadrada (χ²). El efecto del fenotipo de la β–LG en la concentración total de la β–LG, β–LG A y β–LG B se estimó mediante un análisis de varianza (ANDEVA) con un modelo mixto. Para ambas razas se consideró el registro del padre de la vaca como un efecto aleatorio y el fenotipo como efecto fijo. También se consideró como efecto fijo, para vacas CLT, la variable año–estación y para vacas Holstein, la variable hato–año–estación. Las variables edad de la vaca y días en leche, en sus formas lineal y cuadrática, fueron usadas como covariables en el modelo.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Determinación de variantes genéticas de β–LG

En la Figura 1 se presenta el patrón típico de separación de α–LA y de las variantes A y B de la β–LG en una muestra de leche. Se observaron patrones electroforéticos similares para las muestras de leche de vacas de ambas razas (Figura 1A). La identificación de las proteínas se verificó con el estándar respectivo. Una mayor señal en la Figura 1B mostró la identidad de la α–LA. Así, una mayor señal para las variantes B y A de la β–LG confirmó la identidad de las mismas (Figuras 1C y 1D).

La diferencia en el tiempo de migración entre la variante A y B de la β–LG se debe a una carga extra negativa presente en la variante A, la cual es conferida por el ácido aspártico (Ng Kwai–Hang y Kim, 1996). El orden de movilidad electroforética de las proteínas lácteas fue similar a reportes previos (Paterson et al., 1995a; Cattaneo et al., 1996; Olguin–Arredondo y Vallejo–Cordoba, 1999).

En el Cuadro 1 se presentan las frecuencias fenotípicas y alélicas de las variantes de la β–LG en leche de vacas Holstein y CLT. Hubo diferencias (p<0.01) en las frecuencias fenotípicas entre las razas. El fenotipo AA de la β–LG se encontró con menor frecuencia en la leche de ambas razas, mientras que el fenotipo AB fue más frecuente en la leche de vacas Holstein. En leche de vacas CLT, el fenotipo BB de la β–LG presentó mayor frecuencia (Cuadro 1).

La mayor frecuencia encontrada para el fenotipo AB de la β–LG en la leche de vacas Holstein coincide con los resultados presentados por Aleandri et al. (1990), Hill (1993) y Olguin–Arredondo y Vallejo–Cordoba (1999). La frecuencia encontrada para el fenotipo BB de la β–LG (0.24) fue similar a la publicada por Paterson et al. (1995b) para leche de vacas Holstein; pero éstas fueron inferiores a las estimadas en estudios en Australia (MacLean et al., 1984), Italia (Aleandri et al., 1990), Canadá (Ng–Kwai–Hang et al, 1990) y Nueva Zelanda (Hill, 1993).

La frecuencia encontrada en leche de vacas CLT del fenotipo AB de la β–LG (0.33) fue inferior a la observada en Holstein (MacLean et al., 1984; Aleandri et al., 1990; Ng–Kwai–Hang et al., 1990), Jersey (Paterson et al., 1995b) y Polish Black–and–White (Strzalkowska et al., 2002). Pero la frecuencia del fenotipo BB de la β–LG en leche de vacas CLT (0.53), fue superior a la estimada en Holstein (Hill, 1993; Olguín–Arredondo y Vallejo–Cordoba, 1999).

La frecuencia del alelo B de la β–LG fue superior a la del alelo A en las dos razas estudiadas (Cuadro 1). Estos resultados concuerdan con las frecuencias alélicas reportadas para leche de vacas Holstein (Van Eenennaam y Medrano, 1991; Hill, 1993; Caroli et al., 2004). La frecuencia del alelo B (0.65) en CLT fue superior a las publicadas para vacas Holstein (Van Eenennaam y Medrano, 1991; Hill, 1993; Caroli et al., 2004) y similar a la estimada en Polish Black–and–White (Strzalkowska et al., 2002).

Concentración de las variantes genéticas de la β–LG en leche

En los Cuadros 2 y 3 se muestran los rangos de concentración de los fenotipos de la β–LG presente en leche de vacas Hosltein y CLT. La concentración de las variantes A y B de la β–LG para los tres fenotipos varió en ambas razas.

