Estimulación de la síntesis de ADN y de proteínas del ciclo celular por auxinas durante la germinación de maíz
Auxin–Stimulation of DNA synthesis and cell cycle proteins during maize germination
Yazmín Arellano, Elpidio García y Jorge M. Vázquez–Ramos*
Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México. Avenida Universidad y Copilco, México D.F. 04510, México. * Autor responsable: (jorman@servidor.unam.mx)
]]> Recibido: Enero, 2008.
Resumen
El establecimiento y progreso del ciclo celular son eventos importantes para la germinación de las semillas. En maíz las auxinas y las citocininas añadidas exógenamente estimulan la síntesis de ADN durante las horas tempranas de la germinación y este efecto depende, en mayor o menor grado, de la presencia de sacarosa en el medio de imbibición. No obstante, en ausencia de hormonas añadidas exógenamente, la presencia o ausencia de sacarosa no afecta la síntesis de ADN a tiempos tempranos o tardíos de la germinación. Por tanto, el efecto de los fitorreguladores se relacionaría más con la estimulación de una acción mitogénica, que con el proceso germinativo per se. Al medir la presencia de proteínas específicas de las fases G1 y S del ciclo celular, en presencia de auxinas, fue evidente que marcadores de G1 como las ciclinas D2;1 y D4;1, o bien marcadores de la fase S como ciclina A1 o PCNA, no cambiaron sus niveles durante la germinación. Además, los niveles de un marcador de G1, la ciclina D5;2 y un marcador de la fase S, la ADN polimerasa α, aumentaron visiblemente en respuesta a la adición de auxinas. Esta respuesta y en particular la de la ADN polimerasa α, podría explicar el aumento en la síntesis de ADN causada por la adición de auxinas en ejes embrionarios durante la germinación.
Palabras clave: Zea mays, auxinas, ciclo celular, germinación.
Abstract
The establishment and progress of the cell cycle are important events for the germination of seeds. In maize the auxins and the exogeniously added cytokinins stimulate the synthesis of DNA during the early hours of germination, and this effect depends, to a greater or lesser extent, on the presence of sucrose in the imbibition buffer. However, in the absence of exogeniously added hormones, the presence or absence of sucrose does not affect the synthesis of DNA at early or late times of germination. Therefore, the effect of the phytoregulators would be more related to the stimulation of a mitogenic action, than to the germinative process per se. When measuring the presence of specific proteins of the phases G1 and S of the cell cycle, in the presence of auxins, it was evident that markers of G1 such as the cyclins D2;1 and D4;1, or markers of the S phase such as cyclin A1 or PCNA, did not change their levels during germination. Besides, the levels of a marker of G1, the cyclin D5;2 and a marker of the S phase, the DNA polymerase a, increased visibly in response to the addition of auxins. This response and in particular that of DNA polymerase a, could explain the increase in the synthesis of DNA caused by the addition of auxins in embryonic axes during germination.
Key words: Zea mays, auxins, cell cycle, germination.
]]>INTRODUCCIÓN
La germinación de las semillas es importante en el ciclo de vida de una planta y para perpetuar la especie. Este proceso empieza con la entrada de agua a la semilla (imbibición) y termina con la elongación del eje embrionario, generalmente con la emergencia de la radícula. El proceso incluye: hidratación de proteínas, cambios estructurales subcelulares (reparación de membranas, de ADN), respiración, síntesis de macromoléculas y elongación celular (Bewley y Black, 1994). El resultado combinado es la conversión de un embrión deshidratado, con un metabolismo casi nulo, en un embrión con un metabolismo activo y vigoroso. Bioquímicamente la germinación involucra la consecución exitosa de la serie de procesos moleculares que anteceden a la primera ronda de división celular, que es esencial para la proliferación requerida para el establecimiento de la plántula (Vázquez y Sánchez, 2003).
