, Víctor Ricardo Moreno–Medina1, Isabel Cristina Rodríguez–Luna1, Alberto Mendoza–Herrera1 y Netzahualcóyotl Mayek–Pérez1
Biofertilización con Azospirillum brasilense en sorgo, en el norte de México*
Azospirillum brasilense biofertilization in sorghum at northern Mexico
Jesús Gerardo García–Olivares1,, Víctor Ricardo Moreno–Medina1, Isabel Cristina Rodríguez–Luna1, Alberto Mendoza–Herrera1 y Netzahualcóyotl Mayek–Pérez1
1 Centro de Biotecnología Genómica, Instituto Politécnico Nacional. Blvd. del Maestro esq. Elías Piña s/n, Col. Narciso Mendoza. 88710, Reynosa, Tamaulipas, México.
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Autor para correspondencia:
* Recibido: Abril de 2005
Aceptado: Abril de 2006
RESUMEN
Durante 2002–2004 se realizó este estudio cuyo objetivo fue evaluar tres cepas de Azospirillum brasilense (CBG–497, CBG–180 y CBG–181), nativas del norte de Tamaulipas, México, para caracterizarlas en laboratorio y determinar su capacidad de producir biomasa y grano de sorgo en condiciones de invernadero y campo. La cepa CBG–497 produjo mayor cantidad de ácido indol–acético in vitro que las cepas CBG–180 y CBG–181. En invernadero, también las plantas inoculadas con CBG–497 incrementaron significativamente la producción de biomasa (50%), en comparación con las del testigo no inoculado, mientras que las CBG–180 y CBG–181 incrementaron la biomasa en 12 y 22%, respectivamente. En campo los tratamientos inoculados tuvieron un rendimiento promedio de grano en sorgo de 13 y 17% mayor que el testigo no inoculado en 2002–2003 y 2003–2004, respectivamente; y las cepas CBG–180 y CBG–181 incrementaron el rendimiento en mayor proporción respecto al testigo (13 a 27%), en comparación con CBG–497 (10% a 12%). Los resultados indican que la aplicación de biofertilizantes con base en cepas nativas de A. brasilense, incrementaron el rendimiento del sorgo.
Palabras clave: Sorghum bicolor (L.) Moench, ácido 3–indol–acético, biofertilizantes, rendimiento de grano.
]]> ABSTRACT
During 2002 to 2004 a study was carried out with the aim of evaluating three strains of Azospirillum brasilense (CBG–497, CBG–180 and CBG–181), native from the northern region of Tamaulipas, Mexico. Strains were characterized in a laboratory and tested for biomass and grain production in sorghum grown in the greenhouse and under field conditions. In vitro, strain CBG–497 produced a higher amount of indol acetic acid than CBG–180 and CBG–181. In the greenhouse, plants inoculated with CBG–497 significantly (p<0.05) increased biomass accumulation (50%) in comparison with the non–inoculated check, whereas CBG–180 and CBG–181increased biomass by 12 and 22% respectively. In the field inoculated treatments had an average yield increase over the checks of 13 and 17% in 2002–2003 and 2003–2004, respectively, and strains CBG–180 and 181 increased the seed yield in a larger proportion (13 to 27%), in comparison to CBG–497 (10 to 12%). Results indicated that the inoculation with native strains of A. brasilense increased grain yield in sorghum.
Key words: Sorghum bicolor (L.) Moench, biofertilizers, grain yield, 3–indol–acetic acid.
INTRODUCCIÓN
En el estado de Tamaulipas, México, durante 2004 se sembraron alrededor de 800 000 ha con sorgo [Sorghum bicolor (L.) Moench], cuya producción promedio de grano fue de 3.7 t ha–1 (SIAP, 2005). La mayor parte de dicha superficie se estableció en condiciones de temporal en el norte del estado, región caracterizada por la prevalencia de altas temperaturas, escasa y errática precipitación pluvial, y altos índices de salinidad del suelo (SEDESOL, 1995). Para obtener rendimientos aceptables, el sorgo requiere cantidades importantes de fertilizantes químicos; sin embargo, su alto costo impacta negativamente en la rentabilidad del mismo; además incrementa el problema de la salinidad, debido a las características químicas de sus suelos. Una alternativa al uso de los fertilizantes químicos son los microorganismos promotores del crecimiento denominados: "bioestimulantes", "biofertilizantes" o "inoculantes".
