La citocinina BAP promueve la acumulación de hexosas e incrementa la actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa y fosfoenlopiruvato carboxicinasa durante el retraso de la senescencia foliar de trigo

Cytokinin BAP promotes the accumulation of hexoses and increases the activity of phosphoenolpyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase during the delay of leaf senescence in wheat

Rosalinda González–Santos¹, Adriana Delgado–Alvarado²*, H. Araceli Zavaleta–Mancera¹, B. Edgar Herrera–Cabrera²

¹ Botánica. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México.

² Campus Puebla. Colegio de Postgraduados.72760. Carretera Federal México–Puebla, Santiago Momoxpan, Km 125.5. San Pedro Cholula, Puebla, México *Autor responsable: (adah@colpos.mx)

Recibido: Abril, 2008.
Aprobado: Febrero, 2009.

Resumen

Las citocininas disminuyen su concentración durante la senescencia foliar pero la aspersión de la citocinina bencilaminopurina (BAP) retrasa este proceso, lo cual puede tener aplicaciones en el control de la senescencia de pastos forrajeros, ornamentales de follaje y hortalizas verdes. El objetivo del presente trabajo fue investigar el efecto de la aplicación de BAP en el metabolismo primario durante la senescencia foliar de Triticum aestivum L. cv. Temporalera mediante el estudio del contenido de pigmentos fotosintéticos, proteínas solubles, Rubisco, carbohidratos, actividad enzimática de fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) y fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK), componentes importantes del metabolismo primario vegetal. Plántulas de 21 d después de la siembra (DDS) fueron asperjadas con BAP 0.1 mM o agua (testigo). A los 41 DDS las hojas tratadas con BAP retrasaron su senescencia, conservaron 60 % de su clorofila y 44 % de sus proteínas solubles totales en particular de la Rubisco. En contraste las hojas testigo perdieron 92 % de su clorofila y más del 90 % de proteínas, en el mismo periodo. La BAP promovió la acumulación de hexosas. El análisis de los resultados indica que la BAP puede aumentar la actividad de las enzimas PEPC y PEPCK durante la senescencia y se discute la función de estas enzimas para regular el pH y la translocación de compuestos nitrogenados durante el retraso de la senescencia foliar.

Palabras clave: Triticum aestivum L., Citocininas, hexosas, fosfoenolpiruvato carboxicinasa PEPCK, fosfoenolpiruvato carboxilasa PEPC.

Abstract

Cytokinins reduce their concentration during leaf senescence; but spraying of the cytokinin bencylaminopurine (BAP) delays this process; this may have applications in the control of the senescence pasture, ornamental foliage and green vegetables. The objective of the present study was to investigate the effect of BAP application on primary metabolism during the leaf senescence of Triticum aestivum L. cv. Temporalera studying the photosynthetic pigments content, soluble proteins, Rubisco, carbohydrates, enzyme activity of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) and phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK), major components of plant primary metabolism. Seedlings 21 d after sowing (DAS) were sprayed with 0.1 mM BAP or water (control). After 41 DAS the leaves treated with BAP delayed their senescence; they retained 60 % of chlorophyll and 44 % of their initial total soluble proteins, especially Rubisco. In contrast, control leaves, senesced, loosing 92 % of chlorophyll and more than 90% of proteins in the same period. The BAP promoted the accumulation of hexoses. Results indicated that BAP can increase the activity of PEPC and PEPCK enzymes during senescence. It is discussed the function of these enzymes in the regulation of pH and the translocation of nitrogen compounds during the delay of leaf senescence.

