Identificación de un aislamiento del grupo 16SrIII, Candidatus Phytoplasma pruni en plantas y semillas de amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.) en México
Identification of an isolate from group 16SrIII, Candidatus Phytoplasma pruni in plants and seeds of amaranth (Amaranthus hypochondriacus L.) in México
Reyna I. Rojas–Martínez1*, Emma Zavaleta–Mejía1, Ing–Ming Lee2, Agustín Aragón–García3
1 Fitopatología, Campus Montecillo, Colegio de Postgraduados. 56230. Km 36.5. Carretera México–Texcoco. Montecillo, Estado de México, México. *Autor responsable: (rojas@colpos.mx).
2 Molecular Plant Pathology, USDA–ARS, Belstville, Maryland 20705, USA.
]]> 3 Departamento de Agroecología y Ambiente, Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. 72570. 14 Sur 6301. Colonia San Manuel, Puebla, Puebla.
Recibido: Mayo, 2008.
Aprobado: Abril, 2009.
RESUMEN
Recientemente en el estado de Tlaxcala, México el "síntoma de escoba de bruja" (proliferación de brotes y reducción de entrenudos) fue observado en amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.). Esta sintomatología en campo se distribuye uniformemente en la plantación y no en forma azarosa y de manchones; además, el mayor daño es en la panícula que aloja a las semillas lo cual genera considerables perdidas en la cosecha. Por tanto, el objetivo del presente trabajo fue determinar la presencia de fitoplasmas en plantas con síntomas de escoba de bruja y en semillas provenientes de plantas enfermas. En todas las muestras procesadas se encontró asociado un fitoplasma perteneciente al grupo 16Sr III, según los resultados de la comparación de los patrones generados con enzimas de restricción de los productos amplificados por PCR. Las secuencias de los productos obtenidos presentaron similitud de 98 % con el grupo filogenético 16Sr III Candidatus Phytoplasma pruni.
Palabras clave: Amaranthus, Candidatus Phytoplasma pruni, reacción en cadena de la polimerasa, RFLP.
ABSTRACT
]]> Recently in the state of Tlaxcala, México, the "witches' broom syndrome" (proliferation of shoots and reduction of internodes) was observed in amaranth (Amaranthus hypochondriacus L.). This symptomatology in the field is uniformly distributed in the plantation rather than randomly or in patches, and the most severe damage is in the panicle which contains the seeds, generating considerable losses in the harvest. Therefore, the objective of the present study was to determine the presence of phytoplasmas in plants with symptoms of witches' broom syndrome and in seeds from diseased plants. In all of the samples that were processed an associated phytoplasma was found pertaining to the group 16Sr III, according to the results of the comparison of the patterns generated with enzymes of restriction of the products amplified by PCR. The sequences of the products obtained presented similarity of 98 % with the phylogenic group 16Sr III Candidatus Phytoplasma pruni.Key words: Amaranthus, Candidatus Phytoplasma pruni, chain reaction of the polymerase, RFLP.
INTRODUCCIÓN
El cultivo del amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.) ha tenido gran relevancia en México desde tiempos prehispánicos para rituales religiosos y como parte de la dieta. Las especies de Amaranthus son cultivadas en varias partes del mundo: A. cruentus L. en el este de Norteamérica, México, Centro y Sudamérica; A. hypochondriacus L. en Tlaxcala, Puebla y Morelos; A. caudatus L. en Ecuador, Perú, Bolivia, Argentina, Asia y Oceania (Mosyakin y Robertson, 2003).
Algunas especies de Amaranthus son cultivadas tanto con fines alimenticios para obtener grano y hojas y tallos usados en la preparación de ensaladas, como ornamentales (Brenner et al, 2000; Williams y Brenner 1995; Bianco et al, 1998). Las especies comúnmente cultivadas son A. caudatus L., A. hypochondriacus y A. cruentus L. originarias de América, y A. tricolor L. del sur de Asia. La importancia en México ha aumentado por el elevado contenido proteico y de aminoácidos esenciales para el ser humano (Rodríguez, 2000), por el rápido crecimiento, la capacidad de crecer en condiciones de baja humedad y estrés hídrico, y por producir rendimientos aceptables de grano con pocas labores de cultivo (Blodgett et al., 2000). En 2005 el estado de Puebla fue el mayor productor de amaranto (51 %) en México, seguida por los estados de Morelos (22 %), Tlaxcala (18 %), Distrito Federal (19 %), Estado de México (6 %) y Guanajuato (2 %). De acuerdo con el Servicio de Información Estadística Agroalimentaria y Pesquera (SIAP), en 2005 la cosecha de amaranto fue 2917 t; en 2006, Puebla aportó 2219 t, Morelos 214 t, Tlaxcala 190 t, Estado de México 153 t, y el Distrito Federal 136 t (SAGARPA, 2006).
