Composición de alcaloides en semillas de Lupinus mexicanus (fabaceae) y evaluación antifúngica y alelopática del extracto alcaloideo
Composition of alkaloids in seeds of Lupinus mexicanus (fabaceae) and antifungal and allelopathic evaluation of the alkaloid extract
Francisco Zamora–Natera1, Pedro García–López1, Mario Ruiz–López1 y Eduardo Salcedo–Pérez2
1 Departamento de Botánica y Zoología,
2 Departamento de Madera Celulosa y Papel. Universidad de Guadalajara. 45110. Km. 15.5. Carretera Guadalajara–Nogales. Las Agujas, Zapopan. Jalisco, México (jfzamora@cucba.udg.mx)
]]>Recibido: Marzo, 2007.
Aprobado: Diciembre, 2007.
Resumen
Las plantas sintetizan metabolitos secundarios que se pueden aislar y usar en la agricultura como una alternativa para el control de plagas y enfermedades. Se analizó por cromatografía de gases capilar–espectrometría de masas (CG–EM) la composición de alcaloides en semillas de Lupinus mexicanus; así mismo se estudió in vitro la actividad antifúngica y alelo–pática del extracto crudo de alcaloides. La acción antifúngica del extracto se evaluó con base en la inhibición del crecimiento micelial de los hongos fitopatógenos Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani y Fusarium oxysporum, mientras que la actividad alelopática se evaluó sobre la germinación de semillas de Amaranthus hybridus y Echinochloa crus–galli. El análisis de alcaloides del extracto reveló la presencia de lupanina, 3β–hidroxilupanina, multiflorina afilina, epiafilina y α–isolupanina como compuestos mayoritarios. El extracto, a concentración de 3 mg mL–1, inhibió significativamente el crecimiento micelial de R. solani en 87.7%, mientras que el micelio de S. rolfsii sólo se inhibió 72.5% con la concentración más alta. Sólo la germinación de semillas de A. hybridus mostró diferencias significativas por efecto del extracto, y la inhibición de la germinación fue 80% con la mayor concentración (1 mg mL–1). La lupanina fue el alcaloide más abundante (76.2%) en el extracto de semillas de L. mexicanus. El extracto mostró actividad inhibitoria del crecimiento micelial de R. solani y S. rolfsii, y un efecto fitotóxico o inhibidor de la germinación de semillas de A. hybridus.
Palabras clave: Lupinus, actividad biológica, alcaloides quinolizidínicos, hongos fitopatógenos.
Abstract
Plants synthesize secondary metabolites that can be isolated and used in agriculture as an alternative for the control of pests and diseases. Capillary gas chromatography–mass spectrometry (CG–MS) was used to analyze the composition of alkaloids in seeds of Lupinus mexicanus. In addition, an in vitro study was made of the antifungal and allelopathic activity of the crude extract of alkaloids. The antifungal action of the extract was evaluated based on the inhibition of the mycelial growth of the phytopathogenic fungi Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum, while the allelopathic activity was evaluated on the germination of seeds of Amaranthus hybridus and Echinochloa crus–galli. The analysis of alkaloids from the extract revealed the presence of lupanine, 3β–hydroxylupanine, multiflorine aphylline, epiaphylline and α–isolupanine as majority compounds. The extract, at the concentration of 3 mg mL–1, significantly inhibited the mycelial growth of R. solani by 87.7%, whereas the mycelial growth of S. rolfsii was only inhibited 72.5% with the highest concentration. Only the germination of seeds of A. hybridus showed significant differences from the effect of the extract, and inhibition of germination was 80% with the highest concentration (1 mg mL–1). Lupanine was the most abundant alkaloid (76.2%) in the extract of seeds of L. mexicanus. The extract showed inhibitory activity of the mycelial growth of R. solani and S. rolfsii, and a phytotoxic or inhibitory effect on the germination of seeds of A. hybridus.
]]> Key words: Lupinus, biological activity, quinolizidine alkaloids, phytopathogenic fungi.
INTRODUCCIÓN
Los insectos, microorganismos fitopatógenos y malezas son responsables de la reducción de los rendimientos en cultivos agrícolas. Según Mohamed et al. (1996), las pérdidas económicas por enfermedades causadas por hongos en frutos pueden ser 5 a 50% o más. En especies como trigo o maíz las bajas de rendimiento y las consiguientes pérdidas económicas por malezas son 30% y en algunos casos hasta 90% (Kogan y Pérez, 2003). Aunque estas pérdidas se pueden reducir mediante el uso de variedades resistentes, rotación de cultivos o prácticas sanitarias, el uso de plaguicidas sintéticos para proteger los cultivos es el factor más importante para maximizar los rendimientos (Carpinella et al., 2003).
