Diversidad genética de lotes de Piaractus mesopotamicus usados en programas de repoblamiento y sus implicaciones en la conservación

Genetic diversity in Piaractus mesopotamicus stocks used in stock enhacement programs and implications for conservation

N. Mauricio Lopera–Barrero¹*, Ricardo Pereira–Ribeiro¹, Jayme Aparecido Povh², Lauro Vargas¹ Carolina Bespalhok Jacometo¹, P. Cristina Gomes¹

¹ Universidade Estadual de Maringá, Núcleo de Pesquisa PeixeGen. Avenida Colombo 5790, CEP 87020–900. Maringá, Paraná–Brasil. *Autor responsable: (nelson.peixegen@gmail.com)

² Universidade Federal de Mato Grosso. Rodovia Rondonópolis–Guiratinga, Km 06, Mato Grosso–Brasil.

Recibido: Octubre, 2007.
Aprobado: Enero, 2009.

Resumen

Modificaciones ambientales derivadas principalmente de acciones humanas han causado la disminución y desaparición de varias poblaciones de peces. Para minimizar este impacto se aplican programas de repoblamiento en varios estados brasileños. Sin embargo, sin la adecuada evaluación estos programas pueden producir cambios genéticos en las poblaciones de peces nativos. Por tanto, el objetivo de este estudio fue analizar la diversidad genética de lotes de Piaractus mesopotamicus usados en programas de repoblamiento, mediante el marcador molecular RAPD. Se analizaron 120 reproductores en cuatro estaciones de piscicultura ubicadas en las ciudades de Sapopema (S), Cornélio Procópio (CP), Cambará (C) y Londrina (L), en el estado del Paraná, Brasil. Los resultados de variabilidad genética determinados usando el porcentaje de fragmentos polimórficos (S=74.15 %; CP=78.80 %; C = 77.61 %; L = 92.90 %) y el índice de diversidad genética de Shannon (S=0.381; CP=0.422; C = 0.438; L=0.522), mostraron una alta variabilidad genética en todos los lotes. Sin embargo, se encontró una alta similitud genética entre los lotes S, CP y P debido posiblemente al efecto fundador, ya que los lotes se fundaron con reproductores recolectados en el rio Paraná. Este resultado se corroboró con los valores de Gst y de flujo génico que mostraron una moderada diferenciación genética y un alto flujo génico. El lote de reproductores de L tuvo una mayor distancia genética con los otros lotes, debido a que se fundó con reproductores recolectados en el rio Paranapanema. También se constató que los lotes de reproductores CP y C fueron los más semejantes genéticamente (identidad genética–IG = 0.954) y que los lotes S y L presentaron menos genes en común (IG=0.692). El lote L fue el más distante de todos.

Palabras Clave: Genética de la conservación, peces, Piaractus mesopotamicus, RAPD, repoblamiento, variabilidad genética.

Abstract

Environmental changes caused principally by human action have provoked reduction and even disappearance of several populations of fish. To minimize this impact stock enhancement programs are being implemented in several Brazilian states. However, without adequate evaluation, these programs can produce genetic changes in populations of native fish. Therefore the objective of this study was to analyze, with the RAPD molecular marker, the genetic diversity of Piaractus mesopotamicus stocks used in stock enhancement programs. One hundred twenty broodstocks at four fish farm stations located in the Sapopema (S), Cornélio Procópio (CP), Cambará (C), and Londrina (L) cities, in the Paraná state, Brazil, were analyzed. The results of genetic variability determined using the percentage of polymorphic fragments (S = 74.15 %; CP=78.80 %; C = 77.61 %; L=92.90 %) and the Shannon genetic diversity index (S=0.381, CP=0.422; C = 0.438; l=0.522) showed high genetic variability in all of the broodstocks. However, high genetic similarity was found between the S, CP, and P stocks possibly due to the founder effect since the stocks were founded with broodstocks collected in the Paraná River. The result was corroborated with Gst values and gene flow, which showed moderate genetic differentiation and high gene flow. The broodstock from L had a greater genetic distance from the other stocks because it was founded with broodstocks collected in the Paranapanema River. It was also confirmed that the broodstocks CP and C were the most genetically similar (genetic identity–GI=0.954) and the S and L broodstocks had less genes in common (GI=0.692). The L stock was the most distant of all the broodstocks.