INTRODUCCIÓN

Durante la senescencia foliar, la asimilación de carbono se reemplaza por el catabolismo de clorofila y macromoléculas como proteínas, lípidos de membranas y ARN; el material acumulado se trasforma en nutrientes exportables para los órganos en desarrollo (Lim et al., 2007). Parte de la energía requerida para la removilización de los asimilados, se obtiene por el aumento de la respiración (Hopkins et al., 2007). Se propone que los azúcares y algunos reguladores de crecimiento inducen la senescencia (Jordi et al., 2000; Pourtau et al., 2006). Durante la senescencia los azúcares tienen las siguientes funciones: intervienen en el control de la fotosíntesis (Wingler et al., 1998), son elementos importantes en las relaciones fuente–demanda (Roitsch y Ehneâ, 2000) e inducen y regulan enzimas involucradas en la movilización de nitrógeno (Masclaux et al., 2000). Algunas de las enzimas del metabolismo de aminoácidos como la glutamina sintetasa citosólica y el glutamato deshidrogenasa, intervienen en la senescencia (Buchanan–Wollaston et al., 2005). Esas dos enzimas participan en la conversión de aminoácidos en compuestos que puedan ser exportados de la hoja, como la glutamina, principal aminoácido transportable durante la senescencia natural (Feller y Fischer 1994). Otras enzimas como la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) y la fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK) se han estudiado poco durante la senescencia y mucho menos en plantas C3. La importancia de estas enzimas durante la senescencia es su intervención en el metabolismo de lípidos, de nitrógeno y en la regulación del pH (Buchanan–Wollaston et al., 2005; Chen et al., 2000; Gregersen y Holm, 2007). Se menciona que las enzimas PEPC y PEPCK mantienen el floema activo para facilitar la exportación de los compuestos nitrogenados generados durante la senescencia (Chen et al., 2000). Además estas enzimas se encuentran en diferentes tejidos vegetales, especialmente en aquellos con un activo metabolismo de nitrógeno (Walker et al., 2001; Delgado–Alvarado et al., 2007).

Durante la senescencia disminuye la concentración de las citocininas, pero su aspersión o la sobre–expresión del gen ipt, que codifica la enzima isopenteniltransferasa (IPT) de Agrobacterium tumefaciens, bajo control del promotor específico de la senescencia SAG 12 (P_SAG12–IPT), retrasan los cambios catabólicos de la senescencia foliar (McCabe et al., 2001; Lim et al., 2007). A pesar del notable efecto que tienen las citocininas para retardar la senescencia en plantas, el mecanismo de acción aun no es bien entendido. Se propone que durante la senescencia, las citocininas son percibidas por receptores asociados a histidinas cinasas y que la señal generada se traduce por medio de una cascada de fosforilaciones que finalmente estimulan genes blanco responsables del programa del retardo de la senescencia foliar, donde intervienen principalmente tres módulos: los receptores histidinacinasas (HK), las proteínas fosfotransferasas (HP) y los reguladores de respuesta (RR) (Lim et al., 2007). Al respecto, en Arabidopsis spp. uno de los tres receptores de las citocininas, la histidina cinasa 3 (AHK3), tiene una función primordial al controlar la longevidad de la hoja mediada por la fosforilación específica del regulador de respuesta ARR2 (Kim et al., 2006).

El uso de las citocininas para retrasar la senescencia foliar tiene uso potencial para aumentar la productividad de cultivos, para prolongar el almacenamiento postcosecha y aumentar la tolerancia al estrés (Lim et al., 2007). En cereales puede ser usado en la manipulación de la movilización de nutrientes para mejorar el rendimiento (Gregersen y Holm, 2007). Por tanto en el presente trabajo se estudia el efecto de la aplicación de la citocinina BAP en el metabolismo primario de trigo, durante el retraso de la senescencia foliar, con énfasis en la acumulación de azucares y la actividad de PEPC y de PEPCK.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material biológico

Un promedio de 50 semillas de trigo (Triticum aestivum L. cv. Temporalera) se sembraron en charolas de plástico (33X28X 13cm), con una mezcla de peat–moss y agrolita estéril (3/1; v/v). Las charolas se distribuyeron en un diseño completamente aleatorio, con cuatro repeticiones para cada experimento. Los experimentos se realizaron en cámaras de crecimiento de ambiente controlado del Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, con las siguientes condiciones: temperatura 23/19 °C (día/noche), fotoperíodo de 13.5 h e intensidad luminosa de 210 µmol nTm^–2 s^–1. La fertilización fue con una solución completa de Steiner (1984) con KNO₃ como fuente de nitrógeno.

