Effect of ascorbic acid on growth, photosynthetic pigments and peroxidase activity of chrisantemum plants

Martha Elena Mora-Herrera^1¶; Jezabel Peralta-Velázquez¹; Humberto Antonio López-Delgado²; Rómulo García-Velasco¹, Justino Gerardo González-Díaz¹

¹ Centro Universitario Tenancingo, Universidad Autónoma del Estado de México. km 1.5, Carretera Tenancingo-Villa Guerrero, Estado de México, C.P. 52400, MÉXICO. Tel. 01 714 140 77 24, Ext. 176, FAX. 01 714 140 77 25, Correo-e: marthaelenam@gmail.com (^¶Autor para correspondencia).

² Programa Nacional de Papa, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), Metepec, Estado de México, C. P. 52141. MÉXICO.

Resumen

Los cultivos enfrentan problemas en el manejo agronómico y sufren enfermedades, lo que incrementa los costos y la contaminación ambiental. El ácido ascórbico (AA) es un compuesto antioxidante que induce respuestas relacionadas al crecimiento en las plantas para enfrentar el estrés. Se evaluó el efecto del AA en plantas de crisantemo (Dendranthema grandiflora Tzvelev) cultivar Polaris en condiciones de invernadero. Las plantas se asperjaron dos veces por semana con 0, 3.4 y 6.8 mM de AA a partir de los 30 días de cultivo y hasta la cosecha (100 días de cultivo). El AA incrementó significativamente la longitud del tallo, peso seco, número de botones y tallos por planta con respecto al testigo sin aplicación de AA, siendo el mejor tratamiento la concentración de 6.8 mM de AA el que incrementó la biomasa. Asimismo, el AA incrementó significativamente el contenido de proteína (36 %), pigmentos fotosintéticos totales (75 %) y actividad enzimática de la peroxidasa (33 %), con respecto al testigo, respuestas que se asociaron a los parámetros de crecimiento evaluados.

Palabras clave: Dendranthema grandiflora, crecimiento, contenido de proteína, actividad antioxidante.

Abstract

Crops face problems of agronomic management and diseases, increasing costs and environmental contamination. Ascorbic acid (AA) is an antioxidant compound which induces plant growth-responses to cope with stress. The effect of AA on chrisantemum (Dendranthema grandiflora Tzvelev) cv. Polaris under greenhouse condition was evaluated. Plants were sprayed twice a week with 0, 3.4 and 6.8 mM of AA from 30 days after transplant up to harvest time (100 days after transplant). AA significantly increased shoot length, dry weight, number of floral buds and stems per plant in contrast with control, being 6.8 mM the best treatment which enhanced biomass. AA significantly enhanced protein content (36 %), total photosynthetic pigments (75 %) and peroxidase activity (33 %) respecting the control, these responses were associated to the evaluated growth parameters.

Key words: Dendranthema grandiflora, growth, protein content, antioxidative activity.

INTRODUCCIÓN

En la actualidad, la agricultura es altamente dependiente de insumos y pesticidas sintéticos, los cuales contrarrestan el ataque de plagas y patógenos y coadyuvan a incrementar la producción. Los cambios ambientales, uso de cultivares susceptibles, desgaste de suelos y contaminación obligan a modificar continuamente las prácticas de manejo de los cultivos, lo que incide en un incremento de los costos y aumenta la contaminación ambiental (Vásquez, 2008). Estos problemas han obligado a la búsqueda de alternativas para el manejo integrado de los cultivos como: control biológico, variedades resistentes, plantas transgénicas y abonos orgánicos, entre otras (Zavaleta-Mejía et al., 2003). En algunos cultivos de importancia alimenticia como la papa, se han venido estudiando nuevas opciones para incrementar la producción a través de las respuestas oxidativas y antioxidativas naturales en las plantas, para ser usadas y manipuladas en el manejo integrado de los cultivos (Mora-Herrera y López-Delgado, 2007; Romero-Romero y López-Delgado, 2009).

El estrés aumenta el estado de oxidación de la célula, lo cual induce un incremento en la síntesis de antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos para contrarrestar los efectos de dicha oxidación. Los principales antioxidantes enzimáticos son: peroxidasas (POX), catalasa, superóxido dismutasa y glutatión S-transferasa. Los antioxidantes no enzimáticos más importantes son: ácido ascórbico (AA, vitamina C), α-tocoferol (vitamina E), glutatión y β-carotenos (Scandalios, 2005).