INTRODUCCIÓN

La contaminación de los ríos, la construcción de hidroeléctricas y la sobrepesca han contribuido con la reducción y hasta la desaparición de muchas especies de peces. Entre éstas, el pacu, Piaractus mesopotamicus (orden Characiformes, familia Characidae, subfamilia Myleinae) conocido como caranha o pacu caranha (Nakatani et al., 2001), es una especie nativa migratoria de las cuencas de los ríos Paraná, Paraguay y Uruguay (Urbinati y Gonçalves, 2005) y presenta una reducción progresiva de sus poblaciones.

Esta especie tiene alto valor comercial y social y se adapta fácilmente a la cría en ambientes controlados, por lo cual se toman acciones para su conservación. Así, los programas de repoblamiento son cada vez más comunes en el Brasil (Hisldorf et al., 2006) y otros países. Sin embargo, estos programas sin la adecuada evaluación pueden representar una mayor amenaza para los ecosistemas y las poblaciones de peces (Agostinho et al., 2005).

Estudios biológicos y reproductivos asociados a la evaluación genética de las poblaciones naturales y de los lotes en los cultivos de los lotes en los cultivos de peces usando RAPD, generan valiosa información para tener éxito en la producción y en la conservación de especies acuáticas (Barroso et al., 2005, Sirol y Britto, 2006). Incluso en aquellas en vía de extinción (Lopera-Barrera et al., 2006).

Por tanto, el objetivo del presente estudio fue analizar la diversidad genética de lotes de P. mesopotamicus usados en programas de repoblamiento mediante la técnica RAPD. Los resultados contribuirán a orientar los programas de repoblamiento realizados en ríos brasileños para evitar la pérdida de diversidad genética en los lotes de reproductores y en las poblaciones nativas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material biológico

Extracción, cuantificación e integridad del ADN

Para extraer ADN se usó la metodología descrita por Bardakci y Skibinski (1994), modificada por Povh et al. (2005). Fragmentos de aleta caudal (aproximadamente 0.5 cm^–2) preservadas a –20 ° con alcohol etílico 100 %, se colocaron en micro–tubos con 550 µL de solución amortiguadora de lisis (50 mM Tris–HCl pH 8.0, 50,ítM EDTA, 100 mM NaCl, 1 % SDS) y 200 µg mL^–1 de proteinasa K, y se incubaron en baño maría a 50 °C por 12 h. El ADN se lavó con dos extracciones con fenol y tres de cloroformo, precipitado con dos veces y media de volumen de alcohol etílico absoluto helado y un décimo de volumen de acetato de sodio en relación al volumen recuperado, y se incubó 2 h a –20 °C. El ADN fue centrifugado, lavado con 2 mL de alcohol etílico 70 %, suspendido en 60 µL de solución amortiguadora TE (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA) y tratado con 30 µg mL^–1 de ARNsa. Las muestras se incubaron 40 min en baño maría a 37 °C y conservados a —20 °C.

El ADN fue cuantificado en espectrofotómetro Shimadzu UV 1601 (EE.UU.) (amplitud de onda 260 nm) y diluido en solución amortiguadora TE para una concentración de 10 ng µL^–1. La integridad del ADN se verificó en electroforesis horizontal usando un gel de agarosa 1 %, con 3 V cm^–1 por 60 min, en solución amortiguadora TBE 1X (500 mM Tris–HC1, 60 mM ácido bórico, 83 mM EDTA). El gel se marcó con bromuro de etidio (0.5 µg mL^–1) por 30 min y la imagen fue capturada con el sistema fotográfico EDAS (Kodak 1D Image Analysis 3.5, EE.UU.).