En los Cuadros 4 y 5 se presentan los valores promedio de las concentraciones totales de la β–LG, β–LG A y β–LG B en leche de vacas Holstein y CLT. El efecto de fenotipo en la concentración total de β–LG y de las variantes A y B fue significativo (p<0.05). La concentración total de la β–LG de acuerdo con el fenotipo siguió el orden AB > AA > BB (Cuadros 4 y 5). Sin embargo, las diferencias entre los fenotipos AB y AA sólo fueron significativas (p<0.05) en la leche de CLT (Cuadro 5). Las variables hato–año–estación, año–estación y el registro del padre de la vaca, así como las covariables edad de la vaca y días en leche en su forma lineal y cuadrática no mostraron efecto (p>0.05) en la concentración de la β–LG.

Al comparar las concentraciones de las variantes A y B en el fenotipo AB (Cuadros 4 y 5), se encontró una concentración mayor (p<0.05) para la primera independientemente de la raza. Estos resultados concuerdan con los publicados para leche con el fenotipo AB de vacas Ayrshire, Jersey, Brown Swiss y Canadiense (Ng–Kwai–Hang y Kim, 1996). Además, la concentración de β–LG fue mayor (p<0.05) para el fenotipo AA en comparación con el BB, lo que coincide con la mayor concentración de β–LG observada cuando el fenotipo AA está presente (Cerbulis y Farell, 1975; Feagan, 1979; Kroeker et al., 1985).

Las concentraciones y proporciones relativas de las diferentes proteínas de la leche, son influenciadas por factores genéticos y ambientales (Ng–Kwai–Hang y Kim, 1996). En el presente estudio se encontró que el alelo A de la proteína se expresa más que el alelo B.

El fenotipo más frecuente en leche de vacas CLT fue BB, mientras que en Holstein fue AB. El alelo B fue más frecuente que el A en la leche de ambas razas. La concentración total de β–LG fue mayor cuando estuvo presente el alelo A, ya sea en los fenotipos AB o AA, aunque dichas diferencias fueron mayores en la leche de vacas CLT. Con base en los resultados de la presente investigación, la leche de vacas CLT podría presentar características fisicoquímicas y tecnológicas diferentes a la de Holstein.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo a los proyectos de investigación: "Conservación, mejora genética y aprovechamiento del ganado Criollo Lechero Tropical (CLT) en México" (SAGARPA–CONACYT), "Polimorfismo genético de las proteínas de la leche determinado por electroforesis capilar y espectrometría de masas: Impacto en la producción, composición y propiedades fisicoquímicas de la leche" (CONACYT Ciencia Básica G 26490–B) y "La proteómica como un campo emergente en la ciencia de la leche: Un nuevo enfoque para conocer y entender el comportamiento de las proteínas lácteas y sus interacciones (CONACYT Ciencia Básica 42340 Z)".

LITERATURA CITADA

Aleandri, R., L. Chianese, A. Di Leccia, P. Petelli, R. Mauriello, and G. Davoli. 1990. The effects of milk protein polymorphism on milk components and cheese producing ability. J. Dairy Sci. 73: 241–255.         [ Links ]

Baker, C. M., and C. Maxwell. 1980. Chemical classification of cattle. I. Breed groups. Anim. Blood Grps. Biochem. Genet. 11: 127–150.         [ Links ]

Bell, K., H. A. Mckenzie, and D. C. Shaw. 1981. Bovine B–lactoglobulin E, F and G of Bali (Banteng) cattle, Bos (bibos) javanicus. Aust. J. Biol. Sci. 34: 133–147.         [ Links ]

Caroli, A., S. Chessa, P. Bolla, E. Budelli, and G. C. Gandini. 2004. Genetic structure of milk protein polymorphisms effects on milk production traits in a local dairy cattle. J. Anim. Breed. Genet. 121: 119–127.         [ Links ]

Cattaneo, T. M. P., F. Nigro, P.M.Toppino, and V. Denti. 1996. Characterization ewe's milk by capillary zone electrophoreis. J. Chromatography A 721: 345–349.         [ Links ]

Cerbulis, J., and H. M. Farell. 1975. Composition of milk of dairy cattle. I. Protein, lactose and fat contents and distribution of protein fraction. J. Dairy Sci. 58: 817–827.         [ Links ]

Creamer, L. K., K. Alastair, and H. McGibbon. 1996. Some recent advances in the basic chemistry of milk proteins and lipids. Int. Dairy J. 6: 539–549.         [ Links ]

De Alba, J., and B. W. Kennedy. 1994. Genetic parameters of purebred and crossbred Milking Criollos in tropical Mexico. Anim. Prod. 58: 159–165.         [ Links ]

de Jong, N., S. Visser, and C. Olieman. 1993. Determination of milk proteins by capillary electrophoresis. J. Chromatography A. 652: 207–213.         [ Links ]