Se ha encontrado que algunos compuestos relacionados con las respuestas oxidativas y antioxidativas originadas por factores de estrés, como el ácido ascórbico, están involucrados en las respuestas de tolerancia a estrés biótico y abiótico y desarrollo óptimo (Shen y Yeh, 2010).

El ácido ascórbico está presente en cloroplastos, citosol, vacuolas y espacio apoplástico. El AA es quizás el antioxidante no enzimático más importante en las plantas, que participa en la defensa contra el estrés oxidativo biótico y abiótico por su función en la degradación del H₂O₂ vía el ciclo del glutatión-ascorbato (Smirnoff, 1996).

El AA participa en muchos procesos fisiológicos tales como: fotosíntesis, cofactor enzimático, homeostasis del sistema redox, como precursor en las rutas de síntesis de moléculas del metabolismo primario y secundario (Smirnoff, 1996) y regulador de POX (Sánchez et al., 1997; Stasolla y Yeung, 2007). Además está involucrado en el crecimiento, desarrollo y modulación del ciclo celular y/o división celular y la elongación celular (De Pinto y De Gara, 2004). Existen evidencias de que el AA aplicado exógenamente en algunos cultivos promueve el crecimiento, lo que lleva a un mejor rendimiento (El-Tohamy et al., 2008); y esto está asociado con un incremento en los pigmentos fotosintéticos como: en canola (Sakr y Arafa, 2009), papa (Romero-Romero y López-Delgado, 2009) y berenjena (Add-ElAziz et al., 2006). Asimismo, se ha reportado que el AA incrementa la resistencia a estrés y reduce el daño contra estrés biótico y abiótico (Shalata y Neumann, 2001; Athar et al., 2008; Romero-Romero y López-Delgado, 2009).

Por otro lado, las POX participan en varias funciones fisiológicas de las plantas tales como: lignificación, entrecruzamiento de polisacáridos de la pared celular, oxidación del ácido indolacético, regulación de la elongación celular y oxidación de fenoles ligados al crecimiento (Yoshida et al., 2003).

En la zona florícola del Estado de México, el cultivo del crisantemo (Dendranthema grandiflora Tzvelev.), especialmente el cultivar Polaris, es importante como flor de corte; se produce principalmente a campo abierto y en túnel (Benavides y Ramírez, 2003).

El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la molécula antioxidante AA como un compuesto alterno involucrado en las respuestas de desarrollo, específicamente en la respuesta fisiológica de: crecimiento, contenido de pigmentos fotosintéticos, proteína total y la actividad enzimática de las POX, para mejorar el rendimiento en el cultivo de crisantemo cultivar Polaris.

MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo se realizó en un invernadero no tecnificado del Centro Universitario UAEM Tenancingo, ubicado en el km 1.5 de la Carretera Tenancingo-Villa Guerrero, Estado de México, cuyas coordenadas geográficas son: 18° 57' latitud norte y 99° 35' longitud oeste del meridiano de Greenwich, con altitud de 2,200 m.

Como material vegetativo se usaron esquejes con una altura promedio de 7 cm de Dendranthema grandiflora cultivar Polaris, adquiridos en la empresa PLANTAMAR en Santa Ana Ixtlahuatzingo, México, entre marzo y julio de 2008. Las plantas se desarrollaron a una temperatura promedio de 30 °C con una máxima de 50 °C y una mínima de 15 °C, humedad relativa promedio de 30-40 % y luminosidad promedio de 85 %.

Manejo del cultivo

Los esquejes se enraizaron aplicando en la base del tallo alfa naftil acetamida (1.2 g de i. a.·kg^-1) y ácido indol-3-butírico (0.6 g de i. a.·kg^-1), y se colocaron en charolas con tepojal por 15 días. Después se trasplantaron individualmente a macetas de 20 x 22 cm³; se usó como sustrato peat-moss y agrolita en una relación de 2:1. Las plantas se regaron dos veces por semana y se mantuvieron erguidas con tutores de madera sin desbotonar durante todo el ciclo. La fertilización se realizó dos veces durante el ciclo de cultivo con una solución de 100-50-200 mg·L^-1 de N, P y K, para lo cual se utilizaron las sales de urea, fosfato monoamónico y nitrato de potasio.