Existe relativamente poca información acerca de las plagas y enfermedades que afectan a las distintas especies de Amaranthus. Sólo hay reconocidas enfermedades de naturaleza fungosa, bacteriana, viral y las causadas por nematodos. En México, los patógenos que afectan a este cultivo son Choanephora cucurbitarum Thakter que induce la pudrición húmeda del tallo; la secadera inducida por Pythium aphanidermatun (Ed.) Fitzp; la roya blanca por Albugo bliti (Biv) Kuntze (Grubben, 1975, citado por Espitia, 1986); la mancha negra del tallo por Macrophoma sp.; y el carbón del amaranto por Thecaphora amaranthi (Hirschh.) Vànky (Hirschhorn, 1986; Vànky, 1994; Moreno–Velázquez, 2005). De las enfermedades bacterianas A. hybridus se reporta como hospedante de Xanthomonas campestris pv. phaseoli (E.F.Sm.) (Huerta y Rodríguez, 1994), y de las de naturaleza viral el virus Amaranthus Mottle Virus (AMoV) afecta a A. blitum L., A. caudatus L., A. cruentus L., A. gracilis L., A. hypochondriacus L., A. leucocarpus L., A. spinosus L., A. tricolor L., y A. viridis L., reduciendo el crecimiento de la planta y la producción de grano además de retrasar la floración (Sánchez et al., 1990).
En relación con las enfermedades causadas por fitoplasmas, riketsias y bacterias fastidiosas hay una enfermedad causada por un fitoplasma que reduce el crecimiento del tallo y el área foliar (Ruskin, 1984); sin embargo, no se aclara si dicho diagnóstico fue realizado considerando sólo la sintomatología o mediante microscopía electrónica y pruebas con antibióticos para inducir la remisión de síntomas. Borth et al. (2006) reportaron también la presencia del fitoplasma del grupo 16SrI en amaranto, sin describir la sintomatología inducida. En México se ha presentado una enfermedad de etiología desconocida en el estado de Tlaxcala; las plantas enfermas presentan proliferación de la panícula, amarillamiento foliar, acortamiento de entrenudos, y en algunas los brotes nuevos son raquíticos y amarillentos (observación personal de Reyna I. Rojas–Martínez). Esta sintomatología corresponde a lo comúnmente conocido como escoba de bruja y que frecuentemente se asocia con infecciones por fitoplasmas (Rojas–Martínez et ai, 2003; Luna–Esquivel et al, 2004).
El fitoplasma del amarillamiento letal del cocotero es transmitido vía el embrión de coco (Cordova et al., 2003) pero no se ha demostrado la presencia de fitoplasmas en esta estructura. La escoba de bruja del amaranto en el campo se distribuye uniformemente en la plantación y no en forma azarosa y de manchones. Además el mayor daño se aprecia en la panícula que aloja a las semillas, lo cual sugiere que el patógeno involucrado pudiera ser diseminado a través de la semilla. Por tanto, el objetivo del presente trabajo fue determinar la presencia de fitoplasmas en plantas con síntomas de escoba de bruja y evaluar la posible transmisión por semilla.
]]> MATERIALES Y MÉTODOS
Detección de fitoplasmas asociados con la escoba de bruja
Cincuenta plantas de amaranto en estado de floración con síntomas de escoba de bruja y 50 plantas sin síntomas se recolectaron en un lote comercial de San Miguel del Milagro, Tlaxcala. Con las 50 plantas se hicieron cinco grupos de 10; los tallos, hojas e inflorescencia de cada grupo de plantas se mezclaron para formar una muestra compuesta de cada órgano. Se prepararon dos grupos de 50 semillas; uno de panículas con síntomas y otro de las asintomáticas. Las semillas se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1.0 %, se secaron con toallas sanitarias, se colocaron en charolas germinadoras con papel absorbente humedecido con agua destilada estéril, y se incubaron 7 d a 27 °C. Las semillas germinadas se separaron en dos grupos de 25. De esta manera se obtuvieron dos repeticiones de semillas de panículas sintomáticas y dos de las asintomáticas, haciendo la extracción de ADN para cada repetición.