Los microorganismos más utilizados son las bacterias de los géneros Rhizobium y Azospirillum, así como hongos micorrícicos del género Glomus, que generalmente provenientes de otras regiones, lo que limita a los agricultores locales. Así, los estudios sobre la adaptación y eficiencia biofertilizante de nuevas cepas deberán conducirse en las regiones donde se utilizarán recurrentemente. La inoculación con A. brasilense es altamente benéfica en gramíneas como: maíz, caña de azúcar, pastos y sorgo, pues aporta de 30 a 50% de los requerimientos de nitrógeno de dichos cultivos (Martínez–Morales et al., 2003; Viviene et al., 2004).
A partir del 2000, en el Centro de Biotecnología Genómica (CBG) del Instituto Politécnico Nacional se han aislado y caracterizado cepas de A. brasilense, nativas del norte de Tamaulipas, y se ha determinado su potencial biofertilizante en condiciones controladas de invernadero. Sin embargo, es necesario evaluar su potencial bioestimulante en cultivos de importancia económica bajo condiciones de campo. El objetivo del presente estudio fue evaluar el potencial biofertilizante en sorgo de tres cepas de A. brasilense nativas del norte de Tamaulipas.
MATERIALES Y MÉTODOS
]]> Obtención de aislamientos de Azospirillum brasilenseDurante el otoño–invierno de 1999–2000 se realizaron colectas de suelos cultivados con maíz en los municipios de Díaz Ordaz y Río Bravo, Tamaulipas, México (26° 13' LN, 98° 35' LO y 40 msnm), sitios de suelos con textura franco–arcillosa y franco–arenosa, respectivamente, contenido de materia orgánica menor a 1% y pH de 7.8.
A. brasilense se aisló en medio de cultivo PY (peptona 0.5%, extracto de levadura 0.3%, CaCl2 0.007 M), adicionado con 20 µg mL–1 de ácido nalidíxico y 10 µg mL–1 de tetraciclina (Caballero–Mellado et al., 1992). Lugo et al. (2001), identificaron los aislamientos fijadores de N en el medio NFB (5 g de ácido málico y malato de sodio, 5 mL de K2HPO4 10%, 2 mL de MgSO4 7H2O 10%, 1 mL de NaCl 10%, 2 mL de CaCl2 1%, 2 mL de NaMoO4 2H2O 1%, 1 mL de MnSO4 2H2O 1%, 2 mL de azul de bromotimol 5%, 0.4 g de FeSO4 7H2O, 4 g de KOH, 0.8 mL de NH4NO3 10 mM, 1 mL de Biotina y Piridoxal, y 33 g de dextrana), mientras que la capacidad para producir sideróforos se determinó con el método cromoazurol (Schwyn y Neilands, 1987).
Caracterización in vitro de cepas de A. brasilense
Las cepas aisladas se desarrollaron en medio líquido Luria–Bertani (LB) adicionado con triptófano (0.1 g L–1) y se incubaron a 29 °C y 200 rpm de agitación constante. Se tomaron muestras del cultivo a las 24, 48 y 72 h en incubación y se centrifugaron a 1942 g por 30 min, en cada una se determinó la concentración de ácido 3–indol–acético (AIA) y triptófano por cromatografía de líquidos (HPLC, High Pressure Liquid Chromatograph, Hewlett Packard modelo 1100). Para la separación se utilizó una columna RP–18 (Beckman Ultrasphere) de 150 mm de largo y 4.6 mm de diámetro interno, con tamaño de partícula de 5 mm. La fase móvil consistió en acetonitrilo–fosfatos 30/70 y detector de muestras de 20 mL de volumen de inyección, ajustado a 220 nm de longitud de onda. El equipo se calibró con la mezcla de estándares triptófano, AIA y ácido–indol–butírico (IBA) (Sigma–Aldrich Co., San Luis, Missouri, EUA), cuyos tiempos de retención fueron de 2.6, 6.4, y 15 min, respectivamente. El análisis se realizó por triplicado y se determinó la media y el error estándar de cada tratamiento (cepa), en cada tiempo de muestreo.
Efecto de A. brasilense en sorgo
Experimento en invernadero. El experimento se llevó a cabo en un invernadero del Centro de Biotecnología Genómica (CBG) del Instituto Politécnico Nacional (IPN) en Reynosa, Tamaulipas, durante el ciclo otoño–invierno de 2004, en charolas de plástico de 38 orificios en sustrato de turba (Redi Earh ScottR) con pH 6.8. Se inoculó con la aplicación de 1 mL de cultivo bacteriano, cultivado en medio líquido PY (Döbereiner et al., 1976) y suplementado con CaCl2 0.04%, durante 48 h a 32 °C y 200 rpm de agitación constante. Al momento de aplicarse, cada muestra tenía 1x108 unidades formadoras de colonia (ufc) mL–1. Al testigo se le aplicó agua destilada estéril. Se utilizó el híbrido comercial de sorgo DK–54 (DekalbR). Se empleó un diseño experimental completamente al azar, con 16 repeticiones y la unidad experimental fue de dos plantas. A los 7, 12, 15 y 23 días después de la siembra se cortó la parte aérea de las plantas de cuatro repeticiones, mismas que se secaron en estufa a 60 °C por 48 h. Se calcularon las medias y el error estándar para cada uno de los tratamientos en cada fecha de corte.
