Self-incompatibility and protandry in naturalized populations of Aloe vera from the Araya Peninsula, Venezuela
José Imery-Buiza y Hernán Cequea-Ruiz
* Laboratorio de Genética Vegetal, Departamento de Biología, Escuela de Ciencias, Universidad de Oriente. Apdo. 245. Cumaná 6101, Venezuela. Correo electrónico: jimery@sucre.udo.edu.ve.
Recibido: 31 marzo 2008. ]]> Aceptado: 12 agosto 2008.
Resumen
Se evaluó la sincronización y compatibilidad de los órganos reproductores de Aloe vera (L.) Burm. f. (Aloaceae), mediante cruzamientos en diferentes estadios florales y analizando la respuesta germinativa del polen en microcultivos de agar-sacarosa con presencia/ausencia del macerado de estigmas y estilos. Las observaciones in vivo indicaron que A. vera no produce frutos luego de polinizaciones intraespecíficas (entre flores de la misma planta o cruzamientos intra e interpoblacionales); sin embargo, el polen de A. saponaria Haw. (= A. maculata Medik.) promovió la formación de frutos y semillas híbridas en los cruces realizados 14 días después de antesis de la flor receptora. La germinación del polen y crecimiento de tubos polínicos in vitro se redujo significativamente en A. vera por efecto del tejido materno; mientras que en A. saponaria no existió diferencia entre medios de cultivo. Este estudio sugiere la existencia de protandría en A. vera con al menos 24 h de desfase entre órganos reproductores, y autoincompatibilidad esporofítica, favorecida por la escasa variabilidad genética entre las poblaciones analizadas.
Palabras clave: Aloe, dicogamia, reproducción, polen.
Abstract
The synchronization and compatibility of the reproductive organs of Aloe vera (L.) Burm. f. (Aloaceae) were evaluated by carrying out crosses at different flowering stages and by analyzing the germination response of pollen in saccharose-agar microcultures with or without macerated stigmas and styles. In vivo observations showed that A. vera does not produce fruits following intraspecific pollination, either between flowers of the same plant or as a result of intra- or interpo-pulational crosses. However, the pollen from A. saponaria Haw. (= A. maculata Medik.) promoted the formation of fruits and hybrid seeds in crosses performed from 1 to 4 days after anthesis in the receptor flower. Pollen germination and in vitro pollen tube growth were significantly reduced in A. vera by the presence of mother tissue, whereas in A. saponaria there were no differences between culture media. This research suggests the existence of protandry in A. vera with at least 24 h of disparity between maturation of reproductive organs, and sporophytic self-incompatibility, the latter being favored by the low genetic variability of the populations under study.
Key words: Aloe, dichogamy, reproduction, pollen.
]]> INTRODUCCIÓN
La liberación temprana del polen con respecto a la receptividad del estigma (protandría) está muy extendida en especies con flores hermafroditas, monoicas y andromonoicas (Bertin & Newman, 1993). Este tipo de dicogamia, en combinación con la autoincompatibilidad, reduce las oportunidades para la autopolinización dentro de flores hermafroditas y han sido consideradas tradicionalmente como mecanismos que evitan los efectos genéticos perjudiciales de la autofertilización (Holtsford & Ellstrand, 1990; Brunet & Eckert, 1998).
La dicogamia es igualmente común en hermafroditas autocompatibles y autoincompatibles, lo cual sugiere que la prevención de la autofertilización no es sólo la explicación para su evolución (Lloyd & Yates, 1982; Bertin, 1993). Una ventaja potencial de la dicogamia incluye la menor interferencia del polen emitido por la flor con respecto al polen externo y el incremento de la cantidad de polen disperso hacia otros individuos (Imbert & Richards, 1993). En consecuencia, si una especie es autocompatible o no, la anulación de la autopolinización puede mejorar el éxito reproductivo de un individuo (Snow & Grove, 1995).
La familia Aloaceae comprende a los géneros Aloe, Gasteria, Haworthia, Lomatophyllum, Chortolirion, Poellnitzia y Astroloba, con aproximadamente 700 especies nativas de África, Madagascar, Arabia e islas del Océano Índico, aprovechadas por su valor ornamental o de uso medicinal (Rowley, 1997; Smith & Steyn, 2004). Al ser cultivadas bajo condiciones de vivero, muchas de estas plantas raramente producen semillas, a menos que existan varias especies adyacentes y se produzcan polinizaciones cruzadas (Riley & Majumdar, 1967). Obviamente, estas especies con flores hermafroditas deben presentar mecanismos que regulen la compatibilidad y sincronía en las funciones reproductivas que aún no han sido extensamente estudiadas.
