Detección de anticuerpos contra lentivirus de pequeños rumiantes en fetos ovinos y caprinos
Detection of antibodies against small ruminant lentiviruses in ovine and caprine fetuses
Gerardo Arcila López* Humberto Alejandro Martínez Rodríguez* Jorge Tórtora Pérez*
* Departamento de Ciencias Biológicas. Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán (FES-C), Universidad Nacional Autónoma de México, km 2.5, Carretera Cuautitlán-Teoloyucan, Cuautitlán Izcalli, 54770, Estado de México, México.
]]>Responsable de correspondencia:
Jorge L. Tórtora Pérez,
Tel. 52(55) 56231843,
correo electrónico: tortora@unam.mx
Recibido el 13 de diciembre de 2010
Aceptado el 1 de septiembre de 2011
Abstract
]]> The presence of antibodies against Maedi-Visna (MV) and caprine arthritis encephalitis (CAE) was evaluated in ovine and caprine fetuses obtained from pregnant females slaughtered in abattoirs. Sera from 54 caprine fetuses and 65 ovine fetuses were collected and evaluated by the indirect ELISA technique. Antibodies were detected in five caprine fetuses of 80 days of gestation and in four ovine fetuses of 90 to 100 days of gestation; three caprine fetuses and two ovine fetuses of 60 to 65 days of gestation were suspicious. The possibility of uterine infection with these retroviruses is confirmed, and its consequences in current disease control and eradication strategies are discussed.Key words: Retrovirus, sheep, goat, small ruminants, caprine arthritis encephalitis, Maedi-Visna, fetal immunity, transplacental infection, uterine infection.
Resumen
Se evaluó la presencia de anticuerpos contra los virus del Maedi-Visna (MV) y la artritis encefalitis caprina (AEC) en fetos ovinos y caprinos obtenidos de hembras gestantes sacrificadas para consumo en México. Se recolectaron sueros de 54 fetos caprinos y 65 fetos ovinos que se evaluaron mediante ELISA indirecto. Se detectaron anticuerpos en cinco fetos caprinos de 80 días de gestación y en cuatro fetos ovinos de 90 a 100 días; tres fetos caprinos y dos ovinos de 60 a 65 días de gestación resultaron sospechosos. Se confirma la posibilidad de la infección uterina por estos retrovirus y se discuten sus consecuencias en las actuales estrategias de control y erradicación de las enfermedades.
Palabras clave: Retrovirus, ovinos, caprinos, pequeños rumiantes, artritis encefalitis caprina, Maedi-Visna, inmunidad fetal, infección transplacentaria, infección uterina.
Introducción
Los retro-lentivirus de los pequeños rumiantes (LvPR) causan lesiones inflamatorias crónico-degenerativas en diversos órganos: articulaciones, pulmón, cerebro y glándula mamaria de ovinos y caprinos. Las dos enfermedades más relevantes y estudiadas, ocasionadas por LvPR, son la artritis encefalitis caprina (AEC) y el Maedi-Visna (MV); se consideran enfermedades diferentes y específicas de especie, pero los trabajos de evaluación de las relaciones genómicas de estos virus y de seguimiento en rebaños mixtos de ovinos y caprinos, sugieren que es posible la transmisión de estos virus entre especies.1-4 El cuadro clínico es progresivo y usualmente requiere de meses a años para desarrollarse. La seroconversión también es tardía, puede ocurrir en algunas semanas o hasta los dos años pos-infección. El objetivo principal de estos virus son las células de los monocitos/macrófagos y la médula ósea se considera su órgano reservorio. Poco tiempo después de la infección, el virus entra en un periodo de latencia o de replicación restringida y la cantidad de partículas virales en sangre y secreciones tiende a ser sumamente baja.5,6
Se considera que la ingestión del calostro es la principal vía de transmisión de la AEC y una forma de transmisión de MV; los macrófagos presentes en esta secreción y en la leche de las madres infectadas transportan el virus.7 En el caso de MV, se jerarquiza la transmisión por vía respiratoria a través de aerosoles contaminados por células infectadas, emitidos por las madres y los corderos ya infectados.8,9
]]> La posibilidad de la transmisión venérea e intrauterina ha cobrado importancia por el uso cada vez más extendido de las técnicas de reproducción asistida, inseminación artificial y transferencia de embriones en los pequeños rumiantes, las cuales implican riesgos adicionales de infección de regiones y rebaños libres de estas enfermedades.6,8,10Experimentalmente, se han logrado resultados positivos al infectar fetos ovinos de 100 días de gestación con virus de MV, para lograr recuperar el virus de desafío.11 Se ha observado que crías caprinas obtenidas mediante cesárea y alimentadas con calostro libre de virus, pueden llegar a seroconvertir a los pocos meses del nacimiento.12 Mediante PCR y ELISA, se ha demostrado la presencia de genoma viral y de respuesta serológica anti MV, en corderos no calostrados, nacidos de hembras provenientes de rebaños naturalmente infectados y se ha observado relación entre la antigenemia de las ovejas y sus corderos positivos. El porcentaje de corderos positivos en estas condiciones no es despreciable, pues varía entre 5 y 11%.13,14 Por otra parte, se ha demostrado in vitro, la susceptibilidad a la infección con LvPR en las células epiteliales del útero.15-17 Estos hallazgos soportan la infección transplacentaria, pero su importancia en la prevalencia de la enfermedad es incierta.6