Aspersiones de ácido ascórbico

Se prepararon soluciones de AA (Reasol) a las concentraciones de 0, 3.4 y 6.8 mM pH 5.7, 24 horas antes de la aplicación (AA oxidado), a las cuales se les agregó polisorbato 20 (Tween) como surfactante al 0.01 % (Romero-Romero y López-Delgado, 2009). Las soluciones se asperjaron sobre el haz de las hojas (15 ml por planta) dos veces por semana a partir de los 30 días de cultivo en invernadero y hasta los 100 días (cosecha). La aplicación se realizó con gota fina usando un aspersor manual (VenusPro) de 2 L de capacidad con boquilla de cono.

Las variables evaluadas fueron: proteína soluble, pigmentos fotosintéticos, actividad enzimática de POX, longitud, peso seco y número de tallos y de botones por planta en plantas de 100 días de cultivo. El experimento se realizó con 40 plantas por tratamiento.

Extracción de proteína

Proteína soluble

El contenido de proteína se determinó por el método de Bradford (1976). A 5 µl del sobrenadante se le agregaron 0.25 ml de reactivo de Bradford (Biorad) en un volumen final de 1.2 ml, y después de cinco minutos se midió la absorbancia a 595 nm en un espectrofotómetro (Hach Dr/4000U). La cuantificación de proteína se hizo tomando como referencia albúmina sérica de bovino como estándar.

Peroxidasa (EC 1.11.1.7)

La actividad enzimática de la POX se midió de acuerdo con el método descrito por Srivastava y Dwivedi (1998), en una mezcla de reacción con amortiguador de fosfato de sodio 50 mM pH 7.0, 3.33 mM de guaiacol, 4 mM de H₂O₂ y 0.020 ml del sobrenadante de la muestra en un volumen final de 3 ml. La reacción se inició con la adición del sobrenadante a 25-28 °C. Como blanco se utilizó amortiguador de reacción sin sobrenadante. La oxidación del sustrato (guaiacol) se midió por el incremento en la absorbancia a 470 nm durante tres minutos en intervalos de 30 segundos. Para determinar la actividad de la POX se usó el coeficiente de extinción del guaiacol ε= 2.6 ·mmol^-1·mm^-1, en la ecuación nmol·min^-1mg^-1=(ε) (volumen final/volumen de la muestra) (mg de proteína).

Pigmentos fotosintéticos

La cuantificación de los pigmentos fotosintéticos se hizo de acuerdo al método de Lichtenthaler y Wellburn (1983). Cincuenta mg de tejido de hoja (madura, tomada de la parte central del tallo principal) se maceraron en 2 ml de acetona al 80 % (4 °C). El extracto se centrifugó a 2,500 g durante 10 minutos y el sobrenadante se recuperó y ajustó a 2 ml. Se midió la absorbancia a 470, 646 y 663. Las concentraciones de clorofila a (Chl a), clorofila b (Chl b), xantofilas y carotenoides (x+c) se calcularon empleando las fórmulas:

Chl_a = 12.21 A₆₆₃ - 2.81 A₆₄₆

Chl_b = 20.13 A₆₄₆ - 5.03 A₆₆₃

C_x+c = (1000 A₄₇₀ - 3.27 [Chl_a] -107 [Chl_b])/229

El contenido de proteína, la actividad enzimática de la POX y los pigmentos fotosintéticos se midieron en tejido de hoja de 12 plantas por tratamiento.

Diseño experimental y análisis estadístico

Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con 40 plantas en bloques de 10 por tratamiento. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y una comparación de medias mediante la prueba de Tukey (P<0.05); el software utilizado fue StarGraphics plus versión 5.0.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los tratamientos de AA en plantas de crisantemo cultivar Polaris incrementaron significativamente la longitud del tallo, peso seco, número de botones y tallos por planta con respecto al testigo; el mejor tratamiento fue la concentración de 6.8 mM de AA, debido a que incrementó la longitud en 17.5 %, el peso seco en 31 %, el número de botones en 48 % y el número de tallos en 31.8 % (Cuadro 1) con respecto al testigo. Estos resultados permiten inferir que el AA aplicado en plantas de crisantemo incrementa la biomasa, lo que en su momento lleva a un aumento en la productividad, que puede ser muy importante para incluir estos tratamientos en el sistema de manejo integrado de dicho cultivo.