Experimento en campo. El estudio se realizó en condiciones de temporal durante los ciclos otoño–invierno de 2002–2003 y 2003–2004 en la localidad de Villa Cárdenas, Matamoros, Tamaulipas (97° 49' LN; 25° 55' LO y 11 msnm), donde el suelo tiene textura franco–limosa, pH de 8.1, conductividad eléctrica de 0.5 mmhos cm–1 a 25 °C, contenido de materia orgánica de 1.4% y altos contenidos de N inorgánico (NO3) (11.5 ppm), P (P2O5) (11.5 ppm) y K (550 ppm). Durante el desarrollo de los experimentos, se registraron temperaturas medias de 22.3 °C (2002–2003) y 21.8 °C (2003–2004), con una precipitación pluvial total de 164 mm (2002–2003) y de 429 mm (2003–2004).
Las cepas se cultivaron en 250 mL de medio líquido PY, suplementado con CaCl2 0.04% a 32 °C por 48 h y 200 rpm de agitación. Posteriormente, los cultivos se mezclaron con 500 g de turba estéril (Redi Earh ScottR) con pH 6.8. Las mezclas se incubaron por siete días a 32 °C en bolsas de polietileno, bajo condiciones asépticas. Antes de sembrarse, la semilla se mezcló con el inóculo (1 kg de inóculo por 14 kg de semilla, 6x107 ufc por semilla) y se agregó solución acuosa de goma arábiga 20% (40 mL kg–1 de semilla) como adherente. La semilla inoculada y sin inocular se sembró inmediatamente después de la inoculación.
Los tratamientos (cepas de A. brasilense) se establecieron en parcelas de 24 surcos de 20 m de largo, y separados entre sí a 0.86 m, con una densidad de siembra de 220 000 plantas/ha. Al testigo no se le aplicó bacteria ni fertilización química, ya que en el norte de Tamaulipas es común no fertilizar el sorgo en condiciones de temporal. En cada parcela se tomaron cinco muestras de plantas a la cosecha, a partir de cinco surcos de 8 m de largo (34.4 m2) y se determinó el rendimiento de grano al 14% de humedad, expresado en toneladas por hectárea. Se calcularon las medias y el error estándar para cada tratamiento y experimento.
]]>RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Caracterización in vitro de cepas de A. brasilense
Las cepas CBG–180 y CBG–181 presentaron menor producción de triptófano, precursor del AIA en A. brasilense (Van de Broek et al., 1999), que CBG–497 a las 24, 48 y 72 h en incubación; mientras esta última presentó la mayor producción de AIA (Figura 1). La relación directa entre la asimilación de triptófano y la producción de AIA en A. brasilense fue observada por Khawas y Adachi (1999) y Martínez–Morales et al. (2003). Lo mismo ocurre en otras especies de Azospirillum (Han y New, 1998; Holguin et al., 1999) y en otras bacterias tales como Rhizobium meliloti, Enterobacter cloacae, Pseudomonas syringae pv. fluorescens y Agrobacterium tumefaciens (Caballero–Mellado, 1999; Zakharova et al., 1999; Vázquez et al., 2000). La producción de altas cantidades de AIA in vitro es un parámetro apropiado en la selección de mejores cepas nativas de A. brasilense, para producir biofertilizantes de plantas cultivadas (Van de Broek et al., 1999).
Efecto de A. brasilense en sorgo en invernadero y en campo
La inoculación con A. brasilense incrementó la producción de biomasa en sorgo a los 23 días después de la siembra, en comparación al testigo, y CBG–497 promovió la mayor producción de biomasa (Figura 2). En campo, las tres cepas incrementaron el rendimiento de grano en 500 kg ha–1 en 2002–2003 y en más de 700 kg ha–1 en 2003–2004 (Figura 3). Varios autores han reportado incrementos en el rendimiento en cultivos como maíz (Zea mays L.) (O'Hara et al., 1981; Okon y Labandera–González, 1994; Bashan et al., 1996; Fallik y Okon, 1997; Döbbelaere et al., 2002; Holguin et al., 2003; Irízar et al., 2003; Aguirre–Medina, 2004), frijol (Phaseolus vulgaris L.) (Burdman et al., 1996), trigo (Triticum aestivum L.) (Döbbelaere et al., 2002), garbanzo (Cicer arietinum L.), haba (Vicia faba L.) (Hamaoui et al., 2001) pastos (Setaria italica) (Fallik y Okon, 1997) y sorgo [Sorghum bicolor (L.) Moench] (Martínez–Medina et al., 2004).