Plántulas de 20–21 d después de la siembra (DDS) que mostraron la segunda hoja madura (lámina completamente expandida y con lígula expuesta), se asperjaron (350 mL) con una solución de 0.1 mM de 6–bencilaminopurina (BAP; Sigma) con 0.02 % de dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma) y 0.02 % de Tween 20 (Boehringer Mannheim GmbH) (Martínez–Gutiérrez et al., 2008). Las plántulas testigo se asperjaron con una solución preparada como la solución de BAP, pero sin el regulador de crecimiento. Las aspersiones se realizaron a las 11:00 h cada tercer día por 21 d. Se tomaron 3 cm de la parte media de la segunda hoja foliar, entre las 11:00 y 12:00 am. a los 21, 26, 31, 36 y 46 DDS y se determinaron las variables descritas a continuación.

Cuantificación de pigmentos fotosintéticos

Para determinar clorofila a (Chl a), clorofila b (Chl b), carotenoides y xantofilas (c+x), muestras de 150 mg de la parte media de la hoja se maceraron en 3 mL de acetona 80 % a 4 °C; el extracto se centrifugó 10 min a 840 g. El sobrenadante fue recuperado y ajustado a 4 mL con acetona 80 %. La concentración de cada pigmento se cuantificó con la fórmula de Lichtenthaler y Wellburn (1983) y se expresó en mg g^–1 peso fresco (PF).

Proteínas solubles y contenido de la subunidad grande de Rubisco (EC 4. 1. 1. 39)

Muestras de 250 mg de la parte media de la hoja se maceraron con 1 mL de amortiguador de fosfato de sodio 50 mM pH 7.5 que incluyó 1 mM de DTT, 0.1 mM de EDTA y 12.5 % de glicerol. El extracto se centrifugó 10 min a 15000 g a 4 °C y el sobrenadante se usó para determinar proteínas solubles totales y para medir el contenido de la subunidad grande de Rubisco (LSU). El contenido de proteína total se determinó en 5 mL de los extractos por el método de Bradford (1976), usando albúmina de suero bovino como estándar. El extracto de proteína se separó mediante un gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS–PAGE), de acuerdo con Makino et al. (1986). También se corrió un extracto puro de Rubisco de espinaca (R8000, Sigma) y un marcador de peso molecular conocido de rango bajo (Bio–Rad). Las bandas de proteína de 55 kDa identificadas como LSU se evaluaron en unidades de densidad óptica (ODU mm^–2), con el programa de análisis Quantity One 42 (Bio Rad), para comparar las intensidades relativas de las bandas entre tratamientos.

Cuantificación de azúcares solubles y almidón

Los azúcares se extrajeron con 4–6 incubaciones sucesivas de 10–min en etanol (80%, v/v, 70 °C) y se determinaron enzimáticamente como describe Scholes et al. (1994). Los extractos se evaporaron a 50 °C y se disolvieron en agua destilada. Glucosa, fructosa y sacarosa se evaluaron después de la adición secuencial de hexocinasa, fosfoglucosa–isomerasa e invertasa. El tejido remanente se homogenizó en 1mL de agua destilada, permaneció 30 min en autoclave y el contenido de almidón se determinó en esta mezcla incubando una alícuota de 100 µL con una solución de enzimas hidrolíticas (100 µL de MES–KOH 500 mM, pH 4.5, 50 µL de amiloglucosidasa 4 mg mL^–1, y 50 µL de α–amilasa 90 mg mL^–1) por 4.5 h a 37 °C y finalmente se determinó como glucosa (Scholes et al., 1994).

