Vacunas contra el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV): escribiendo una historia
Vaccines against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): writing a history
Lilián Flores–Mendoza* Jesús Hernández*
* Laboratorio de Inmunología, Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C., Carretera a la Victoria, Km 0.6, Hermosillo, Sonora, 83000, México, Teléfono y Fax: (662) 289–24–00, ext. 294, Correo electrónico: jhdez@ciad.mx
]]> Recibido el 23 de abril de 2009.
Abstract
The porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) constitutes one of the most serious problems of the pig industry in the world. It affects pigs of all ages and causes reproductive and respiratory disorders that create great economic losses. These increase due to the rapid spread of the disease and the inefficiency of the commercial vaccines. Modified live and killed vaccines are the two types of commercial vaccines currently available on the market for American and European strains. Although these vaccines can reduce disease symptoms and viremia, they do not prevent infection in any way and cross–presentation is variable against heterologous virus. Furthermore, it has been reported that the vaccine's virus can spread to other susceptible animals. For these reason, many studies focused on the development of new vaccines that include different vectors for the development of DNA vaccines by evaluating various structural proteins. The use of PRRSV infectious clones, as well as the construction of viral chimeras between the vaccine virus and highly infectious virus have also been evaluated. All these strategies have failed to develop an effective vaccine against PRRSV; therefore it remains as a major challenge.
Key words: Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRSV, vaccines.
Resumen
El virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) constituye uno de los problemas más grandes de la industria porcina. Afecta a cerdos de todas las edades, causa problemas reproductivos y respiratorios que generan pérdidas económicas millonarias. Éstas van en aumento debido a la rápida diseminación del virus y a la poca eficiencia de las vacunas comerciales para su tratamiento. Actualmente existen dos tipos de vacunas contra el PRRSV: una utiliza el virus atenuado y otra el virus inactivado. Existen en el mercado ambos tipos, tanto para cepas americanas como europeas. Aun cuando dichas vacunas disminuyen los síntomas de la enfermedad y la viremia, no evitan la infección y la protección cruzada es variable frente a virus heterólogos. Además, se ha informado que el virus vacunal puede diseminarse a otros animales susceptibles. Por esta razón muchos estudios se han orientado al desarrollo de nuevas vacunas que incluyen diferentes vectores para el desarrollo de vacunas de ADN evaluando varias proteínas estructurales. También se ha evaluado el empleo de clones infecciosos de PRRSV, así como la construcción de quimeras virales entre el virus vacunal y un virus altamente infeccioso. Todas estas estrategias no han logrado desarrollar una vacuna eficaz contra el PRRSV, por lo que dicho propósito sigue siendo un reto muy importante.
Palabras clave: Virus del Síndrome reproductivo y respiratorio porcino, PRRS, vacunas.
]]>Introducción
El síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) es una enfermedad distribuida en la mayoría de los países productores de carne de cerdo, donde genera millonarias pérdidas económicas. Por ejemplo, Estados Unidos de Smérica, Canadá y Japón han registrado más de 50% de sus hatos contaminados con esa enfermedad.1–3 Actualmente, sólo Noruega y Suecia permanecen libres de la enfermedad.4 En México no se ha registrado una cifra aproximada de pérdidas; sin embargo, algunos estudios muestran que éstas varían de 250 a 500 dólares por hembra.5 Aunadas a las pérdidas anuales causadas por el PRRS, recientemente se han descrito brotes agudos con cepas altamente patogénicas que incrementan estas cifras. En 2006 la organización China Animal Disease Control Center (CADC) informó de un brote de PRRS que afectó a 2 120 000 cerdos con mortalidad de 20%.6 Estas cifras presentan un panorama muy difícil para la industria porcícola a causa del PRRS; en este contexto, en los últimos años se ha tratado de desarrollar nuevas estrategias para el control y prevención de la enfermedad.