Recientemente se encontró que la aplicación exógena de AA incrementó la productividad en plantas de gladiolo (Add-ElAziz et al., 2009), en tubérculos de papa (Romero-Romero y López-Delgado, 2009), en canola (Sakr y Arafa, 2009), berenjena (El-Tohamy et al., 2008), trigo (Athar et al., 2008), haba (Younis et al., 2009) y caoba (Add-ElAziz et al., 2006); incluso el incremento de biomasa de estos cultivos se dio bajo condiciones de estrés biótico o abiótico. Imai et al. (1999) reportaron que la aplicación exógena de AA puede estimular la producción endógena de AA, lo que estimula el crecimiento celular al modificar las condiciones de la pared celular y estimular la división celular (De Pinto y De Gara, 2004; Smirnoff, 1996). El incremento de biomasa inducido por AA observado en el cultivo de crisantemo, puede estar relacionado a su participación en la división de la célula y alargamiento celular.

El incremento de proteínas y pigmentos fotosintéticos inducido por las aplicaciones de AA, se relaciona con la acumulación de biomasa observada en las plantas de crisantemo evaluada en este trabajo como longitud, peso seco y número de botones y tallos por planta; respuesta que se ha reportado en otros cultivos como: papa (Romero-Romero y López-Delgado, 2009), caoba (Add-ElAziz et al., 2006), gladiola (Add-ElAziz et al., 2009) y canola (Dolatabadian et al., 2008; Sakr y Arafa, 2009). Además, Athar et al. (2008) reportan que se requiere de una alta capacidad fotosintética para el crecimiento, y esto está ligado a la inducción de las rutas metabólicas en las cuales es necesario el incremento de la síntesis de proteínas en las cuales el AA participa (De Pinto y De Gara, 2004).

Es importante enfatizar que el incremento de pigmentos fotosintéticos inducido por AA en varios cultivos inclusive está relacionado con la protección contra estrés, porque algunos pigmentos fotosintéticos como los carotenoides tienen función antioxidante (Khan et al., 2006; Dolatabadian et al., 2008; 2009; Sark y Arafa, 2009; Romero-Romero y López-Delgado, 2009; Dolatabadian y Jouneghani, 2009), lo que hace a este compuesto potencialmente útil no sólo para el incremento de biomasa, sino también como posible inductor de tolerancia a factores de estrés en el cultivo de crisantemo, ya que se han observado efectos benéficos aun en plantas positivas al virus TSWV (datos no publicados).

Con respecto a la actividad enzimática de la POX, ésta aumentó 33 % en las plantas tratadas con 3.4 y 22 % con 6.8 mM de AA, con respecto al testigo. Esta respuesta es diferente a lo reportado en la literatura. Se ha encontrado que en trigo (Khan et al., 2006; Athar et al., 2008), frijol (Dolatabadian y Jouneghani, 2009) y canola (Dolatabadian et al., 2008) la aplicación de AA no modifica la actividad enzimática de la POX, pero afecta otras enzimas antioxidantes (Athar et al., 2008). En condiciones de estrés salino, inclusive baja los niveles de actividad de la POX (Dolatabadian et al., 2008; 2009) mientras que en Vicia faba los incrementa (Younis et al., 2009). De acuerdo a estas investigaciones y a los resultados obtenidos en este trabajo, la actividad enzimática de la POX va a depender de la concentración, forma de aplicación, número de aplicaciones, tipo de cultivo y etapa fenológica, entre otros factores. La inducción del crecimiento en las plantas de crisantemo por el AA probablemente se deba a que éste participe en alguna función metabólica relacionada con el crecimiento o desarrollo de la pared celular (Stasolla y Yeung, 2007), como se encontró en hipocótilos de pino, donde el AA interviene en la formación de los puentes de dehidrodiferulico y los polisacáridos catalizados por las POX durante el crecimiento celular (Sánchez et al., 1997).

CONCLUSIONES

El AA es un compuesto potencialmente útil para incrementar la biomasa en el cultivo de crisantemo cultivar Polaris, como una alternativa que puede ser encaminada a la productividad.

El AA es un compuesto que puede incluirse en el manejo integrado de los cultivos, por ser un compuesto económico e inocuo al ambiente.

AGRADECIMIENTOS

Al financiamiento otorgado por la Universidad Autónoma del Estado de México UAEM, proyecto 2525/2007U.

LITERATURA CITADA

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