La primera referencia de autoincompatibilidad en el género Aloe fue propuesta por Berger (1908), el cual indicó que A. arthiopica, A. pluridens, A. caesia y otras especies fallaron en producir semillas después de la autopolinización. Una evaluación más extensa dentro de la familia Aloaceae fue registrada por Marshak (1934), quien encontró que algunas especies del género Gasteria, entre ellas, G. brevifolia, G. nigricans, G. planifolia, G. pulchra y G. verrucosa, fueron autoincompatibles; mientras que otras como G. lingua, G. disticha y G. sulcata, resultaron autocompatibles. Sin embargo, al realizar cruzamientos entre ambas clases de plantas, todas las combinaciones fueron compatibles, generándose frutos de mayor tamaño y mayor cantidad de semillas que los obtenidos de especies autocompatibles. Brewbaker & Gorrez (1967) confirmaron la autoincompatibilidad de las especies G. verrucosa y G. picta, observando la ausencia de frutos luego de practicar 3100 autopolinizaciones manuales. No obstante, de los cruces recíprocos entre estas especies se generaron híbridos vegetativamente viables, pero que al igual que sus parentales, no formaron frutos luego de la autopolinización.
En cuanto a la existencia de dicogamia, Newton (2004), refiere que la mayoría de las especies del género Aloe son protándricas. Esta generalización es basada en observaciones realizadas en poblaciones naturales del continente africano y en plantas conservadas bajo condiciones controladas dentro de jardines botánicos en el viejo mundo. En Venezuela, los trabajos de Imery & Cequea (2002), Albornoz & Imery (2003) e Imery (2007a), mencionan la posibilidad de que exista esta misma condición reproductiva en poblaciones de A. vera, naturalizadas a lo largo de la península de Araya, sin poder precisar el grado de asincronía entre órganos florales.
En la presente investigación se planteó analizar la autoincompatibilidad esporofítica y la separación temporal entre la liberación del polen y receptividad efectiva de los estigmas en flores de A. vera, a fin de dilucidar su influencia sobre la formación de frutos y semillas, y de esta manera, contribuir también al conocimiento de algunos aspectos de biología reproductiva, necesarios para la planificación de cruzamientos en programas de mejora genética de rasgos agronómicamente importantes, o para la obtención de híbridos de interés ornamental.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material vegetal y sitio de estudio
]]> El estudio se realizó en plantas de A. vera cultivadas en el vivero del Departamento de Biología de la Universidad de Oriente en Cumaná, Venezuela, las cuales provenían originalmente de ocho poblaciones naturalizadas a lo largo de la península de Araya, entre 10° 33' 44'' N, 64° 14' 12'' O y 10° 35' 34'' N, 64° 02' 26'' O (Albornoz & Imery, 2003). Las plantas de A. saponaria fueron adquiridas comercialmente en viveros locales. Ambas especies fueron identificadas por el primer autor, tomando en cuenta las descripciones morfotaxonómicas de Jacobsen (1955); Carter (1994); Van-Wyk & Smith (1996). Todos los especímenes utilizados se conservan actualmente en la colección de plantas suculentas (UDO-Biología), bajo los registros 104/2S (A. saponaria) y 129/2V (A. vera). Una muestra de cada especie fue depositada en el herbario Isidro Ramón Bermúdez Romero (IRBR) de la Universidad de Oriente.