La división de una célula en dos idénticas resulta de la acción de múltiples proteínas durante un proceso molecular denominado ciclo celular. Las células pasan de un estado G1, o de reconocimiento del ambiente y de acumulación de materiales celulares y de energía, altamente regulado, a una fase S donde se duplica el ADN. Luego, la fase G2 funciona como una etapa de revisión de integridad genética y celular, la fase M o de mitosis, donde el material genético previamente duplicado, es segregado en paquetes cromosómicos idénticos a las células hijas. La regulación de la transición entre las diferentes fases del ciclo celular está dada, en parte, por motores moleculares que causan grandes cambios metabólicos a partir de la fosforilación de proteínas blanco, formados por proteínas ciclinas y por cinasas que dependen de las primeras. Hay ciclinas de cada fase del ciclo celular y generalmente son destruídas al terminar cada etapa. La cinasa, o enzima que fosforila proteínas, requiere de la ciclina para activarse, por lo que se denomina cinasa dependiente de ciclina o CDK; así, la desaparición de la ciclina en cada fase causa la caída en la actividad de la cinasa asociada (Pines, 1993). En células de eucariotes superiores, como las de plantas, las ciclinas de G1 se denominan ciclinas D y hay varios tipos (Quelle et al., 1993, Renaudin et al., 1996). Otras como las ciclinas A y B, funcionan en S/G2 y G2/M, siempre asociadas a CDKs (Renaudin et al., 1996).
La investigación se ha centrado en el estudio de la fase G1 y de la transición hacia la fase S durante la germinación de semillas de maíz, fases muy importantes para una germinación exitosa de las semillas (Elder et al., 1987; Gutiérrez et al., 1993; Vázquez y Sánchez, 2003). Se han clonado varias ciclinas D (Quiroz y Vázquez, 2006) y se ha demostrado que este tipo de proteínas se asocian a CDKs y a otras proteínas (Lara et al., 2008); entre ellas destaca el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), un factor esencial que permite a las ADN polimerasas duplicar eficientemente el ADN (Prelich et al., 1987). Además PCNA se asocia a complejos ciclinas–cinasas, pero su función y propósito son materia de especulación (Sánchez et al., 2002).
Los fitorreguladores controlan proocesos múltiples en la vida de los vegetales, entre los que destaca la germinación. Hormonas como el ácido abscísico inhiben la germinación, mientras que otras como las giberelinas, auxinas o citocininas la estimulan de manera especie–dependiente. Citocininas como la benciladenina estimulan el ciclo celular durante la germinación de maíz, aparentemente acelerando la fase G1 (Reyes et al., 1991; Sánchez et al., 2005), mientras que el ácido abscísico la inhibe (Sánchez et al., 2005). El mecanismo de estos procesos es aún materia de especulación.
Las auxinas estimulan notablemente, a nivel transcripcional, la expresión de cuatro ciclinas tipo D durante la germinación de maíz, proteínas que participarían activamente en la activación de la fase G1 (Quiroz y Vázquez, 2006), particularmente considerando que la mayoría de las células en los ejes embrionarios de semillas secas de maíz se encuentran en esta fase. Por tanto, es importante estudiar el efecto de este fitorregulador a nivel de acumulación de proteínas, sobre diferentes marcadores de las fases G1 y S, para tratar de explicar como las auxinas estimulan la germinación.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico
]]> Las semillas de maíz criollo variedad Chalqueño usadas en este trabajo fueron obtenidas de un agricultor del Valle de Chalco, Estado de México, y presentaron una viabilidad mayor a 95%.
Imbibición de ejes embrionarios de semillas de maíz
Los ejes embrionarios se disectaron de semillas de maíz y se almacenaron a 4 °C hasta su utilización. Para su imbibición, los ejes embrionarios se trataron por el método tradicional (Herrera et al., 2000). El ácido indol–3 acético (AIA) se adicionó al amortiguador a concentraciones de 1x10–5, 1x10–6ó 1x10–7mol L–1 y la concentración de benciladenina (BA) fue 1x10–6 mol L–1.
Síntesis de ADN durante la germinación de ejes embrionarios de maíz
La síntesis de ADN se cuantificó según el método de Reyes et al. (1991), usando [metil–3H] timidina (solución acuosa 5 mCi/5.0 mL, Amersham Biosciences) como el sustrato radiactivo incorporado al ADN. Se añadieron benciladenina (BA) o ácido indol 3–acético (AIA) a ejes embrionarios, se germinaron por 15 h y al final se midió la incorporación de timidina tritiada al ADN.
Preparación de extractos crudos de proteínas de ejes embrionarios de maíz
Se colocaron 10 ejes embrionarios de maíz en amortiguador de imbibición en un mortero a 4 °C. Se homogeneizaron agregando 1 mL de solución de extracción de proteínas (25 mmol mL–1 Tris–HCl pH 7.5, 25 mmol mL–1 KCl, 15 mmol mL–1 MgCl2, 75 mmol mL NaCl, 5 mmol mL1 Na2EDTA.2H2O pH 8, 1 mmol mL–1 DTT, 0.2% Tritón X–100, 250 mmol mL"1 sacarosa, 60 mmol mL–1 glicerol, 50 mmol mL–1 NaF, 200 µmol µL–1 Na3VO4, 1 mmol mL–1 EGTA) y una tableta de una mezcla de inhibidores de proteasas (Complete de Böehinger–Mannheim) por cada 50 mL de amortiguador. Finalmente se centrifugaron a 30 000 rpm/4 °C en una centrífuga Sorvall TL100 (Dupont) y el sobrenadante se transfirió a un tubo Eppendorf almacenándolo a –70 °C.
