Evaluation of antifungal activity of chitosan in Alternaria alternata and in the quality of 'Tommy Atkins'mango during storage

Laura Ibeth López-Mora¹; Porfirio Gutiérrez-Martínez^1*; Silvia Bautista-Baños²; Luis Felipe Jiménez-García³; Hilda Araceli Zavaleta-Mancera⁴

¹Instituto Tecnológico de Tepic, LIIA-Lab. de Biotecnología. Av. Tecnológico # 2595, Lagos de Country. Tepic, Nayarit, MÉXICO. C. P. 63175.Correo-e: gutierrez1960@prodigy.net.mx (*Autor para correspondencia)

²Instituto Politécnico Nacional, Centro de Desarrollo de Productos Bióticos. Carretera Yautepec-Jojutla km 6. San Isidro, Yautepec, Morelos, MÉXICO. C. P. 62731.

³Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Celular. Circuito Exterior, Ciudad Universitaria, Coyoacán, Distrito Federal, MÉXICO. C. P. 04510.

Recibido: 12 de julio, 2012
Aceptado: 11 de octubre, 2013

Resumen

Esta investigación tuvo los siguientes objetivos: a) determinar la mejor concentración de quitosano que reduzca el desarrollo de Alternaria alternata en relación a su crecimiento micelial, germinación y esporulación, b) observar a través de las microscopías de barrido y transmisión el efecto del quitosano a nivel morfológico y celular, y c) evaluar la efectividad de este compuesto en el control de A. alternata en frutos de mango cv. 'Tommy Atkins' y su efecto sobre la maduración del fruto durante su almacenamiento. Los resultados demostraron que la concentración de quitosano más efectiva fue 1.0 %, ya que redujo el crecimiento micelial y la esporulación hasta 70 % e inhibió completamente la germinación de sus conidios. En las micrografías de transmisión se observó una intensa y amplia vacuolización a lo largo del micelio y conidios, salida del material citoplásmico y presencia de material fibrilar. No hubo efecto fungicida del quitosano cuando se aplicó directamente en los frutos de mango, aunque sí redujo la extensión de la enfermedad más de 50 %. La maduración de los frutos tratados fue muy similar a aquellos del tratamiento control.

Palabras clave: Mangifera indica L.; mancha negra del mango, compuesto natural.

Abstract

Key words: Mangifera indica L.; mango black spot, natural compound.

INTRODUCCIÓN

México es considerado uno de los principales países productores de mango; en el año 2005 ocupó el quinto lugar (Anónimo, 2005). Los estados de Sinaloa, Veracruz, Chiapas, Michoacán, Guerrero, Nayarit y Oaxaca aportan gran parte de la producción nacional (92 %) (Anónimo, 2010). En Nayarit predomina la producción de mango 'Tommy Atkins', considerado como el de mayor mercado mundial.

Pese a los grandes adelantos que se han realizado en los últimos años dentro del campo de la tecnología postcosecha en la producción de mango, se mantiene un alto índice de pérdidas. Si bien es difícil su cuantificación, se calcula que puede alcanzar, dependiendo del país, hasta un 50 %, en el cual tienen un rol muy importante los daños causados por microorganismos, especialmente por hongos (Bautista-Baños et al.., 1998).

La susceptibilidad de los frutos de mango a las enfermedades se incrementa después de la cosecha y durante el periodo de almacenamiento, debido a los cambios fisiológicos ocurridos bajo estas condiciones, que facilitan el desarrollo de los patógenos. Las condiciones climáticas del estado de Nayarit (alta humedad relativa y altas temperaturas) favorecen el desarrollo de patógenos, lo que causa pérdidas considerables. Alternaria alternata es uno de los principales hongos fitopatógenos que afectan a los frutos de mango en el estado de Nayarit.

Alternaria alternata es un hongo que puede ser encontrado en muchos tipos de plantas, frutos y otros sustratos, incluyendo alimentos, aceites y textiles (Simmons, 1992). La enfermedad causada por A. alternata en los frutos de mango se nombra mancha negra del fruto y se caracteriza por depresiones, de ovales a circulares, y lesiones que eventualmente llegan a tornarse de color negro (como resultado de la esporulación masiva del patógeno). La pulpa se oscurece y ablanda a medida que las manchas penetran. El control de la mancha negra del fruto de exportación se realiza principalmente con la aplicación precosecha de fungicidas (Ploetz et al.., 1998) y se refuerza durante el manejo postcosecha con hidrotratamientos y la aplicación del fungicida procloraz (N-propil-N-[2-(2,4,6-tricloro fenoxi) etil]imidazol-1-carboxamida).