Sin embargo, el uso indiscriminado de estos productos ocasiona problemas como la eliminación de enemigos naturales, surgimiento de organismos resistentes, acumulación de residuos tóxicos en productos agrícolas y contaminación del ambiente (Duke et al., 2000). Esto ha motivado la búsqueda de productos alternativos en la protección de cultivos contra la acción de organismos fitopatógenos y malezas cuya actividad, selectividad y seguridad ambiental sea adecuada. Los productos naturales son menos agresivos para el ambiente y representan una fuente alternativa de plaguicidas naturales en la agricultura. Los alcaloides quinolizidínicos son un grupo importante de compuestos naturales en el género Lupinus (Fabaceae) (Wink, 2003). Estos metabolitos secundarios son un mecanismo de defensa contra microorganismos fitopatógenos, herbívoros y contra otras especies de plantas que causan competencia (Wink, 1998). Se han hecho estudios preliminares para conocer la actividad funguicida de polvos y extractos crudos obtenidos de semillas de L. campestris, L. montanus y L. exaltatus (Bravo et al., 2000; Zamora et al., 2002). En L. mexicanus, una especie silvestre con amplia distribución en Jalisco, México, y con alto contenido de alcaloides en sus semillas, no se ha estudiado la actividad biológica de estos compuestos. Por tanto, el objetivo de esta investigación fue determinar la composición de alcaloides en semillas de L. mexicanus y evaluar la actividad antifúngica y potencial alelopático in vitro del extracto de alcaloides.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Las semillas de L. mexicanus se recolectaron en mayo de 2005 en el municipio de Lagos de Moreno, Jalisco, México. Se determinó la identidad de la especie usando el herbario del Instituto de Botánica de la Universidad de Guadalajara (Voucher No. 853). Las semillas se molieron y la harina se desengrasó con hexano en equipo soxhlet.
Extracción de alcaloides para análisis
]]> La extracción de alcaloides se hizo según Muzquiz et al. (1993): 500 mg de harina se homogenizaron con 5 mL de ácido tricloroácetico al 5% por 1 min, la mezcla se centrifugó 15 min a 2400 x g y se decantó el sobrenadante. La extracción se repitió dos veces y el volumen de los tres sobrenadantes se transfirió a embudos para alcalinizar con 0.8 mL de Na0H 10 M. Los alcaloides se extrajeron con diclorometano (3X15 mL). Los extractos crudos se concentraron en un rotavapor a 40 °C hasta sequedad. El residuo se disolvió en 1 mL de metanol y se paso por filtros Millipore de 0.45 µm.Cromatografía de gases capilar–espectrometría de masas
Después de filtrar, 0.5 mL del extracto se mezclaron con 0.5 mL de metanol y se inyectó 1 µL de muestra a un cromatógrafo de gases capilar Perkin–Elmer Autosystem 1XL con columna capilar SPB–1 (30 mX0.25 mm d.i.), acoplado a un espectrómetro de masas (Perkin–Elmer Turbomass Gold). El gas acarreador fue He con un flujo de 1 mL min–1; las temperaturas del inyector y del detector fueron 240 y 300 °C. El programa de temperatura fue 180 °C 2 min, isotérmica, 180–300 °C a 5 °C min, 300 °C 10 min, isotérmica. La abundancia relativa de alcaloides se calculó considerando las áreas de los picos del cromatograma, mientras que para identificar los alcaloides se compararon los espectros de masas obtenidos con los de la biblioteca del software y con los reportados por Meibner y Wink (1991).
Obtención del extracto crudo de alcaloides para los bioensayos
Se pesaron 100 g de harina desengrasada y se homogeneizaron con 400 mL de ácido tricloroacético al 5% en agitación constante por 12 h; la mezcla se centrifugó 15 min a 2400 x g. El sobrenadante se alcalinizó con 10 mL de hidróxido de sodio 10 M en un embudo de separación, los alcaloides se extrajeron con diclorometano (3X50 mL), se recuperó la fase orgánica y se llevó a sequedad a 40 °C con rotavapor. El extracto se resuspendió en metanol, se transfirió a frascos ámbar, se evaporó el solvente y se almacenó a 4 °C hasta su utilización en los bioensayos.