La presencia de anticuerpos fetales contra LvPR no ha sido estudiada hasta ahora. La capacidad fetal para responder a los antígenos se desarrolla muy rápidamente luego de que aparecen los órganos linfoides, pero no todos los antígenos tienen la misma capacidad para estimular el tejido linfoide fetal. Los linfocitos se identifican en la sangre periférica en los fetos bovinos hacia el día 45, las células B IgM+ el día 59, y las productoras de IgG el día 135.18 Los fetos bovinos responden a los rotavirus a los 73 días; al parvovirus, al día 93 y al virus de parainfluenza 3, a los 120 días.19 Los fetos ovinos pueden producir anticuerpos contra el fago FX174 el día 41 de gestación20 y contra el virus de Akabane desde los 50 días.21 En fetos ovinos es posible inducir la formación de anticuerpos contra el virus SV40 el día 90; contra el fago T4, el 105; contra el virus de lengua azul, el 122, y contra el virus de la coriomeningitis linfocítica, el día 140. La placenta de los rumiantes no permite el paso de anticuerpos maternos a los fetos, por lo que la respuesta serológica positiva implica infección fetal.20
En México, la AEC se encuentra ampliamente distribuida en los rebaños lecheros estabulados, mientras que no ocurre, o su prevalencia es muy baja, en los rebaños campesinos, que pastorean en ecosistemas semiáridos o áridos,22-25 posiblemente porque estas condiciones extremas limitan la enfermedad. México se declara libre de MV, aunque se han señalado cuadros patológicos característicos en muestras de pulmón de matadero26 y se ha demostrado una seroprevalencia de 8% en ganado nativo de rebaños campesinos.27 Esta situación se ha convertido en un serio inconveniente en la exportación de ovinos para reproducción y determinó el sacrificio de más de 300 animales positivos al virus, que fueron exportados a Colombia en 2007.28
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la posible presencia de anticuerpos contra LvPR en fetos ovinos y caprinos, intentando determinar en que etapa de la gestación puede establecerse esta respuesta.
Material y métodos
En el centro de México se recolectaron úteros de hembras gestantes sacrificadas en mataderos municipales, que se trasladaron al laboratorio para su estudio en condiciones de esterilidad. Se obtuvieron 119 fetos, 54 caprinos y 65 ovinos. Se determinó el sexo de los productos: 27 machos y 27 hembras caprinas, 43 machos y 22 hembras ovinas. Asimismo, se calculó el tiempo aproximado de gestación, midiendo la distancia de la nuca a la base de la cola.29
Según el caso, se obtuvo sangre y líquido torácico o abdominal con jeringa estéril. Las muestras se centrifugaron a 1800 g por 10 minutos, para separar el sobrenadante (suero fetal) del paquete celular y los posibles detritus tisulares. Los sobrenadantes se conservaron en congelación a -70ºC hasta su procesamiento.
ELISA
]]> Los sueros obtenidos fueron evaluados mediante el paquete Maedi-Visna/CAEV Serodiagnosis, ELISA test serum.* El paquete se empleó con ELISA indirecta, dirigida a demostrar anticuerpos, principalmente de la clase IgG contra dos proteínas virales, la transmembranal (TM, gen ENV) y la proteína P28 recombinante, componente de la cápside viral (gen GAG). El uso de estas proteínas altamente conservadas, permite la detección de un amplio espectro de variantes serológicas de estos virus. La lectura de densidad óptica (DO) de las microplacas se realizó a 450 nm. Se corrigieron las lecturas de DO restando el valor de lectura del pozo sin antígeno al valor obtenido en el testigo positivo con antígeno. Se estableció el valor de DO de cada muestra en términos porcentuales contra el valor corregido del testigo positivo (S/P%). Siguiendo las instrucciones del fabricante del paquete, las muestras con valor S/P% igual o menor a 40% fueron consideradas negativas, con S/P% entre 40 y 50% sospechosas, y con valores S/P% iguales o mayores a 50% positivas.Contrainmunoelectroforesis
Mediante pruebas de contrainmunoelectroforesis (CIE) se constató la presencia de inmunoglobulinas en las muestras de suero fetal. Se preparó un suero hiperinmune contra inmunoglobulinas caprinas en conejo. En un gel de agarosa al 1% con amortiguador de barbituratos ph 8.2, se cortó un canal en medio del gel, con dos perforaciones laterales. En las perforaciones laterales se colocaron 50 µl de suero fetal. El gel se instaló en una cámara de electroforesis y se corrió a 70 voltios durante 45 minutos, posteriormente, se agregaron 300 µl del suero hiperinmune de conejo en el canal central y se incubó a TA en cámara húmeda de 48 a 72 horas.