Amplificación y electroforesis

Las condiciones de amplificación fueron las descritas por Williams et al. (1990), con modificaciones. El ADN se amplifico en un volumen de reacción de 25 µL, en el cual se usó la solución amortiguadora Tris–KCl 1X (Tris–HCl 20 mM pH 8.4, KCl 50 mM), 2 mM MgCl₂, 100 ng iniciador, 0.2 mM de cada dNTP, 1 U de Taq ADN Polimerasa (Invitrogen®, EE.UU.), y 20 ng ADN molde. Las reacciones de RAPD fueron realizadas en un termociclador Eppendorf Mastercycler® Gradient (EE.UU.), programado para 40 ciclos, con un paso inicial de desnaturalización a 94 °C por 4 min y un paso final de extensión a 72 °C por 5 min. Cada ciclo consistió de 1 min a 94 °C, 90 s a 40 °C y 2 min a 72 °C.

Se evaluaron 60 iniciadores del Kit Operon (Operon Technologies Inc. Alameda, CA, EE.UU.). Para evaluar los lotes se seleccionaron aquellos iniciadores con buenas características reproducibles y de nitidez. Los productos de amplificación se separaron en gel de agarosa 1.5 %. En electroforesis horizontal se usaron 20 µL del producto amplificado y 2 µL de solución amortiguadora de muestra (40 % sacarosa, 0,25 % azul de bromofenol). La electroforesis se realizó con 3 V cm^–1 por 4 h usando solución amortiguadora TBE 1X. Para verificar la existencia de contaminación se usó un testigo negativo para cada reacción, donde para su amplificación se adicionaron todos los componentes citados, excepto el ADN. Para la revelación del gel se usó un baño en solución de 0.5 µg mL^–1 de bromuro de etidio por 30 min y cada gel fue fotografiado con el sistema fotográfico EDAS (Kodak 1D Image Analysis 3.5, EE.UU.).

Análisis estadístico

El tamaño de los fragmentos se determinó por comparación con un ADN Ladder de 100 pb (15 bandas con tamaño entre 100 y 2072 pb – Invitrogen®, EE.UU). La presencia o ausencia de fragmentos de tamaños moleculares idénticos se usó para construir una matriz de similitud con base en el cálculo del coeficiente de similitud de Jaccard, codificando 1 como presencia de fragmento y 0 su ausencia.

La variabilidad genética se determinó por el porcentaje de fragmentos polimórficos y por el índice de diversidad genética de Shannon. La diferenciación genética entre los lotes se determinó por el cálculo de Nei (1973)(Gst), donde la significancia estadística del Gst fue calculada con la prueba X². El nivel de diferenciación se usó mediante la definición propuesta por Wright (1978), donde valores entre 0.00 a 0.05; 0.05 a 0.15; 0.15 a 0.25 y > 0.25 indican pequeña, moderada, alta y elevada diferenciación genética. Estos análisis estadísticos junto con la determinación del flujo génico por medio del número de emigrantes por generación (Nm) y de la distancia e identidad genética entre los lotes se determinaron mediante el programa PopGene 1.31 (Yeh et al., 1999). La distancia genética basada en Nei (1972) y el método de agrupamento UPGMA se usaron para elaborar un dendrograma, usando el programa estadistico NTSYS 1.7 (Rohlf, 1989).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La amplificación de las muestras de P. mesopotamicus con los 10 iniciadores seleccionados (OPA01, OPA02, OPA03, OPA05, OPA06, OPW01, OPW02, OPW03, OPW19 y OPX01), utilizando el marcador molecular RAPD, produjo 67 fragmentos polimórficos con tamaño entre 200 pb (obtenido con la amplificación del iniciador OPA06) y 1500 pb (obtenidos con la amplificación de los iniciadores OPW01 y OPW19). Los fragmentos variaron de cuatro (iniciadores OPA01 y OPA03) a 15 (iniciador OPW19).