Actividad de fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK–ATP: EC 4. 1. 1. 49)

Muestras de 200 mg de hojas frescas se homogeneizaron en 0.5 mL de bicina–KOH 200 mM (pH 9.0) que contenía 50 mM de DTT a 4 °C. La actividad se midió de acuerdo a Delgado–Alvarado et al. (2007). La mezcla de reacción incluyó: 100 mM de Hepes–KOH (pH 6.8), 100 mM de KCl (Merck), 0.1 mM de NADH (Sigma), 6 mM de MnCl₂ (Merck), 6 mM de PEP (Sigma), 1 mM de ADP (Sigma), 90 mM de KHCO₃ (Sigma), 6 U mL^–1 de MDH (Sigma) y 30 µL de extracto enzimático. Una unidad de actividad de PEPCK corresponde a la producción de 1 µmol min^–1 de oxalacetato a 25 °C.

El análisis de la actividad de PEPC se realizó con el método propuesto por Aguilar–Becerril y Peña–Valdivia (2006). La composición del medio de reacción y el orden en que se agregaron fue: 975 µL de la solución amortiguadora (Tris–HCl 100 mM, pH 8.0), 20 mM de MgCl₂ (Merck), 5 mM de NaHCO₃ (Baker), 5 U mL¹ de MDH (Sigma), 0.5 mM de NADH (Sigma), 3 mM de PEP (Sigma) y 30 µL de extracto crudo. Una unidad de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima capaz de transformar 1 µmol min^–1 de fosfoenolpiruvato.

Liberación de electrolitos

La integridad relativa de la membrana plasmática se determinó indirectamente mediante la liberación de electrolitos con una adaptación de los métodos descritos por Prášil y Zámeènyìk (1998) y Sánchez–Urdaneta et al. (2004). Se midió la conductividad eléctrica (µS cm^–1) con un conductímetro (Horiba b–173, Kyoto, Japón). Los resultados se expresaron en valores relativos (%).

Análisis estadístico

Se realizó un análisis de varianza con los datos y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p<0.05) usando el paquete estadístico STATGRAPHICS Plus 4.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La degradación de proteínas fue significativa a los 26 DDS, por el contrario, el tratamiento con BAP retrasó la degradación de proteínas solubles (Figura 1 A y B). Resultados similares fueron obtenidos con plantas de tabaco (Nicotiana tabacum L.) transformadas con el gen ipt que codifica la enzima isopenteniltransferasa (IPT), bajo control del promotor de un gen específico de la senescencia, SAG 12 (Jordi et al., 2000). Además, BAP indujo la acumulación de glucosa y fructosa a los 31 y 36 DDS (Figura 3 A y B). La acumulación de estos carbohidratos podría explicarse por la influencia de citocininas en el mantenimiento de la fijación de CO₂ durante la senescencia de hojas de trigo (Wingler et al., 1998; Martínez– Gutiérrez et al., 2008).

Pigmentos fotosintéticos

Una de las evidencias más notables del efecto benéfico de la aspersión de citocininas es el retraso del amarillamiento de la lámina en trigo. El tratamiento con BAP permitió conservar del 60 % de la clorofila total respecto al valor en las hojas presenescentes (21 DDS), mientras que el testigo conservó sólo 8 % (Figura 1A). Particularmente, en el testigo la cantidad de Chl a fue más afectada que la de Chl b, debido a que la razón Chl a: Chl b disminuyó de 3.7 a 1.3, en contraste, las hojas tratadas con BAP mantuvieron valores entre 3.0 y 3.7, es decir durante el retraso de la degradación de pigmentos, BAP mantuvo la proporción de chl a y chl b en forma similar que la hoja verde (Cuadro 1).

En el presente estudio se encontró que BAP indujo la síntesis de carotenoides+xantofilas (c+x) hasta los 26 DDS; luego los valores fueron constantes, pero significativamente más altos que en el testigo (Cuadro 1). Una tendencia similar fue reportada por Zavaleta–Mancera et al. (2007) en fragmentos de hojas de trigo incubados 6 d en BAP en oscuridad. Por el contrario, en invernadero con iluminación natural, los pigmentos accesorios (x+c) aumentaron durante la senescencia natural de trigo Martínez–Gutiérrez et al. (2008). En esta misma especie, con altas intensidades de luz los pigmentos accesorios aumentan su contenido Lu et al. (2001). Es probable que las citocininas incrementen la síntesis de pigmentos accesorios para proteger a los centros de reacción de la luz y el oxígeno (Wingler et al., 2004; Vlèková et al., 2006).