El uso del quitosano en la protección de frutos ha sido estudiado durante más de 15 años. Se resaltan sus propiedades fungicidas y bactericidas, su capacidad para formar películas y su baja toxicidad para el ser humano. Sin embargo, ha sido una alternativa poco explorada en el control de A. alternata en frutos de mango.

El quitosano es un polímero biodegradable, no tóxico, bioactivo, que ha demostrado efectos fungicidas e induce mecanismos de defensa en tejidos vegetales (Wilson et al., 1994; Terry & Joyce, 2004). Es considerado uno de los productos más prometedores para el control de varios hongos en postcosecha, como lo demuestran los trabajos de Ghaouth et al.. (1992a, 1992b), Reddy et al.. (1998), Ben-Shalom et al.. (2003) y Bautista-Baños et al.. (2003). El crecimiento de diversos hongos postcosecha como A. alternata, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Rhizopus stolonifer y Penicillium spp se inhibió en medio nutritivo usando diferentes concentraciones de quitosano. Al estudiar su efecto sobre los hongos F. oxysporum, P. digitatum y R. stolonifer, Bautista-Baños et al.. (2004) concluyeron que éste afectó varios estados de desarrollo de dichos hongos, al inhibir el crecimiento micelial y la esporulación. En otros estudios, el hongo A. alternata aislado de jitomate se inhibió con una concentración de quitosano al 2.5 % (Sánchez-Domínguez et al.., 2007).

El presente trabajo tuvo como primer objetivo obtener la concentración de quitosano adecuada para inhibir el crecimiento micelial, germinación y esporulación de A. alternata aislado de frutos de mango. Como segundo objetivo se observaron las posibles alteraciones a nivel morfológico y celular por efecto de la aplicación de este compuesto y como tercer objetivo se evaluó su efecto fungicida sobre el desarrollo de la enfermedad en mango 'Tommy Atkins' y su influencia sobre algunas propiedades físico-químicas asociadas con la calidad del fruto después de un periodo de almacenamiento de 12 días.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento del hongo

La cepa del hongo A. alternata que se utilizó en el trabajo se aisló de frutos de mango 'Tommy Atkins' y se almacenó a 2 °C en el cepario del Instituto Tecnológico de Tepic. Posteriormente se activó en papa dextrosa agar (PDA) y en frutos de mango de esta variedad.

Preparación del quitosano y siembra de A. alternata en las cajas Petri

La preparación de las diferentes concentraciones de quitosano (Q) se llevó a cabo siguiendo la metodología de Ghaouth et al.. (1991b). Se elaboró una solución stock de 1.0 g de quitosano bajo peso molecular (Mw = 1.74×10⁴ Da, 75 – 85 % grado de desacetilación; FW = 161 20,000 cps) (Sigma-Aldrich), la cual se disolvió en 100 ml de agua destilada con 2 ml de ácido acético y agitación constante por 24 h a temperatura ambiente. Se hicieron las diluciones necesarias para ajustar las concentraciones a 0.05, 0.1, 0.5 y 1 %. Las soluciones se ajustaron a pH 5.5 con una solución de NaOH al 1N. Se añadió 0.1 ml de Tween 80. Posteriormente, el quitosano y el PDA se esterilizaron en forma separada para después vaciarse en cajas Petri de 85 mm de diámetro. La inoculación de A. alternata se realizó en el centro de las cajas Petri tomando pequeños círculos de aproximadamente 5 mm de diámetro de PDA que contenía el hongo de aproximadamente ocho días de desarrollo. Para los tratamientos testigo o control se utilizaron cajas Petri únicamente con PDA. Para cada tratamiento (concentración) y el control se hicieron cinco repeticiones. Las cajas se incubaron a 25 ± 1 °C durante 12 días.

Variables evaluadas in vitro

Crecimiento e inhibición micelial

Esporulación

Para determinar la esporulación final se utilizaron las mismas cajas Petri donde se midió el crecimiento micelial. A cuatro cajas Petri por tratamiento se les agregaron 10 ml de agua estéril. Con una varilla de vidrio estéril se raspó la superficie de la caja, y posteriormente se filtró la solución resultante dos veces a través de una gasa estéril, para eliminar el micelio presente. Se tomaron 50 µl de la solución filtrada, se colocaron en un hemacitómetro y se midió la concentración final de esporas. Se llevaron a cabo 100 observaciones por tratamiento en un microscopio óptico Nikon Eclipse E600.