Estadios de floración y cruzamientos
Entre los meses de noviembre de 2005 a marzo de 2006, se seleccionaron cinco plantas por cada población de A. vera, que presentaran inflorescencias próximas a iniciar la floración. En ese mismo periodo y progresivamente con la apertura de las flores en las inflorescencias receptoras, se practicaron polinizaciones dirigidas, empleando polen: 1) de flores de la misma planta, 2) de plantas de la misma población, 3) de plantas de las otras siete poblaciones, y 4) de diez plantas de A. saponaria. Se utilizaron al menos 40 flores receptoras, identificadas para cada tipo de polinización (autopolinización y polinización cruzada intra e interespecífica). Todos los cruzamientos se ejecutaron entre las 7:00 y 8:30 a.m., mediante frote manual de las anteras donadoras sobre estigmas a diferentes tiempos con relación a la antesis de la flor receptora (estadios florales). Adicionalmente, se practicaron cruzamientos recíprocos con polen de A. vera sobre estigmas de A. saponaria y autopolinizaciones controladas entre plantas de A. saponaria. Se utilizaron sólo las anteras maduras que experimentaron la dehiscencia posterior a la colecta (6:00 a.m.) y bajo condiciones de confinamiento en frasco de vidrio estéril. Todas las flores receptoras fueron emasculadas y protegidas con cilindros plásticos sellados con calor en uno de sus extremos. Los estadios florales se identificaron como: - 2d (dos días antes de la antesis), -1d (un día antes de la antesis), 0d (antesis) y 1d, 2d, 3d, 4d y 5d (días después de antesis). En esta investigación la antesis fue definida como el momento en el cual el perianto se abre y expone las anteras. Debido a la coincidencia entre la liberación del polen (dehiscencia de la antera) y la apertura natural del perianto, los cruzamientos antes de la antesis (- 2d y - 1d), se practicaron luego de un corte apical de los tépalos, sin alterar el resto de los verticilos florales. La identificación floral y el registro cronológico de la liberación del polen en la flor receptora permitieron confirmar la precisión de los cruces antes y después de la antesis. Para evitar polinizaciones no controladas durante el periodo de cruzamientos, se protegieron las inflorescencias con bolsas de malla plástica (Ø = 100 µm), aseguradas en la base de cada racimo. A partir de los frutos formados se determinó la eficiencia de los cruzamientos (% eficiencia = número de frutos formados/ número de flores polinizadas*100). Durante esta etapa experimental se registraron valores mínimos y máximos de temperatura y humedad relativa de 21.8 a 30.9 °C y 51.2 a 83.7%, respectivamente.
Germinación de polen in vitro
El polen recién colectado de ambas especies se cultivó individualmente sobre portaobjetos horadados con medios de cultivo a base de agar-agar (4 g y sacarosa (0.06 mol. 1-1) como control (Conger, 1953) (medio A), y en agar-agar (8 g y sacarosa (0.12 mol mezclados en proporción 1:1 con un preparado de estigmas y estilos de A. vera provenientes de flores protegidas (de las mismas plantas donadoras del polen) y con dos días de antesis. Estos tejidos fueron macerados en tubos eppendorf con varillas de vidrio estériles, filtrados con gasa y mezclados con el medio de cultivo antes de su gelificación (medio B). Al final, la concentración de agar y sacarosa de ambos medios (A y B), resultaron similares. La germinación del polen y el tamaño de los tubos polínicos se evaluaron a los 60 min de cultivo in vitro en 20 campos microscópicos (100X) sobre 10 láminas para cada especie y medio de cultivo. Un grano de polen se consideraba como germinado cuando su eje longitudinal resultaba menor o igual a la longitud del tubo polínico emitido (Kalinganire et al., 2000). El recuento de granos de polen germinados (GPG) y no germinados (GPNG) se utilizó para calcular el porcentaje de germinación en cada campo de observación (%G = GPG/(GPG+GPNG)*100). La longitud del tubo polínico se determinó mediante sistema computarizado "SigmaScan Pro 5" a partir de fotomicrografías digitales tomadas con cámara Canon ES870 acoplada a un microscopio de luz Bausch & Lomb PBV-4B.
Los resultados in vivo se analizaron a partir de media aritmética y desviación estándar con N variables. La comparación estadística entre medios de cultivo se realizó mediante la prueba de t de student (p < 0.05) con N = 200 (Sokal & Rohlf, 1979).
RESULTADOS
]]> Al emplear el polen de A. saponaria se observó la formación de frutos y semillas en aquellas flores de A. vera que habían liberado sus granos de polen entre uno a cuatro días antes del cruce (tabla 1). Los frutos generados de estos cruzamientos interespecíficos presentaron forma de cápsulas subglobulares y membranosas, con semillas aladas dispuestas en dos hileras longitudinales dentro de cada uno de los tres lóculos del fruto (Fig. 1).