]]>Cuantificación de proteína
Las proteínas en los extractos de ejes embrionarios germinados por diferentes tiempos se cuantificaron por el método de Bradford (1976).
Electroforesis
Las muestras (30 µg proteína) se prepararon y cargaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante a 12%. Las electroforesis se efectuaron por 4 h/80 V, en una cámara Mini–Protean II de Bio–Rad.
Transferencia
Las proteínas separadas en geles de poliacrilamida fueron transferidas a una membrana Immobilon–P (Millipore) por 1h/75 mA, en un Trans–blot SD Semi dry transfer cell de Bio–Rad. Las membranas de Immobilon–P se solvataron en metanol absoluto por 30 s y se depositaron en amortiguador de transferencia (14.4 g glicina, 25 mL Tris–HCl pH 8.3, 200 mL metanol, aforando a 1000 mL de agua) por 5 min. Los geles también fueron incubados en solución de transferencia por el mismo tiempo. Se colocó el electrodo que corresponde al ánodo, seis papeles Whatman 3MM sobre el electrodo, la membrana de Immobilon–P, el gel sobre la membrana y tres papeles Whatman 3MM sobre el gel. Se colocó el electrodo que corresponde al cátodo y se transfirió el gel a 75 mA/1 h.
]]> Inmunodetección (Western blot)
Al terminar la transferencia la membrana fue bloqueada con una solución que contenía PBS 1X (4 g NaCl, 0,1 g KCl, 1.36 g Na2HPO4.7H2O, 0.14 g NaH2PO4.H2O y se completó a un volumen final de 50 mL con agua), más leche semidescremada al 5 % y Tween 20 a 0.9% por 1 h. Se incubó con el anticuerpo respectivo (primer anticuerpo) por 12 h en esta solución a 4 °C con agitación constante. Terminada la incubación, se realizaron lavados con 10 mL PBS 1X/ 15 min, con 10 mL PBS 1X + NaCl 0.5 mol L–1/15 min, y con 10 mL PBS 1X/15 min y se colocó el segundo anticuerpo, anti–IgG de conejo acoplado a peroxidasa 1:10 000 (Santa Cruz Biotechnology) por 1 h. Se realizaron los mismos lavados efectuados para el primer anticuerpo. En un cuarto oscuro se adicionó una solución quimioluminiscente (ECLTM Western Blotting Detection Reagents de Amersham Biosciences) y se revelaron las membranas sobre películas para autoradiografía (HyperfilmTM de Amersham Biosciences).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Dado que las auxinas participan en procesos de elongación, proliferación y crecimiento celulares, se estudió el efecto que causa el ácido indol–3 acético (AIA) sobre la síntesis de ADN en las horas iniciales de la germinación en ejes embrionarios de semillas de maíz. Como testigo se incubaron ejes con benciladenina (BA, 10–6 M) que recorta el tiempo de entrada a la fase S y estimula la síntesis de ADN durante la germinación de maíz; BA estimuló la síntesis de ADN en 50% en ejes embrionarios incubados 15 h, tiempo al cual la fase S ya ha comenzado (Reyes et al., 1991; Sánchez et al., 2005; Figura 1). La adición de AIA (10–5 M a 10–7 M) a los ejes embrionarios aumentó la síntesis de ADN a niveles semejantes o mayores a aquellos en respuesta a BA en el mismo tiempo, sugiriendo que las auxinas también estimulan el ciclo celular durante la germinación de maíz.
La estimulación del ciclo celular en plantas por citocininas requiere la presencia de sacarosa (Riou–Khamlichi et al., 2000). En maíz, la presencia de sacarosa es importante para la estimulación de genes del ciclo celular por BA durante la germinación (Gutiérrez et al., 2005). Dada la presencia de sacarosa en el amortiguador de imbibición, se probó el efecto que su ausencia provocaría en la estimulación de la síntesis de ADN por BA y AIA. En su ausencia se eliminó el efecto estimulatorio por BA (Figura 2A), mientras que AIA estimuló la síntesis de ADN, aunque sólo un 25%, sugiriendo que la estimulación de la síntesis de ADN por AIA también requiere la presencia de sacarosa (Figura 2A). En presencia de sacarosa, ambas hormonas estimularon de forma importante la síntesis de ADN (Figura 2B). Las variaciones entre experimentos en cuanto al grado de estimulación suceden con frecuencia y quizás se deban a la heterogeneidad de los lotes de semillas, dado que el Chalqueño es un maíz criollo.