Los resultados de variabilidad genética, calculados por el porcentaje de fragmentos polimórficos y por el índice de diversidad genética de Shannon para los lotes de reproductores de las ciudades de Sapopema (S), Cornélio Procópio (CP), Cambará (C) y Londrina (L), mostraron una alta variabilidad genética en todos los lotes analizados, debido posiblemente a su correcto manejo reproductivo. Esto, según Moreira et al. (2007), resulta en la preservación de la diferenciación genética entre los reproductores. Sin embargo, se encontró una variabilidad genética semejante entre S, CP y C debido posiblemente al efecto fundador (diversidad genética con la cual los lotes de reproductores se formaron), ya que los lotes se formaron a partir de reproductores de poblaciones nativas recolectados en el rio Paraná (Figuras 2 y 3).

Este resultado se corroboró con la moderada diferenciación genética encontrada entre ellos y por el alto valor de flujo génico que demuestra un alto número de emigrantes entre los lotes (Cuadro 1). Esta situación es común en poblaciones nativas de peces como fue verificado por Leuzzi et al. (2004), quienes analizaron poblaciones de Astyanax altiparanae de dos reservorios del río Paranapanema y encontraron flujo génico entre poblaciones separadas geográficamente.

Al analizar el lote de reproductores de L se comprobó una alta variabilidad genética en comparación con los otros. Este resultado se puede atribuir a que este lote se formó con reproductores de poblaciones naturales recolectados en el rio Paranapanema, existiendo una diferenciación geográfica y de manejo.

El análisis de los valores (Cuadro 2) de identidad genética (IG) y de distancia genética (DG) indica que los lotes de reproductores CP y C fueron los más semejantes genéticamente (IG=0.954) y que los lotes S y L fueron los más divergentes (IG=0.692). El lote L fue el más distante. Estos resultados coincidieron con el dendrograma, el cual mostró la formación de dos agrupamientos: uno compuesto por los lotes S, CP y C y otro formado sólo con los individuos del lote L (Figura 4).

Las especies de importancia comercial y especialmente aquellas amenazadas de extinción como el P. mesopotamicus, requieren una constante evaluación genética de los lotes mantenidos en los cultivos de peces y en sus poblaciones nativas. El análisis genético de lotes de cultivo es información importante para la producción y la conservación de peces (Sirol y Britto, 2006). Una pérdida de variabilidad genética por errores en la formación de lotes o por el inadecuado manejo reproductivo puede inducir a problemas de endogamia (Ortega–Villaizán Romo et al., 2006), adaptabilidad y supervivencia de progenies usadas en programas de repoblamiento (Frost et al., 2006).

Por tanto, los lotes de reproductores usados en cultivos de peces y en programas de repoblamiento, como los analizados en este estudio, deben ser iniciados con un gran número de individuos cuidadosamente seleccionados (Aho et al., 2006). La correcta elección de los reproductores que serán usados en la formación del lote de cultivo de peces y su evaluación genética pueden ofrecer bases importantes para formular estrategias de manejo reproductivo (Sønstebø et al., 2007). Estas estrategias permitirán un intercambio seguro de reproductores entre las estaciones piscícolas, para fragmentar ciclos de endogamia comunes en ambientes controlados (Moreira et al., 2007) y que pueden definir la conservación de una especie y su futuro potencial biológico (Melo et al., 2006).

Con estas evidencias y los resultados de variabilidad, distancia e identidad genética, se puede sugerir que el manejo reproductivo, genético y de mejoramiento de los lotes de P. mesopotamicus de la región de Sapopema, Cornélio Procópio y Cambará, debe ser homogéneo y no en lotes separados, especialmente cuando el objetivo sea conservar poblaciones nativas de esta especie mediante el repoblamiento. Además, para mantener la variabilidad genética de esos lotes es necesario introducir nuevo material genético (reproductores). Estos pueden ser recolectados de poblaciones nativas genéticamente diferentes o directamente del lote de Londrina y sus progenies, ya que éste fue divergente de ellos, pudiendo contribuir con un acervo genético que permita preservar la variabilidad genética. Es importante destacar que la introducción e intercambio de reproductores se debe realizar con base en análisis genéticos, ya que es posible crear una depresión exogámica cuya consecuencia es la disminución de la variabilidad genética.