El mayor número de semillas híbridas y tamaño de los frutos se desarrollaron a partir de cruzamientos realizados con polen de A. saponaria después de dos días de la dehiscencia en las anteras de la flor receptora de A. vera (tabla 1). En los cruces recíprocos, la formación de frutos y semillas híbridas resultó considerablemente baja, con una eficiencia de 5.85% y 3.2 ± 1.1 semillas/ fruto, aún después de la ejecución de 205 cruzamientos con polen de A. vera sobre estigmas de A. saponaria. La mayoría de las autopolinizaciones artificiales entre plantas de A. saponaria produjeron frutos y semillas con características similares a las observadas en condiciones naturales (cápsulas de 2.4 ± 0.3 cm de longitud y 17.6 ± 4.5 semillas/fruto). Las polinizaciones artificiales restantes, incluyendo las autopolinizaciones y las polinizaciones cruzadas intra e interpoblacionales entre plantas de A. vera, no presentaron indicios de formación de frutos. Este mismo resultado se observó en todas aquellas plantas de A. vera (45 plantas de cada población) que no formaron parte de los grupos seleccionados para las polinizaciones manuales y que fueron dejadas bajo polinización abierta entre individuos de la misma especie.
El extracto materno de A. vera en los cultivos in vitro, redujo significativamente (p < 0.05) la germinación de sus granos de polen y el crecimiento de los tubos polínicos. No obstante, la presencia del macerado de estigmas y estilos de A. vera, no mostró efectos significativos sobre el porcentaje de germinación y longitud de los tubos polínicos en los granos de polen de A. saponaria (tabla 2).
]]> DISCUSIÓN
Algunos estudios de fenología reproductiva en especies de Aloe nativas de Sudáfrica (Reynolds, 1950; Nicolson & Nepi, 2005), África tropical y Madagascar (Reynolds, 1966), África Oriental (Newton, 2004) e Isla Mayotte (Pailler et al., 2002), indican que este grupo de plantas manifiestan una reiterada tendencia a florecer durante la temporada seca y presentan flores protándricas y autoincompatibles, entre las cuales ocurre principalmente polinización cruzada ornitofílica. Las plantas de A. vera estudiadas en este trabajo, bajo las condiciones ambientales del oriente venezolano, florecieron también en un periodo bastante marcado de la estación seca, entre los meses de noviembre a marzo, pero sólo formaron frutos y semillas al ser fertilizadas por el polen de A. saponaria.
Carter (1994), menciona que las poblaciones naturales de A. vera, localizadas en la zona noroccidental de África y la península arábiga, forman cápsulas dehiscentes con semillas aladas típicas de los aloes; sin embargo, en las poblaciones naturalizadas de la península de Araya y otras regiones costeras del estado Sucre (Venezuela), no se ha observado hasta el momento ningún fruto, luego de la floración de miles de plantas que han sido visitadas frecuentemente por numerosos vectores, tales como colibríes (Leucippus fallax y Amazilia to-baci), abejas (Apis mellifera y Trigona sp.) y avispas (Poliste sp., Eumenes sp. y Vespa sp.) que transportan el polen entre plantas de A. vera y lo depositan efectivamente sobre sus estigmas. Es claro entonces que las diferencias de latitud y condiciones edafoclimáticas entre las regiones de estudio deben incidir de alguna manera sobre las fenofases reproductivas de estas plantas, e incluso, interaccionar con condiciones fisiológicas (Jonas & Geber, 1999; Lobello et al., 2000), desarrollo floral (Bradshaw et al. , 1997), viabilidad y longevidad del polen (Fuss & Sedgley, 1991; Tangmitcharoen & Owens, 1997; Hong et al, 1999; Johnson & Edwards, 2000) o receptividad del pistilo (Nepi & Pacini, 1993), que afectan la formación de frutos y semillas viables. No obstante, considerando que las plantas estudiadas en el viejo mundo están localizadas en el centro de origen primario de esa especie (Carter, 1994; Van-Wyk & Smith, 1996; Newton, 2004), es posible que su éxito reproductivo esté influenciado también por una mayor diversidad genética dentro de sus poblaciones.
En América y algunas otras regiones del mundo donde se introdujeron plantas de A. vera, su propagación es exclusivamente vegetativa (Keijzer & Cresti, 1987; Natali et al, 1990), originándose poblaciones clonales con muy poca o ninguna variabilidad genética (Imery & Cequea, 2002; Albornoz & Imery, 2003). Esta condición puede ser una de las razones fundamentales para que sólo se produzcan frutos con semillas, a partir de cruzamientos interespecíficos como los practicados aquí con A. saponaria.