Germinación

Para la evaluación de la germinación de las esporas se tomaron alícuotas de 50 µl de una suspensión conidial de esporas provenientes de cultivos de A. alternata sin tratar de ocho días de desarrollo. La concentración utilizada fue 10⁶·ml^-1, la cual se pipeteó sobre tres discos por tratamiento con medio PDA que contenía las diferentes concentraciones de quitosano arriba mencionadas y el control. Los discos se observaron al microscopio óptico (Nikon Eclipse E600) cada hora durante ocho h. La germinación se detuvo agregando una gota de lactofenol-safranina. Los valores se expresaron en número de esporas por ml.

Procesamiento de las muestras para observaciones en microscopía electrónica de barrido (MEB) y de transmisión (MET)

Para las observaciones en ambas microscopías se utilizaron cultivos de A. alternata de 12 días de desarrollo provenientes de los tratamientos con la concentración de quitosano al 1 % y el control.

MEB

Las muestras de A. alternata se fijaron en soluciones de glutaraldehído al 2.5 %, las cuales se colocaron en vacío para eliminar cualquier burbuja de aire presente en las muestras. Se lavaron con buffer de fostato sorensen (pH 7.1 1 M) tres veces por 20 min. Se realizaron lavados con etanol a concentraciones graduales (30, 40, 50, 60, 70, 80 y 90 %) por 50 min cada uno y al 100 % tres veces por 20 min. Las muestras se secaron en presencia de CO₂ por 40 min (Sandri-780A), se montaron en portamuestras de platón y se recubrieron con oro en una ionizadora de metales (Ion Sputter JFC-1100, Jeol, Fine Coat) por 15 min. Se observaron en un microscopio electrónico de barrido (JEOL- JSM 6390) operando a 10 Kv.

MET

Pruebas in vivo

Material vegetal

Los frutos de mangos 'Tommy Atkins' se recolectaron de una huerta localizada en el poblado de Atonalisco, Tepic, Nayarit, en estado de madurez de consumo (coloración del fruto verde oscuro). Los frutos fueron desinfectados con una solución al 2 % de hipoclorito de sodio y agua estéril durante un minuto para eliminar impurezas y se dejaron secar a temperatura ambiente.

Inoculación de A. alternata en los frutos de mango

Se procedió a inocular los frutos cosechados mediante un sistema de herida de 1 cm de profundidad realizada con un punzón estéril. Se colocaron en la herida en ambas caras del fruto 150 µl de la suspensión de esporas de una concentración de 10⁶. Los mangos se dejaron al aire libre durante 24 h antes de llevar a cabo la aplicación de los tratamientos con quitosano.

Tratamiento de los frutos con quitosano

Se preparó una solución de quitosano al 1 % siguiendo la metodología antes descrita, cuya concentración fue el mejor tratamiento en las pruebas in vitro. Esta solución se aplicó por inmersión de los frutos de mango por 40 seg. Después se dejaron al aire libre por cinco horas y se almacenaron a 12 ± 1 °C y 25 ± 1 °C por 15 días. Para las evaluaciones fitopatológicas, la unidad experimental consistió en 25 frutos por tratamiento con cuatro repeticiones. Las evaluaciones fisicoquímicas se realizaron en cinco frutos por tratamiento con cuatro repeticiones. El experimento se repitió en su totalidad dos veces. Los resultados se promediaron.

Variables evaluadas in situ

Evaluación fitopatológica

Diariamente se midió el crecimiento del desarrollo micelial en las heridas artificialmente inoculadas. La severidad se calculó utilizando la ecuación propuesta por Vero y Mondino (1999).

Donde:

DLA = Diámetro promedio de las lesiones de las heridas tratadas

DLC = Diámetro promedio de las lesiones de las heridas control

Evaluaciones fisicoquímicas

Pérdida fisiológica de peso

Cinco frutos por tratamiento se pesaron diariamente en una báscula digital marca Sartorius modelo BL 3100. Los resultados se reportaron en porcentaje de acuerdo a la siguiente ecuación:

Para la determinación de la firmeza se tomaron cinco frutos por tratamiento. Se empleó la prueba de penetración (6 mm) en ambas caras del fruto (tres penetraciones por cara) con un texturómetro universal marca Shimpo modelo FGE-50. Los resultados fueron el promedio de los valores obtenidos y se expresaron en Newtons (N).