Contenido de niveles de la subunidad grande de Rubisco (LSU)

Las citocininas inducen la expresión de genes fotosintéticos, promueven la síntesis de proteínas y mantienen altos niveles de Rubisco durante la senescencia foliar (Ookawa et al., 2004). En plantas transgénicas P_SAG12–IPT de tabaco (Nicotiana tabacum L.), se demostró que los niveles de proteínas solubles (30 %) se conservan mejor que los de Rubisco (15 %) en las hojas senescentes (Jordi et al., 2000). En contraste, en el presente estudio las hojas de trigo (Triticum aestivum L.) asperjadas con BAP conservaron un porcentaje mayor de LSU de Rubisco (50 %) que de proteínas solubles (44 %) a los 41 DDS respecto a los 21 DDS (Figura 1B y Figura 2). Lo anterior evidencia las diferencias en la degradación de macromoléculas entre especies y tratamientos. Al respecto, Buchanan–Wollaston et al. (2005) documentan los resultados en la expresión de genes y en las vías de señalización comparando la senescencia natural y la inducida con oscuridad, resultados que mostraron no solo similitudes sino también diferencias, e inclusive la presencia de vías diferentes en procesos catabólicos, particularmente en la movilización de nitrógeno y de carbohidratos.

Azúcares solubles y almidón

Los resultados de este trabajo indicaron aumento en los contenidos de hexosas y sacarosa del d 21 al d 36, pero después los azucares disminuyeron; sin embargo, en el testigo los niveles se mantuvieron similares hasta los 36 DDS (Figuras 3 A, B, C y D).

Otros autores señalan que el incremento de los azúcares está correlacionado con la degradación de Rubisco, debido a la expresión de la aminopeptidasa CND41 (Parrot et al., 2007). Los resultados del presente estudio no indican una relación entre la degradación de Rubisco y el aumento de azúcares en el testigo (senescente). Los mayores niveles de azúcares se observaron a los 31 DDS, mientras que los niveles de Rubisco disminuyeron significativamente 5 d antes (26 DDS). En contraste, a los 36 DDS las hojas con BAP acumularon azúcares y la cantidad de Rubisco disminuyó significativamente (25 %) comparado con las hojas presenescentes (21 DDS) (Figura 2 y Figuras 3A, B).

La aspersión externa de BAP promovió la acumulación de azúcares Al respecto, Wingler et al. (1998) y Jordi et al. (2000) señalan que el incremento de los azúcares se requiere para permitir el retraso de la senescencia en plantas transgénicas de tabaco (P_SAG12–IPT). Se menciona que las citocininas regulan la expresión de ciertos genes implicados en el reparto de asimilados y en la regulación de la fuente–demanda como la expresión de la invertasa extracelular y de trasportadores de hexosas, que aumentan la utilización de los carbohidratos para impedir el inicio de los procesos catabólicos (Balibrera–Lara et al., 2004; Guivarc'h et al., 2005)).

Actividad de PEPCK y PEPC

En este trabajo se encontró actividad de PEPCK y PEPC durante la senescencia de hojas de trigo, gramínea con metabolismo C₃. Las hojas tratadas con BAP tuvieron valores de actividad de PEPCK mayores (p<0.05) que el testigo, siendo mas marcada entre los 36 y 41 DDS (Figura 4A). Respecto a la actividad de PEPC, a pesar de que tuvo una tendencia a disminuir gradualmente, las hojas tratadas con BAP mantuvieron valores mayores que el testigo (Figura 4B).