La extracción de ADN de tejido de cada muestra compuesta de plantas con síntomas, de las asintomáticas y de las semillas germinadas se hizo de acuerdo con el protocolo descrito por Ahrens y Seemüller (1992). El ADN de referencia se extrajo de plantas de Catharanthus roseus L. G. Don, infectadas con el fitoplasma del amarillamiento del áster, subgrupo B (16SrI–B), mantenidas en nuestro laboratorio. La cantidad y calidad del ADN extraído se determinó mediante espectrofotometría (Lambda Bio mod. 10, PERKIN ELMER®) a una absorbancia de 260 nm y por electroforesis en gel de poliacrilamida. La detección de fitoplasmas mediante PCR directa se realizó con los iniciadores universales para fitoplasmas P1/P7 (Deng y Hiruki, 1991), que flanquean las regiones génicas del ADNr 16S y el espaciador intergénico 16/23S y que generan un fragmento de aproximadamente 1800 pb. Con los productos de PCR directa se realizó una PCR anidada con los iniciadores R16F2n/R16R2 que amplifican un fragmento de aproximadamente 1200 pb, correspondiente a la región parcial del ADNr 16S (Lee et al., 1993).
La primera amplificación (PCR–directa) se realizó con la siguiente mezcla de reacción: amortiguador de ADN polimerasa amplificasa BIOGENICA® IX, 2.5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTP (deoxinucleótidos trifosfatados), iniciadores (20 pmol) P1/P7; 1 U μL–1 de ADN polimerasa (amplificasa de BIOGENICA®); 80 ng de ADN total para cada mezcla de reacción en un volumen final de 25 μL. Las muestras se amplificaron en un termociclador automático (GeneAmp PCR System mod. 2400, PERKIN–ELMER®) con el siguiente ciclaje: un ciclo de desnaturalización inicial a 94 °C por 1 min; 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 1 min, alineamiento a 55 °C por 2 min y una extensión a 72 °C por 3 min y un ciclo de extensión final a 72 °C por 7 min. Cinco μL del producto de PCR se cargaron en un gel de agarosa al 1 % y se corrieron en electroforesis a 90 V. Al finalizar la corrida, el gel se tifió con bromuro de etidio (0.5 μg m L–1) durante 10 min, para analizarlo con el fotodocumentador Gel–Doc mod. 2000 (BIO–RAD®). Como referencia del peso molecular se utilizó el marcador 1Kb (Fermentas®).
Para realizar la PCR–anidada se diluyó 1 μL del producto de PCR–directa en 30 μL de agua deionizada estéril para utilizar 1 μL de la dilución como molde para la PCR–anidada, en las condiciones descritas, con la diferencia del par de iniciadores R16F2n/R16R2 (Gundersen y Lee, 1996).
Para determinar el grupo al cual pertenece el fitoplasma detectado, el fragmento amplificado se sometió a un análisis de RFLP, para lo cual, los productos de PCR anidada (iniciadores R16F2n/R16R2) fueron digeridos con endonucleasas de restricción (AluI, KpnI, HhaI, MseI, HpaII y Tsp 5091). Los productos de restricción fueron separados en geles de acrilamida 8 % y teñidos con bromuro de etidio. Los patrones de RFLP obtenidos se compararon con los reportados en la literatura (Lee et al., 1998).
Secuenciación y análisis del 16S rDNA
El producto de PCR anidada fue purificado (Wizard (PROMEGA®), clonado (TOPO–TA (INVITROGEN®) y secuenciado (Automatic Sequencer 3700x1 DNA Analyzer, APPLIED BIOSYSTEM®). Las secuencias del ADNr 16S obtenidas fueron comparadas con las de referencia en el GenBank, usando la herramienta BLAST del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
Análisis filogenético
]]> Las relaciones filogenéticas entre el fitoplasma detectado en plantas de amaranto con síntoma de escoba de bruja con aislamientos de otros grupos de fitoplasmas fueron determinadas con base en la secuencia del gen que codifica para el ADNr 16S. El árbol filogenético fue construido de acuerdo con los resultados del análisis de Parsimonia (PAUP versión 4.0b, D. Swofford). La secuencia parcial del fitoplasma Ph Amaranto y las de los aislamientos Ca. Phytoplasma pruni–16SrIII–B (DI2580), Ca. Phytoplasma pruni–16SrIII–F (AF510724), Ca. Phytoplasma pruni–16SrIII–H (EU165359), Ca. Phytoplasma pruni–16SrIII–G (AF190227), Ca. Phytoplasma pruni–16SrIII–J (AF147706), Ca. Phytoplasma pruni–16SrIII–I (AF060875), Ca. Phytoplasma pruni–16SrIII–E (AF190228), Ca. Phytoplasma fraxini–16SrVII (AF092209), Ca. Phytoplasma luffae–16SrVIII (AF086621), Ca. Phytoplasma cynodontis–16SrXIV (AJ550984), Ca. Phytoplasma oryzae–16SrXI (AB052873), Ca. Phytoplasma pal–mae–16SrIV (U18747), Ca. Phytoplasma phoenicium–16SrIX (AF515636), Ca. Phytoplasma aurantifolia–16SrII (U15442), Ca. Phytoplasma mali–16SrX (AJ542541), Ca. Phytoplasma ulmi–16SrV (AY197655), Ca. Phytoplasma brasiliense–16SrXV (AF147708), Ca. Phytoplasma asteris–16SrI (M30790), fitoplasmas que inducen la filodia del cempazuchil (AY249248), JazN, Virescencia del jazmín (EU252563); PaWB, escoba de bruja de la paulonia (AY265206), OAY, virescencia de la oenothera (M30790), A. laidlawii (M23932) de referencia del GenBank, fueron alineadas usando el Clustal 5 del Software Laser Gene del programa DNASTAR, Madison, WI, EE.UU.