Bioensayos
La actividad antifúgica in vitro del extracto se evaluó con base en su capacidad de inhibición del crecimiento micelial de los hongos fitopatógenos Sclerotium rolfsii Sacc, y Rhizoctonia solani Kühn (cepas proporcionadas por El Instituto de Fitosanidad del Colegio de Postgraduados) y Fusarium oxysporum Schlechtend aislado de plantas de Agave tequilana Weber en Zapopan, Jalisco. El extracto de alcaloides disuelto en agua destilada se adicionó a 100 mL de medio de cultivo agar papa dextrosa a concentraciones de 0, 1, 2, 3, 4 y 5 mg mL–1. El medio se esterilizó 15 min en autoclave a 1.05 kg cm–2 de presión y se transfirió a cajas Petri (8.5 cm diámetro). Las cajas se inocularon con discos de micelio (0.5 cm diámetro) y se incubaron en la oscuridad a 25 °C. Cuando el micelio del hongo cubrió la superficie del medio en el testigo se retiraron todas las cajas de la estufa y se midió el diámetro del micelio. El porcentaje de inhibición se calculó con la siguiente ecuación: I = [(C – T) / C ] * 100, donde I es la inhibición (%), C es el diámetro del micelio en la caja Petri del testigo (0 mg mL–1), y T es el diámetro del micelio en la caja del tratamiento (1, 2, 3, 4 y 5 mg mL–1).
Para evaluar la actividad alelopática del extracto se usaron semillas de Amaranthus hibrydus y Echinochloa crus galli, consideradas como malezas en el valle de México (Espinosa y Sarukhán, 1998). Estas se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 5% y se lavaron con agua destilada. Para evaluar el efecto del extracto alcaloideo sobre la germinación de las semillas se prepararon soluciones de extracto en agua destilada en concentraciones de 0.25, 0.50, 0.75 y 1.0 mg mL–1. Se colocaron 40 semillas en cajas Petri sobre papel filtro (Whatman Núm. 1), se adicionaron 4 mL de cada concentración, así como 4 mL de agua destilada en el tratamiento testigo (0 ppm). Las cajas (5 por tratamiento) se incubaron 72 h en la oscuridad a 25 °C y después se registraron las semillas germinadas para cada tratamiento.
Análisis estadístico
El diseño experimental fue completamente al azar con cinco repeticiones por tratamiento y las variables fueron: crecimiento micelial, y germinación de semillas. Se hizo un análisis de varianza y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p<0.05).
]]>RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Análisis de alcaloides
En el Cuadro 1 se muestra el patrón de fragmentación de los alcaloides mayoritarios en el extracto de L. mexicanus, los cuales se identificaron al comparar los espectros de masas obtenidos con los espectros de la base de datos del programa y los existentes en la bibliografía (Meibner y Wink, 1991). También se identificaron algunos alcaloides minoritarios: 11,12–dehidrolupanina, 17–oxolupanina, amodendrina y 11,12–dehidro–oxoesparteína. La lupanina y 3β–hidroxilupanina fueron los principales alcaloides en el extracto (21.2 y 2.6 mg g–1): el primero contribuyó con 76.2% y el segundo con 9.4% del contenido total, mientras que los alcaloides minoritarios representaron 4.5% (Cuadro 2). Según Przybylak et al. (2005), la lupanina es el alcaloide mayoritario en semillas de L. rotundiflorus y L. exaltatus de México, con 62.2 y 47.3%, pero estos valores son inferiores a los determinados en el presente estudio con L. mexicanus (76.2%).
En otras especies silvestres de México, L. hintonii y L. campestris, los alcaloides mayoritarios son 13α–hidroxilupanina e hidroxiafilidina (Bermúdez et al., 2002; Martínez et al., 2001). Estas variaciones en el perfil y composición de alcaloides en las semillas de las diferentes especies del género Lupinus se han relacionado con la especie, lugar y fecha de recolecta.