Algunas de las funciones principales de PEPCK están relacionadas con la descarboxilación del oxalacetato dentro de un subgrupo de las plantas C₄ y su intervención en la gluconeogénesis durante la germinación de semillas. Sin embargo, PEPCK se ha localizado en diferentes tejidos de plantas, incluyendo aquellas del subgrupo de las NADP–ME de las plantas C₄, frutos, tricomas, canales de resina, raíces, semillas en desarrollo, en haces vasculares y en hojas de plantas C₃ como pepino (Cucumis sativus) y tabaco (Nicotiana tabacum) (Walker et al., 2001; Leegood y Walker, 2003). La PEPCK se encuentra presente en hojas senescentes de pepino (Cucumis sativus) (C₃), distribuida principalmente en el floema y en los tricomas. La asociación de PEPCK a los haces vasculares, en esta especie, sugiere que está involucrada en el trasporte de aminoácidos, regulación del pH con una función cataplérotica para regular la presencia de oxalacetato en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) durante la síntesis de aminoácidos (Chen et al., 2000). Se propone que PEPCK, PEPC y el ciclo TCA, están involucrados en la síntesis de glutamina, principal aminoácido transportable en la senescencia foliar natural (Buchanan–Wollaston et al., 2005). También se señala que el reciclamiento de nitrógeno en las hojas senescentes de trigo involucra un sistema coordinado entre el citosol y peroxisomas, en donde intervienen diferentes enzimas, entre ellas PEPC, isocitrato deshidrogenasa, aconitato hidratasa y citrato sintetasa (Gregersen y Holm, 2007). La PEPC está presente también en hojas de las plantas C₃ no senescentes y se le atribuyen funciones anapleróticas, porque proporciona los esqueletos carbonados para la biosíntesis de aminoácidos y regula el pH (Häusler et al., 2002). La estrecha relación de PEPC con el metabolismo de nitrógeno fue demostrada por Duff y Chollet (1995), quienes observaron que la actividad de PEPC aumentó en fragmentos de hojas de trigo incubados en N0₃– y luz. Es probable que el tratamiento con BAP promueva la actividad de PEPCK y PEPC para regular el pH debido a que las hojas disminuyen la translocación de compuestos nitrogenados (Jordi et al., 2000); pero requieren mantener un pH óptimo en las células para las reacciones bioquímicas y fisiológicas del metabolismo.

Permeabilidad de la membrana

Durante la senescencia foliar, la membrana plasmática y las membranas de otros organelos pierden su permeabilidad debido a las modificaciones moleculares de la bicapa de lípidos, promovida inicialmente por procesos oxidativos (Hopkins et al., 2007). Pero, las citocininas retrasan este proceso natural; al aumentar de la actividad de enzimas antioxidantes catalasa y ascorbato peroxidada, las membranas citoplasmatica y del cloroplasto se protegen a del daño oxidativo, evidenciado por la reducción en la pérdida de electrolitos y el mantenimiento de la estructura de las membranas cloroplásticas (Zavaleta–Mancera et al., 2007). En el reverdecimiento de Nicotiana rustica L, BAP promueve el reensamblaje de las membranas tilacoidales en cloroplastos envejecidos ó gerontoplastos (Zavaleta–Mancera et al., 1999). Los resultados del presente estudio indican que la liberación de electrolitos (17%) se mantuvo sin cambios (p<0.05) en las hojas con BAP y en el testigo del d 21 al d 36 (Figura 5). Pero a los 41 DDS aumentó la liberación de electrolitos en el testigo (32%), este valor indica daño a la membrana citoplasmática (Figura 5). En segmentos de hojas de Catharanthus roseus L. la liberación de electrolitos se mantuvo constante por 10 d, pero cuando fueron incubados en BAP, ocurriendo cambios significativos solo en los últimos días del tratamiento (Zhang et al., 2007).

CONCLUSIONES

La citocinina BAP, además de mantener por más tiempo las concentraciones de clorofila, proteínas solubles totales y la Rubisco, puede modificar la actividad enzimática de PEPC y PEPCK, conservando un alto contenido de azúcares y reduciendo la pérdida de electrolitos. El entendimiento del retraso de la senescencia foliar puede proporcionar información para implementar tecnologías en la manipulación de la senescencia de forrajes, hortalizas verdes y de ornamentales de follaje.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue parcialmente financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México (Proyecto SEP–CONACYT 43866/A–1).

LITERATURA CITADA

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