Contrario a lo observado en invernadero, en el campo las cepas CBG–180 y CBG–181 incrementaron el rendimiento de grano respecto al testigo en 21.5% y 13.4%, respectivamente (Figura 3). La cepa CBG–497 ocasionó los mayores incrementos en la acumulación de biomasa en sorgo, cultivado en invernadero, lo que probablemente se asocia con la mayor producción de AIA; resultados similares han sido reportados por Sumner (1990); Okon y Labandera–González (1994); Bashan y Holguin (1997) y Döbbelaere et al. (2002).
En general, la producción de grano fue mayor en 2003–2004 debido a que la precipitación pluvial fue mayor al ciclo anterior en 162%. Los resultados de este trabajo concuerdan con los de Okon et al. (1976), Levanony y Bashan (1991), Kanungo et al. (1997), Bashan (1998), Díaz–Franco et al. (2004) y Pecina–Quintero et al. (2005), quienes reportaron la interacción positiva entre el desarrollo y colonización de A. brasilense y el contenido de humedad en el suelo. Las cepas CBG–180 y CBG–181 alcanzaron los mayores incrementos en la producción de grano, en comparación con el testigo. Las diferencias entre cepas, respecto a la producción de la biomasa o grano, se deben principalmente al efecto de las condiciones ambientales variables en la colonización de cada cepa de forma específica (Pecina–Quintero et al., 2004; 2005).
Las cepas CBG–180 y CBG–181 se aislaron de suelos franco–arenosos de Río Bravo, mientras que la cepa CBG–497 se aisló en Díaz Ordaz de suelos franco–arcillosos. Las condiciones del suelo del sitio de prueba [características físico–químicas del suelo, poblaciones nativas de A. brasilense y clima (Pecina–Quintero et al., 2005)], probablemente favorecieron el efecto promotor del crecimiento vegetal en CBG–180 y CBG–181.
Los efectos positivos de A. brasilense en diversos cultivos se atribuyen principalmente al mejoramiento en el desarrollo de la raíz y al incremento subsecuente en el hospedante de la tasa de asimilación de agua y la utilización de minerales del suelo (Fallik y Okon, 1996; Burdman et al., 1997; Hamaoui et al., 2001; Döbbelaere et al., 2002). La inoculación con A. brasilense ha incrementado los rendimientos de grano de cereales en condiciones de campo (mayores al 30%), así como el crecimiento y la acumulación de biomasa en invernadero para diversas especies de plantas (Sumner, 1990; Okon y Labandera–González, 1994).
A pesar de los resultados positivos, la inoculación con A. brasilense se asocia aún con la inconsistencia (Ramírez y Luna, 1995; Pecina–Quintero et al., 2005), lo que restringe su desarrollo como inóculo comercial en gran escala (Bashan y Holguin, 1997). Los factores responsables de tales irregularidades son difíciles de identificar, pero generalmente se atribuyen a lo variable de las condiciones ecológicas y ambientales, tales como físico y químicas del suelo, presencia de microorganismos en la rizósfera, genotipo del hospedante o la capacidad de la bacteria para establecerse y competir con la microflora nativa (Okon y Labandera–González, 1994; Ramírez y Luna, 1995; Döbbelaere et al., 2002; Pecina–Quintero et al., 2005). Las características básicas de la interacción A. brasilense–raíces y los diferentes parámetros críticos para obtener la inoculación exitosa, pueden mejorar la eficacia de los inóculos basados en A. brasilense bajo condiciones ambientales y del suelo variables, y de esta forma, estimular su utilización comercial en la producción agrícola en campo (Bashan y Holguin, 1997).
CONCLUSIONES
La cepa CBG–497 de A. brasilense logró los mayores incrementos en la producción de biomasa de sorgo en invernadero debido a su mayor producción de AIA.
]]> Las cepas de A. brasilense nativas del norte de Tamaulipas incrementaron la producción de biomasa y el rendimiento de grano en sorgo.
AGRADECIMIENTOS
El desarrollo de este trabajo lo financió el Instituto Politécnico Nacional y su publicación el Fondo Mixto del Estado de Tamaulipas (Proyecto TAMPS–2003–C03–06).
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