El aumento del número efectivo de reproductores (Freitas y Galetti Jr, 2005), la formación y manejo de diferentes lotes (de diferentes orígenes) y el eficiente manejo reproductivo (selección de reproductores, formación de cruzamientos, selección de sistemas reproductivos) (Porta et al., 2006) son otros factores que permitirán un correcto y exitoso desarrollo de la piscicultura y de la conservación de las especies de valor zootécnico y de aquellas amenazadas de extinción, como es el P. mesopotamicus.

Con los resultados de este estudio fue posible obtener un perfil de los lotes de reproductores de estos cultivos de peces, su caracterización genética y la objetiva orientación genética y reproductiva que permitirá un correcto manejo de la producción y de la conservación del P. mesopotamicus utilizando programas de repoblamiento. Para eso, el marcador molecular RAPD fue eficaz y ofreció resultados.

CONCLUSIONES

Se encontró una alta variabilidad genética en todos los lotes. Sin embargo, hubo una alta semejanza genética entre los lotes de reproductores de Sapopema, Cornélio Procópio y Cambará debido a que los lotes se formaron con reproductores recolectados sólo en el río Paraná (efecto fundador). El lote de Londrina fue diferente de los otros porque se formó con poblaciones nativas del río Paranapanema.

LITERATURA CITADA

Agostinho, A. A., S. M. Thomaz, and L. C. Gomes. 2005. Conservation of the biodiversity of Brazil's inland waters. Conserv. Biol. 19: 646–652.        [ Links ]

Aho, T., J. Rönn, J. Piironen, and M. Björklund. 2006. Impacts of effective population size on genetic diversity in hatchery reared Brown trout (Salmo trutta L.) populations. Aquaculture 253: 244–248.        [ Links ]

Bardakci, F., and D. O. F. Skibinski. 1994. Application of the RAPD technique in tilapia fish: species and subspecies identification. Heredity 73: 117–123.        [ Links ]

Barroso, R. M., A. W. S. Hilsdorf, H. L. M. Moreira, P. H. Cabello, and Y. M. Traub–Cseko. 2005. Genetic diversity of wild and cultured populations of Brycon opalinus (Cuvier, 1819) (Characiforme, Characidae, Bryconiae) using microsatellites. Aquaculture 247: 51–65.        [ Links ]

Freitas, P. D., and P. M. Galetti Jr. 2005. Assessment of the genetic diversity in five generations of commercial broodstock line of Litopenaeus vannamei shrimp. Afr. J. Biotechnol. 4: 1362–1367.        [ Links ]

Frost, L. A., B. S. Evans, and D. R. Jerry. 2006. Loss of genetic diversity due to hatchery culture practices in barramundi (Lates calcarifer). Aquaculture 261: 1056–1064.        [ Links ]

Hilsdorf, A. W. S., E. K. Resende, e D. K. S. Marques. 2006. Genética e Conservação de Estoques Pesqueiros de Águas Continentais no Brasil: Situação Atual e Perspectivas. Embrapa Pantanal. Documentos 82. Corumbá. 43 p.        [ Links ]

Leuzzi, M. S. P., F. S. Almeida, M. L. Orsi, and L. M. K. Sodré. 2004. Analysis by RAPD of the genetic structure of Astyanax altiparanae (Pisces, Characiformes) in reservoirs on the Paranapanema River, Brazil. Genet. Mol. Biol. 27: 355–362.        [ Links ]

Lopera–Barrero, N. M., R. P. Ribeiro, R. N. Sirol, J. A. Povh, P. C. Gomes, L. Vargas, and D. P. Streit Jr. 2006. Genetic diversity in piracanjuba populations (Brycon orbignyanus) with the RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) markers. In: Annual Meeting of American Dairy Science Association and American Society of Animal Science. Minneapolis, USA. pp: 170.        [ Links ]

Machado–Schiaffino, G., E. Dopico, and E. Garcia–Vazquez. 2007. Genetic variation losses in Atlantic salmon stocks created for supportive breeding. Aquaculture 264: 59–65.        [ Links ]