Sólidos solubles totales (SST)

En los frutos empleados para evaluar la firmeza se determinaron también los SST con un refractómetro Abbé. Los resultados obtenidos se reportaron en °Brix, con corrección por temperatura para los datos correspondientes a 20 °C.

pH

El pH se determinó con la ayuda de un potenciómetro marca Hanna Instrument pH 300 en los frutos previamente utilizados para evaluar la firmeza y los SST.

Acidez titulable

La acidez titulable se determinó empleando muestras homogenizadas de 5 g provenientes de 10 frutos por tratamiento, las cuales se titularon con NaOH 0.044 N valorado usando fenolftaleína como indicador. Los cálculos se reportaron en % de ácido cítrico aplicando la siguiente ecuación:

Donde:

N = Normalidad de NaOH V = Volumen de NaOH gastados (cm³)

Meq = miliequivalentes de ácido cítrico (0.064)

P = Cantidad de muestra (g)

Para la firmeza, SST, pH y acidez titulable también se obtuvieron valores de ambas caras del fruto, y se calculó un promedio final.

Análisis estadístico

Todos los experimentos se llevaron a cabo bajo un diseño completamente al azar. Se realizó un análisis de varianza y se hicieron pruebas de comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la Figura 1 se muestran los resultados del crecimiento micelial de A. alternata durante los 12 días de incubación a 25 °C. Se observó una relación inversa entre el crecimiento micelial y la concentración de quitosano aplicada. En comparación con el control, todos los tratamientos con quitosano influyeron en el crecimiento de este hongo. El menor crecimiento de A. alternata se registró en la concentración de 1.0 %. En relación a la inhibición micelial, germinación y esporulación se observaron diferencias significativas (P ≤ 0.05) entre los tratamientos de las tres variables analizadas (Cuadro 1). No se determinó inhibición del crecimiento micelial y de la germinación de A. alternata en el tratamiento con PDA solo. Sin embargo, en la concentración de 1.0 % no hubo germinación del hongo, y se registró la menor esporulación (1.4 x 10⁶ esporas·ml^-1) en comparación con los tratamientos restantes y el control.

Se ha mencionado en numerosas investigaciones (Hirano y Nagao, 1989; Song et al.., 2002; Bautista-Baños et al.., 2006), que la respuesta inhibitoria de los hongos y bacterias tratadas con quitosano puede deberse al carácter catiónico de este compuesto (Sandford, 1989). Se indica que la interacción de los grupos amino libres, cargados positivamente en medio ácido, con los residuos negativos de las macromoléculas expuestas en la pared de los hongos, cambian la permeabilidad de la membrana plasmática, con la consecuente alteración de sus principales funciones, como la salida de desechos y entrada de nutrientes (Benhamou, 1992). En recientes estudios realizados por Palma-Guerrero et al.. (2009; 2010), se reportó que el quitosano afecta la permeabilidad de la membrana y su composición en el hongo Neurospora crassa. En otros estudios se demostró que el quitosano influye la salida de potasio, el pH del medio y la actividad de la ATPasa en la membrana celular del hongo R. stolonifer (García-Rincón et al.., 2010).

En las Figuras 2 y 3 se muestran las micrografías realizadas al micelio y conidios de A. alternata tratado con quitosano al 1.0 % y sin él. En general, en las micrografías en MEB no se observaron diferencias en la morfología del micelio y los conidios tratados y no tratados con el quitosano (Figura 2). Sin embargo, en las micrografías en MET se observó en el micelio y conidio tratados con quitosano una intensa y amplia vacuolización a lo largo de estas estructuras (Figura 3). Además, también se observó ruptura de la membrana celular del micelio que origina la salida del material citoplásmico (Figura 3B). Alrededor de la pared celular del micelio y conidios tratados con quitosano se desarrolló material mucilaginoso. Contrario a este efecto, en A. alternata del tratamiento control se observaron algunos organelos bien delimitados como el núcleo y vacuolas (Figura 3D y E), pared y membrana celular.

Sánchez-Domínguez et al. (2011) reportaron alteraciones similares a nivel celular en un aislamiento de A. alternata de jitomate, debidas a la aplicación de quitosano en concentración de 1.5 %. Observaron desintegración de la pared celular, contracción de la membrana citoplásmica y la eventual salida del material citoplásmico. En otros hongos fitopatógenos como Phythium aphanidermatum, R. stolonifer, F. oxysporum f. sp. radicis-lycopercisi y Pochonia chlamidosporia se observaron alteraciones en la pared y membrana celular de estos fitopatógenos y desorganización celular no sólo en micelio sino en los conidios cuando fueron incubados con quitosano en diferentes concentraciones de 100 a 400 µg·ml^-1, 3.0 mg·ml^-1, y 1.0 mg·ml^-1, respectivamente (Ghaouth et al..,1992a; Ghaouth et al.., 1994; Benhamou, 1992; Palma-Guerrero et al.., 2008).