Las diferencias observadas en la formación de frutos y semillas luego de las autopolinizaciones artificiales en ambas especies, permiten sugerir a primera vista que A. saponaria es autocompatible; mientras que A. vera es autoincompatible. Todas las polinizaciones intraespecíficas realizadas manualmente en A. vera, resultaron infructuosas, incluso en aquellos periodos de mayor receptividad de los estigmas (dos a tres días después de la antesis). Estos indicios experimentales de autoincompatibilidad, fueron corroborados al observar la inhibición de la germinación del polen y crecimiento del tubo polínico en los medios de cultivo con los macerados de estigmas y estilos provenientes de flores de la misma especie. Más aún, la presencia de estos tejidos en el medio de cultivo resultó inocua sobre la germinación de los granos de polen de A. saponaria, sugiriendo una vez más, que lo observado en A. vera debe estar sujeto a la existencia de un mecanismo de autoincompatibilidad que actúe posiblemente en la interacción genética polenpistilo (Shiba et al, 2001; Hiscock & kües, 1999; Chookajorn et al., 2003; Tsukamoto et al., 2003) o en las proteínas movilizadas sobre el estigma durante la hidratación del polen (Snowman et al., 2002; Hiscock, 2002) y elongación de la pared del tubo polínico (Li & Linskens, 1983; Geitmann et al., 2000), limitando así, la respuesta germinativa del polen en presencia de tejido materno.
La protandría y autoincompatibilidad son mecanismos vegetales muy eficientes para prevenir la autopolinización mediante el desfase entre órganos reproductores y el efecto de inhibición ejercido sobre la germinación del polen o la unión entre gametos producidos por el mismo individuo o grupos de individuos genéticamente similares (Montaner et al., 2000). En la mayoría de las angiospermas, y seguramente en aquellas plantas pertenecientes a la familia Aloaceae, el control genético de la autoincompatibilidad es ejercido por un sistema de alelos múltiples S1, S2, S3, S4, etc., en el que un sólo locus polimórfico (S) regula esta reacción, dependiendo de la similitud alélica entre genomas haploides (autoincompatibilidad gametofítica) o entre genomas parentales (autoincompatibilidad esporofítica) (Nagylaki, 1970; Hiscock & kües, 1999). Estas estrategias reproductivas reducen los efectos perjudiciales de la endogamia y promueven las oportunidades para que se produzcan numerosas combinaciones genéticas que incrementan la diversidad (Brunet, 1996; Jonas & Gerber, 1999; Ortega et al., 2000; Runions & Geber, 2000).
La dicogamia puede también prevenir la autopolinización dentro de las flores, pero esto raramente evita la polinización entre flores hermafroditas que se presentan simultáneamente en la misma planta (McDade, 1986; Barrett et al., 1994; Back et al.,, 1996). Esto ocasiona que en plantas como A. vera, en las cuales existe geitonogamia interfloral, debido a sus inflorescencias indeterminadas en forma de racimos, la dicogamia actúe de manera combinada con otras barreras biológicas que reducen las posibilidades de autofecundación. En este sentido, los resultados de la presente investigación revelan que las plantas de A. vera, no sólo liberan sus granos de polen a intervalos diferentes con respecto a la receptividad de sus estigmas (al menos un día de diferencia), sino que probablemente presentan también un sistema de autoincompatibilidad esporofítica que regula la germinación del polen y el crecimiento del tubo polínico dentro del pistilo.
Además de las barreras reproductivas determinadas en este trabajo, existen anormalidades citogenéticas que afectan la microsporogénesis de A. vera y reducen la fertilidad de sus granos de polen en más de 50% (Sapre, 1975; Imery & Cequea, 2002; Imery, 2007b). Es posible que esta disminución de la fertilidad del polen, como consecuencia de la acumulación de mutaciones que actúan como carga genética mantenida por la propagación asexual, sea la responsable de la menor formación de frutos y semillas híbridas en los cruces recíprocos en los que se empleó polen de A. vera. La combinación de todos estos fenómenos biológicos restringe las expectativas de reproducción sexual de A. vera en poblaciones aisladas, que se originaron mediante propagación vegetativa a partir de uno o pocos individuos fundadores que se introdujeron al Caribe y América del Sur durante el intercambio de especies realizada por los españoles entre los siglos XVI y XVII.
AGRADECIMIENTOS
]]> Los autores agradecen las contribuciones de William Lampe y Carlos Velásquez y el financiamiento otorgado por el Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente a través del proyecto CI-5-010101-1223/05.
LITERATURA CITADA
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