RESULTADOS
Mediante la PCR directa realizada con los iniciadores P1/P/7 no fue posible detectar la presencia de fitoplasmas en el ADN de semillas germinadas de plantas enfermas, ni de ninguna muestra de tejido de plantas con escoba de bruja. Sin embargo, la PCR anidada evidenció la presencia de ADN fitoplásmico de peso molecular esperado de 1.2 kb cuyo tamaño coincide con el reportado por Lee et al. (1993) (Figura 1). El fragmento sólo fue detectado en tallo, hoja e inflorescencia y semillas germinadas provenientes de plantas con síntomas. La secuencia del amplicón clonado se depositó en el GenBank (Núm. de Acceso EU310514). El fragmento obtenido mostró una identidad de 99 % con el grupo 16Sr III Candidatus Phytoplasma pruni (IRPCM, 2004), la cual fue confirmada a través del análisis de RFLP del producto de PCR anidada con las endonucleasas de restricción AluI, KpnI, HhaI, MseI, HpaII y Tsp 5091. El patrón obtenido indicó que el fitoplasma detectado en plantas de amaranto con síntoma de escoba de bruja pertenece al grupo 16S rDNA III (Figura 2).
La posición taxonómica se confirmó comparando las secuencias del fragmento de 1.2 kb 16SrDNA amplificado (Núm. de acceso EU310514) con las secuencias de aislamientos depositadas en el GenBank. El análisis del árbol filogenético mostró una estrecha relación con el fitoplasma del grupo 16Sr III Candidatus Phytoplasma pruni (Figura 3).
]]> DISCUSIÓN
La presencia de fitoplasmas perteneciente al grupo 16Sr III fue detectada en tejido de plantas de amaranto con el síntoma de escoba de bruja provenientes del estado de Tlaxcala. El haber amplificado el fragmento correspondiente a este fitopatógeno en las semillas germinadas de plantas enfermas, mantenidas aisladas para evitar el contacto con insectos vectores, sugiere que el fitoplasma estaba presente en la semilla. Sin embargo, para confirmar que ocurre la transmisión por semilla habrá que demostrar la consistencia de los resultados aquí reportados. Hasta ahora, sólo se ha consignado la transmisión de fitoplasmas a través de insectos vectores y mediante material vegetativo como varetas, bulbos, rizomas y tubérculos (Rojas–Martínez et al., 2002; Cervantes–Díaz et al., 2004). Estos patógenos pueden colonizar el floema de plantas vasculares y el intestino medio, la hemolinfa y las glándulas salivales de sus insectos vectores (Kirkpatrick, 1992; Lee et al, 2000). En la planta hospedante los fitoplasmas se distribuyen sistémicamente y pueden multiplicarse en células del parénquima del floema, células parenquimatosas que separan los fascículos vasculares y en células de la zona más externa del sistema vascular (Siller et al., 1987). Lo anterior indica que la translocación sistémica del patógeno podría ocurrir a través del sistema conductor, o mediante conexiones plasmodésmicas (Esau et al., 1976). Así, la llegada del fitoplasma a la semilla podría darse a través de este tipo de conexiones en las células de la misma; no obstante, esto implicaría que el fitoplasma puede entrar en estados de reposo que le permitieran sobrevivir en el interior de las células inactivas de las semillas maduras. Tal capacidad no sería necesaria en el caso de semillas de algunas gramíneas (trigo, maíz y cebada) y dicotiledóneas como Ricinus communis L. que tienen una capa formada por células vivas que contienen granos de aleurona (proteína de reserva); sin embargo, las semillas de amaranto están desprovistas de aleurona (Casasola, 1996).
Dado que los fitoplasmas pueden alcanzar niveles epidémicos causando daños económicos significativos, y que en México la semilla usada para nuevas siembras proviene de cosechas anteriores, es de particular relevancia el hecho de que en las semillas germinadas provenientes de plantas enfermas se haya detectado a un fitoplasma.
CONCLUSIONES
En plantas de amaranto con el síntoma de escoba de bruja y en semillas germinadas provenientes de plantas enfermas se encontró asociado un fitoplasma perteneciente al grupo 16Sr ADN III.
LITERATURA CITADA
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