Contrario a lo reportado en otras investigaciones, la aplicación del quitosano en frutos de mango no controló la infección causada por A. alternata (Cuadro 2). La incidencia de la enfermedad fue de 100 % en ambas temperaturas de almacenamiento. Sin embargo, el desarrollo de la enfermedad sobre los frutos tratados con el quitosano al 1 % fue menor (58 %) en comparación con los no tratados y almacenados a 25 °C (90 %) y los frutos del tratamiento control (100 %). Como se ha mencionado anteriormente, similares resultados fueron reportados por Sánchez-Domínguez et al.. (2011), quienes obtuvieron notables efectos fungicidas sobre A. alternata en estudios in vitro, pero ningún efecto sobresaliente cuando el quitosano fue aplicado en jitomates inoculados artificialmente con este fitopatógeno y posteriormente almacenados a temperatura ambiente.

En las Figuras 4 y 5 se muestra el desarrollo de la maduración de los mangos tratados con quitosano y sin este, y posteriormente almacenados a 12 y 25 °C. En relación con la pérdida de peso, se observó que el menor porcentaje (aproximadamente de 3 % al término de 15 días de almacenamiento) correspondió a los frutos tratados con quitosano y almacenados a 12 °C (Figura 4A). Los mangos tratados con quitosano y almacenados a 25 °C tuvieron la mayor pérdida de peso (aproximadamente 16 %) en comparación con los tratamientos restantes. La firmeza de los frutos cayó en un rango de 30 a 10 N en los frutos con quitosano y sin este, respectivamente, independientemente de la temperatura de almacenamiento (Figura 4B). Los valores de °Brix y pH variaron de 14 a 18 %, y de 4 a 5.5 respectivamente (Figuras 5A y B). El contenido de SST más alto correspondió a los frutos provenientes del control, almacenados a 25 °C, en tanto que el pH mayor fue en los frutos tratados con quitosano y almacenados a esta temperatura. En relación con el contenido de ácido cítrico (Figura 5C), el porcentaje mayor (0.8 %) correspondió a los mangos tratados y sin tratar con quitosano cuando se almacenaron a 12 °C.

La respuesta fisiológica de los frutos tratados con quitosano en este trabajo concuerda con investigaciones previas en varios productos hortofrutícolas donde se reporta sobre su acción como una cubierta semipermeable, que regula el intercambio gaseoso y por lo tanto disminuye la transpiración (Bautista-Baños et al.., 2006). En general, en estudios llevados a cabo sobre el efecto de la aplicación de quitosano en frutos como el litchi, el plátano y el pimiento morrón, se observó menor pérdida de peso que en productos no tratados, al ser almacenados a temperaturas menores de los 15 °C (Kittur et al.., 1998; Du et al.., 1997; Ghaouth et al.., 1991b). En relación a las otras variables analizadas, no se encontró un efecto significativo por la aplicación del quitosano, y se observó que durante el almacenamiento los jitomates tratados con quitosano y sin él siguieron una maduración normal (Sánchez-Domínguez et al.., 2011). Sin embargo, distintos autores evidenciaron que la temperatura fue el factor que más influyó en los valores finales de la mayoría de las variables físico-químicas evaluadas (Zhang y Quantick, 1998; Ramos-García et al.., 2010; Zhu et al.., 2008).

El quitosano es un compuesto que presenta características biofuncionales, ya que puede utilizarse también sin problemas para elaborar recubrimientos comestibles, Aunque en esta investigación no se demostró la actividad fungicida del quitosano cuando se aplicó in situ, se considera conveniente experimentar en futuras investigaciones con este compuesto como un recubrimiento comestible adicionado con otros compuestos naturales tales como extractos botánicos y aceites esenciales.

CONCLUSIONES

La incubación de A. alternata en presencia del quitosano al 1 % ocasionó una intensa y amplia vacuolización del micelio y esporas, la salida de material citoplásmico y la formación de material fibrilar alrededor de las células.

El quitosano aplicado en los frutos de mango no controló la mancha negra del fruto pero sí inhibió la extensión de la enfermedad.

El proceso de maduración no se vio afectado por la combinación del quitosano y la temperatura.

La temperatura fue el principal factor que afectó los cambios en el contenido de SST (°Brix), la firmeza y el contenido de ácido cítrico en los frutos de mango.

LITERATURA CITADA

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