Es importante señalar que la síntesis de ADN en experimentos testigo (sin añadir fitorreguladores) no se modifica en ausencia de sacarosa, ni aún después de 30 h de imbibición (datos no mostrados). Esto sugiere que los ejes embrionarios de maíz tienen la suficiente fuente de carbono para el proceso germinativo y que el efecto que produce la sacarosa (o sus metabolitos) al adicionar de los fitorreguladores se relacionaría más con una estimulación de una acción mitogénica, que con el proceso germinativo per se.
La estimulación de la síntesis de ADN por auxinas, en presencia de sacarosa, sugiere que el AIA impulsa el ciclo celular desde la fase G1. Se estudió entonces el comportamiento de proteínas del ciclo celular de la fase G1 como las ciclinas D5;2, D4;1 y D2;1, y de la fase S, la ciclina A1, PCNA y la ADN polimerasa a, a tiempos tempranos de la germinación usando anticuerpos específicos. Las ciclinas A1, D2;1 y D4;1 y PCNA no dieron respuesta alguna a la adición de AIA, comparadas con el testigo sin hormona añadida (datos no mostrados). El caso de PCNA es sorprendente, dado que es un marcador usado frecuentemente en estudios de proliferación celular y se ha demostrado que BA estimula notablemente su acumulación durante la germinación (Herrera et al., 2000).
]]> Los otros dos marcadores, la ciclina D5;2 (G1) y la ADN polimerasa α (S), sí respondieron a la adición de AIA. La ciclina D5;2 presenta un aumento más rápido en las primeras 9 h de germinación, comparado con el testigo (Figura 3). La cantidad de ADN polimerasa a en ejes embrionarios testigo no varió significativamente, mientras que en ejes tratados con auxinas hubo una ligera disminución inicial hacia las 3 h, que se revierte gradualmente y, hacia las 12 h la cantidad de enzima es mayor a la observada a las 3 h en embriones tratados y ligeramente mayor a la presente en ejes no imbibidos (Figura 4). Durante la germinación testigo la cantidad de la ADN polimerasa α no cambia durante las primeras 12 h de germinación (Coello y Vázquez, 1995). Es posible que las auxinas provoquen su recambio en las primeras horas de la germinación para después promover su recuperación mediante un proceso de síntesis de novo y quizás también de su activación. De ser el caso, quizás esta nueva enzima responda a la estimulación hormonal y, por tanto, es la responsable del aumento en la síntesis de ADN reportada aquí. Complejos ciclina–Cdk de maíz fosforilaban y activaban a la DNA polimerasa α en tiempos donde la fase S progresa (entre las 12 y 20 h de germinación), y la activación era mayor en presencia de BA (Gómez y Vázquez–Ramos 2003), la que acelera el tiempo de entrada a la fase S (Reyes et al., 1991; Sánchez et al., 2005). Sin embargo, entonces no había las herramientas moleculares para determinar la ciclina presente. Aunque se muestra aquí que la cantidad de ciclina D5;2 aumenta por la adición de AIA, se desconoce si ésta es la ciclina que participa en la activación de la polimerasa, pero evidentemente es una línea de investigación muy interesante.
CONCLUSIONES
La síntesis de ADN es estimulada de forma importante por auxinas y citocininas durante la germinación de maíz, implicando que estas sustancias modifican los tiempos del ciclo celular, lo que debería repercutir en el comportamiento de proteínas que participan en la entrada al ciclo. La respuesta no corresponde a una estimulación global de marcadores específicos de las fases G1 y S del ciclo, y sólo proteínas como la ciclina D5;2 y la ADN polimerasa a responden al estímulo hormonal. Finalmente, la fuente carbonada en el amortiguador en que se embeben los ejes embrionarios durante la germinación no parece relevante para que ocurra la síntesis de ADN, pero sí lo es para la estimulación de la síntesis promovida por los fitorreguladores.
AGRADECIMIENTOS
]]> Se reconoce el apoyo de las becas DGAPA–PAPIIT, IN–200706 y CONACYT 42896–Z para realizar esta investigación.
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