Actividad antifúngica
Hubo diferencias significativas (p<0.05) en el crecimiento promedio del micelio de S. rolfsii y R. solani por efecto del extracto. Las concentraciones más bajas del extracto no mostraron efectos importantes sobre el crecimiento del micelio con respecto al testigo; sin embargo, al aumentar las concentraciones hubo una se redujo el crecimiento micelial con una respuesta de susceptibilidad diferente en relación con el patógeno. Así, al aumentar las concentraciones de extracto el crecimiento del micelio de R. solani la inhibición promedio fue 81.6, 87.7 y 100% con 3, 4 y 5 mg mL–1 (Cuadro 3). Este comportamiento fue similar en S. rolfsii, pero la inhibición del crecimiento del micelio fue inferior al aplicar las mismas concentraciones del extracto: con 3, 4 y 5 mg mL–1 el crecimiento del micelio sólo se inhibió 31, 35 y 72.5%. Esto indica que S. rolfsii fue menos susceptible que R. solani al extracto alcaloideo de L. mexicanus.
El crecimiento micelial de F. oxisporum no fue diferente (p>0.05) entre tratamientos, es decir, las concentraciones del extracto no inhibieron el crecimiento de este hongo. La resistencia de F. oxysporum a los alcaloides de L. mexicanus se ha reportado al usar extractos de L. montanus y L. rotundiflorus (Bernal, 20043; Zamora et al., 2002); además, no se inhibió el crecimiento micelial de F. moniliforme al incorporar al medio de cultivo semillas molidas de L. campestris y L. mutabilis (Bravo et al., 2000).
]]> Sas–Piotrowska et al. (1996) reportaron porcentajes de inhibición menores a los encontrados en el presente estudio contra R. solani y otras especies de hongos al usar diferentes fracciones de un extracto etanólico de L. angustifolius. Las diferencias observadas en otros estudios y los reportados en esta investigación se deben probablemente a la variación en el perfil y concentración de alcaloides en los extractos de semillas de las especies de Lupinus, así como las posibles variaciones en la metodología de extracción. Los resultados son de interés debido a que hay pocas referencias de la actividad fungicida de alcaloides quinolizdínicos de especies mexicanas de Lupinus.Actividad alelopática
Hubo diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05) para la germinación de semillas de A. hybridus, ya que disminuyó hasta 80% la germinación con la concentración más alta de extracto (Cuadro 4). En otro estudio (Zárate et al., 2006) se encontró la misma tendencia al evaluar concentraciones de 0.5, 1, 2, 3, 4 y 5% de un extracto acuoso de hojas de Calia secundiflora, en el cual se detectó la presencia de alcaloides quinolizidínicos, aunque la máxima inhibición de la germinación de A. hybridus fue 27%.
Wink (1983) reportó una inhibición de 100% en semillas de Lactuca sativa al usar un extracto de L. mutabilis a una concentración de 1.98 mg mL–1, la cual fue superior a la concentración máxima usada en este estudio (1 mg mL–1). Las anteriores diferencias en la inhibición de la germinación se deben probablemente a la variación en la composición y concentración de alcaloides quinolizidínicos entre C. secundiflora, L. mutabilis y L. mexicanus. Aunque hay antecedentes de la alta sensibilidad de A. hybridus a la aplicación de diferentes compuestos naturales como ácidos fenólicos y aceites esenciales, éste es el primer reporte de un efecto inhibitorio importante de la germinación de esta especie de maleza, particularmente por el efecto de los alcaloides quinolizidínicos.
Los porcentajes de germinación de las semillas de E. crus galli en el análisis no fueron diferentes (p>0.05) entre las concentraciones de extracto y el testigo. Lo anterior indica que A. hybridus es más sensible a los alcaloides de L. mexicanus que E. crus galli. Esta diferencia de sensibilidad entre especies receptoras de alcaloides quinolizidinicos también fue reportada por Muzquiz et al. (1994) quienes, al evaluar un extracto alcaloideo obtenido de Lupinus hispanicus y L. albus sobre la germinación de Avena sterilis, Lycopersicom sculentum, Triticum aestivum, Chenopodium album, Vicia villosa y Pisum stivum, sólo encontraron efectos inhibitorios de la germinación en A. sterilis.
CONCLUSIONES
La lupanina fue el alcaloide más abundante en las semillas de L. mexicanus. Con la concentración más alta de extracto (5 mg mL–1) el crecimiento micelial de R. solani se inhibió completamente (100%), mientras que el micelio de S. rolfsii a la misma concentración mostró una inhibición de 72.5%. Sólo la germinación de A. hybridus se inhibió significativamente por efecto del extracto.
AGRADECIMIENTOS
]]> A la Secretaría de Educación Superior e Investigación Científica por el financiamiento otorgado mediante el PROMEP/103.5/07/27.
LITERATURA CITADA
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