Resultados
Los fetos obtenidos presentaron edades de 50 a 145 días de gestación.
Se detectaron nueve fetos seropositivos (7.5%) y cinco sospechosos (4.2%) a LvPR, cinco fueron caprinos de aproximadamente 80 días y cuatro fueron ovinos de entre 90 y 100 días de gestación. Los fetos sospechosos fueron de menor edad, aproximadamente 60 días de gestación, tres de origen caprino y dos ovinos (Cuadro 1).
En CIE, seis de los sueros positivos formaron una banda de precipitación característica de IgM, que no se presentó en los otros tres seropositivos y los cinco sospechosos.
]]>Discusión
Considerando la forma de obtención de las muestras de suero fetal, su contaminación con sangre materna resulta altamente improbable. Los fetos y recién nacidos de los rumiantes son agamaglobulinémicos, al ser la placenta de estas especies impermeable al paso de inmunoglobulinas maternas,20 por lo que la presencia de anticuerpos contra LvPR es además de indicador de la respuesta fetal, indicador inequívoco de la infección de los fetos por estos virus. Los resultados obtenidos en fetos positivos y sospechosos demuestran que fueron capaces de generar anticuerpos contra LvPR a partir, al menos, del inicio del segundo tercio de la gestación, 60 días. Por la falta de estímulos y de madurez en un ambiente uterino estéril, el sistema inmune fetal de los rumiantes en desarrollo y diferenciación, igual que el de las demás especies, desarrolla principalmente respuestas de la clase IgM, y en menor medida, IgG.19,21 El bandeado característico de IgM, observado en las pruebas de CIE, soporta esta posibilidad. Es posible que los sueros positivos y sospechosos que no presentaron esta banda en CIE (8:14) tuvieran bajas concentraciones de gammaglobulinas, insuficientes para ser detectadas por esta técnica.
De acuerdo con el fabricante, ELISA detecta principalmente anticuerpos de la clase IgG, por lo que se debe plantear la posibilidad de que el número de fetos positivos fuera mayor al demostrado, y que éstos no fueron detectados por la técnica utilizada. Esta observación es particularmente válida para los fetos de origen caprino, considerando la amplia distribución de la enfermedad en México. Por el contrario, resulta llamativa la cantidad de fetos ovinos positivos y sospechosos en atención a que MV parece ser una enfermedad de menor prevalencia en México, aunque también en este caso, es posible que los rebaños del ganado importado sin control por empresas de Estados Unidos de América y Canadá, puedan presentar prevalencias equivalentes a las demostradas en aquellos países.
No se encontraron informes previos sobre la demostración de anticuerpos contra LvPR en fetos ovinos y caprinos. Existe información que indica la posibilidad de que el feto pueda ser infectado con LvPR durante la gestación.6 La infección viral del feto puede causar alteraciones que desencadenen la reabsorción o el aborto del producto, según el momento de gestación en que ocurre y el tipo de virus involucrado; cuando esto no sucede, el feto puede resultar inmunotolerante, como ocurre en diarrea viral bovina. La infección del feto en etapas tempranas de la gestación, determina que se reconozcan los antígenos virales como propios y los animales al nacer desarrollen cuadros graves de la enfermedad, generalmente mortales.30 Por las características de este trabajo, no pudo establecerse el momento de infección del producto, y no se debe descartar la posibilidad de que en las infecciones tempranas por LvPR se presenten fenómenos de tolerancia. Los anticuerpos demostrados en los fetos caprinos podrían, sin embargo, participar en la patogenia de los cuadros encefálicos que se presentan en los cabritos de dos a cuatro meses de edad, asociados con las lesiones inducidas directamente por la presencia viral.
Los resultados de este trabajo coinciden en la proporción de fetos reactores a la presencia viral observada por PCR en corderos no calostrados en rebaños con MV endémico,13,14 y cuestionan las estrategias de control basadas en el no calostrado directo de las crías de madres confirmadas positivas a LvPR, que implican altos costos en mano de obra y pérdida de recién nacidos por inanición. En todo caso, las estrategias de calostrado artificial o con calostros bovinos o pasteurizados y la separación de los rebaños entre madres positivas y negativas,7,8,14 podrían emplearse hasta abatir la prevalencia de la enfermedad en el rebaño, para proceder cuando las condiciones económicas de reemplazo lo permitan, a la eliminación de todas las hembras reactoras.
Agradecimientos
Se agradece el financiamiento otorgado por PAPIIT-UNAM: IN200305-2.
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Este trabajo es parte de la tesis de Maestría en Ciencias del primer autor.
* Institut Pourquier (Versión P00302/02), Francia.
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