Feagan, J. T. 1979. Factors affecting protein composition of milk and their significance to dairy proccesing. Aust. J. Dairy Technol. 34: 77–87.         [ Links ]

González–Cerón, F., C. M. Becerril–Pérez., G. Torres–Hernández and P. Díaz–Rivera. 2009. Ticks infesting body regions of tropical milking criollo cattle in Veracruz, Mexico. Agrociencia. 43: 11–19.         [ Links ]

Hill, J. P. 1993. The relationship between β–lactoglobulin phenotypes and milk composition in New Zealand dairy cattle. J. Dairy Sci. 76: 281–286.         [ Links ]

Kroeker, E. M., K. F. Ng–Kwai–Hang, J. F. Hayes, and J. E. Moxley. 1985. Effect of B–Lactoglobulin variant and environmental factors on variation in the detailed composition of bovine milk serum proteins. J. Dairy Sci. 68: 1637–1641.         [ Links ]

McLean, D. M., E. R. B. Graham, R. W. Ponzoni, and H. A. McKenzie. 1984. Effects of milk protein genetic variants on milk production and composition. J. Dairy Res. 51: 531546.         [ Links ]

Ng–Kwai–Hang, K. F., J. F. Hayes, J. E. Moxles, and H. G. Monardes. 1987. Variation in milk protein concentration association with genetic polymorphism and environmental factors. J. Dairy Sci. 70: 563–570.         [ Links ]

Ng–Kwai–Hang, K. F., H. G. Monardes, and J. F. Hayes. 1990. Association between genetic polymorphism of milk proteins and production traits during three lactations. J. Dairy Sci. 73: 3414–3420.         [ Links ]

Ng–Kwai–Hang, K. F., and S. Kim. 1996. Different amounts of b–lactoglobulin A and B in milk from heterozygous AB cows. Int. Dairy J. 6: 689–695.         [ Links ]

Ng–Kwai–Hang, K. F. 1998. Genetic polymorphism of milk proteins: Relationships with production traits, milk composition and thechnological properties. Can. J. Anim. Sci. 78 (Suppl): 131–147.         [ Links ]

Olguin–Arredondo, H. A., and B. Vallejo–Cordoba. 1999. Separation and determination of B–lactoglobulin variants A and B in cow's milk by capillary free zone electrophoresis. J. Capillary Electrophoresis and Microchip Technol. 5/6: 145–149.         [ Links ]

Paterson, G. R., J. P. Hill, and D. E. Otter. 1995a. Separation of B–lactoglobulin A, B and C variants bovine whey using capillary zone electrophoresis. J. Chromatography A 700:105–115.         [ Links ]

Paterson, G. R., D. E. Otter, and J. P. Hill. 1995b. Application of capillary electrophoresis in the identification of phenotypes containing the β–lactoglobulin C variant. J. Dairy Sci. 78:2637–2644.         [ Links ]

Rosendo–Ponce, A., and C. M. Becerril–Pérez. 2002. Productive performance and genetic parameters in the tropical milking criollo cattle in Mexico. Proc. 7^th. World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. Montpellier, France. Communication 25–25.         [ Links ]

Strzalkowska, N., J. Krzyzewski, L. Zwierzchowski, and Z. Ryniewicz. 2002. Effects ok k–casein and B–Lactoglobulin loci polymorphism, cow's age, stage of lactation and somatic cell count on daily milk yield and milk composition in Polish Black and White cattle. Anim. Sci. Papers and Reports 20:21–35.         [ Links ]

Tienstra, P., J. A. M. Van Riel, and C. Olieran. 1992. Determination of gost milk in cow milk with P/ACE TM capillary electrophoresis. Capillary Electrophoresis. Beckman. Netherlands Institute for Dairy Research (NIZO) pp: 832–833.         [ Links ]

Van Eenennaam, A. L., and Medrano, J. F. 1991. Differences in allelic protein expresión in the milk of heterozygous kappa casein cows. J. Dairy Sci. 74: 1491–1496.         [ Links ]

Zikakis, J. P., G. F. W. Haenlin, H. C. Hines, R. E. Mather, and S. Tung. 1974. Gene frecuencies of electrophoretically determined polyphormisms in Guersney blood and milk. J. Dairy Sci. 57: 405–410.         [ Links ]