Melo, D. C., D. A. A. Oliveira, L. P. Ribeiro, C. S. Teixeira, A. B. Souza, E. G. A. Coelho, D. V. Crepaldi, e E. A. Teixeira. 2006.   Caracterização genética de seis plantéis comerciais de tilápia (Oreochromis) utilizando marcadores microssatélites Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 58: 87–93.        [ Links ]

Moreira, A. A., A. W. S. Hilsdorf, J. V. Silva, e V. R. Souza. 2007. Variabilidade genética de duas variedades de tilápia nilótica por meio de marcadores microssatélites. Pesqui. Agropecu. Bras. 42: 521–526.         [ Links ]

Nakatani, K., A. A. Agostinho, G. Baumgartner, A. Bialetzki, P. V. Sanches, M. C. Makrakis, e C. S. Pavanelli. 2001. Ovos e Larvas de Peixes de Água Doce. EDUEM. Maringá. 378 p.         [ Links ]

Nei, M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proc. Nat. Acad. Sci. 70: 3321–3323.         [ Links ]

Ortega–Villaizán Romo, M. M., M. Aritaki, and N. Taniguchi. 2006. Pedigree analysis of recaptured fish in the stock enhancement program of spotted halibut Verasper variegates. Fish. Sci. 72: 48–52.         [ Links ]

Porta, J., J. M. Porta, G. Martínez–Rodríguez, and M. C. Alvarez. 2006. Genetic structure and genetic relatedness of a hatchery stock of Senegal sole (Solea senegalensis) inferred by microsatellites. Aquaculture 251: 46–55.         [ Links ]

Povh J. A., H. L. M. Moreira, R. P. Ribeiro, A. P. Prioli, L. Vargas, D. V. Blanck, E. Gasparino, e D. P. Streit Jr. 2005. Estimativa da variabilidade genética em tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) com a técnica de RAPD. Acta Sci. An. Sci. 27: 1–10.         [ Links ]

Rohlf, F. J. 1989. NTSYS–Pc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System. Exeter Publishers. New York. USA. 191 p.        [ Links ]

Sirol, R. N., e S. G. Britto. 2006. Conservação e manejo da ictiofauna: repovoamento. In: Nogueira M.G., R. Henry, and A. Jorcin. (eds). Ecologia de Reservatórios: Impactos Potenciais, Ações de Manejo e Sistemas em Cascatas. RiMA. São Carlos. Brasil. pp: 275–284.         [ Links ]

Sønstebø, J. H., R. Borgstrøm, and M. Heun. 2007. Genetic structure of brown trout (Salmo trutta L.) from the Hardangervidda mountain plateau (Norway) analyzed by microsatellite DNA: a basis for conservation guidelines. Conserv. Genet. 8: 33–44.         [ Links ]

Urbinati, E. C., e F. D. Gonçalves. 2005. Pacu (Piaractus mesopotamicus). In: Baldisserotto, B., e L.C. Gomes (eds). Espécies Nativas para Piscicultura no Brasil. UFMS. Santa Maria. Brasil. pp: 225–246.         [ Links ]

Williams, J. G. K., J. A. Rafalski, A. R. Kubelik, K. J. Livak, and S. V. Tingey. 1990. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18: 6531–6535.         [ Links ]

Wright, S. 1978. Evolution and Genetics of Population. University of Chicago Press. Chicago. USA. 580 p.         [ Links ]

Yeh, F. C., T. Y. Z. Boyle, and J. M. Xiyan. 1999. PopGene Version 131: Microsoft Window–based freeware for population genetic analysis. University of Alberta and Center for International Forestry Research, USA. 29 p.        [ Links ] ]]> 2005 19 646-652 2006 253 244-248 1994 73 117-123 2005 247 51-65 2005 4 1362-1367 2006 261 1056-1064 2006 82 43 2004 27 355-362 2006 170 2007 264 59-65 2006 58 87-93 2007 42 521-526 2001 378 1973 70 3321-3323 2006 72 48-52 2006 251 46-55 2005 27 1-10 1989 191 2006 275-284 2007 8 33-44 2005 225-246 1990 18 6531-6535 1978 580 1999 29