En lo que respecta a la enfermedad de PRRS se han logrado muchos avances en campos como la epidemiología, transmisión, características clínicas, etc.7,8 Otro aspecto estudiado ampliamente es el agente causal, el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). Respecto de este último, se conoce su estructura, las células susceptibles y el mecanismo de infección celular.9–14 Sin embargo, no se han logrado esclarecer aspectos importantes como la evasión del sistema inmune por el virus y el desarrollo de vacunas eficientes para eliminar o prevenir la enfermedad, a pesar de las investigaciones realizadas hasta el momento.15
Generalidades del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino
El PRRSV pertenece a la familia Arteriviridae (género Arterivirus, orden Nidovirales). Se trata de un virus envuelto con un genoma de ARN de cadena sencilla, polaridad positiva de aproximadamente 15 Kb.16 El genoma del PRRSV se compone en el extremo 5' de una región corta no traducida (UTR, por sus siglas en inglés, untranslated region) seguida de nueve marcos de lectura abierta (ORF) llamados ORF1a, ORF1b, ORF2a, ORF2b, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 y ORF7.17–19 Los ORF1a y ORF1b constituyen aproximadamente 75% del tamaño del genoma y codifican a una poliproteína con actividad de ARN polimerasa (pp1a) y también la poliproteína 1ab, producto de un cambio en el marco de lectura durante la traducción cercana al extremo 3' del ORF1a.20 Los ORF 2a y 3–7 codifican para las glicoproteínas estructurales (GP) 2a, GP3, GP4, GP5 y las proteínas no glicosiladas 2b, la proteína M de membrana y la N de la nucleocápside. También en el extremo 3' del genoma hay una región no traducida seguida de una cola de poli A.17,18,21
El ORF2 contiene un marco de lectura interno que codifica para una proteína no glicosilada conocida como 2b. Se ha identificado la presencia de esta proteína en células infectadas, así como una respuesta anti–2b en cerdos infectados con PRRSV.19 Recientemente se demostró que la proteína 2b es un componente integral del virión del PRRS.22 La GP3 es la proteína más glicosilada del PRRSV con siete sitios de N–glicosilación.23 Ésta ha sido detectada en el virión de algunas cepas europeas; sin embargo, en cepas americanas su presencia aún se cuestiona.24–26 Por su parte, la GP4 tiene cuatro sitios de N–glicosilación y se han identificado anticuerpos neutralizantes (AN) anti–GP4; sin embargo, éstos son menos efectivos que los inducidos por GP5.27
La GP5 es una proteína transmembranal glicosilada que se puede dividir en varios dominios: un péptido señal, un ectodominio (con un número variable de sitios potenciales de glicosilación), una región transmembranal y un endodominio.11,23 En el ectodominio se han detectado dos epítopes que inducen la producción de anticuerpos, de los cuales sólo un tipo es neutralizante. Estos epítopes se denominan A y B (el epítope B es el neutralizante).28 Este último es conservado entre los aislamientos de PRRS; sin embargo, no es inmunodominante, contrario al epítope A, el cual es inmunodominante e hipervariable. Estos epítopes se encuentran separados por siete aminoácidos. Los cerdos infectados con PRRSV primeramente desarrollan anticuerpos no neutralizantes contra el epítope A y tiempo después (cuatro semanas aproximadamente) aparecen los AN contra el epítope B. En tal contexto, el epítope A funciona como señuelo del virus, distrayendo de manera momentánea la respuesta neutralizante.29 Se ha observado que la GP5 forma heterodímeros con la proteína M en las partículas virales.30 Estos heterodímeros también se han relacionado con la infección celular por su unión a moléculas de heparán sulfato y sialoadesina, principalmente en macrófagos.31,32 Por su parte, la proteína N codificada por el ORF7 constituye entre 20%–40 % del contenido proteínico del virión.20,30 Esta proteína contiene 26% de residuos básicos en el extremo N terminal, lo cual puede facilitar su interacción con el ARN del genoma.23
Una característica importante del PRRSV es su alta variabilidad genética. En base a sus diferencias genéticas, los aislados del PRRSV pueden dividirse en: genotipo europeo (prototipo virus Lelystad) y genotipo americano (prototipo virus VR–2332). Estos genotipos tienen una similitud de nucleótidos de 55% a 70% cuando se compara todo el genoma.33,34 Se ha informado que en los aislados americanos existe mayor diversidad genética, en comparación con los europeos, que se encuentran genéticamente muy relacionados.35 Los genes que presentan mayor tasa de variabilidad son ORF5, ORF3 y ORF4, mientras que los genes de ORF2, ORF6 y ORF7 son los más conservados.33
]]> La proteína M del PRRSV es la más conservada, con similitud de 94% y 100% a nivel de aminoácidos, dentro del mismo genotipo (europeo o americano). Sin embargo, entre ambos genotipos sólo hay 63% de identidad de aminoácidos.33 En el extremo opuesto, la GP5 es la proteína más heterogénea, con 88%–99% de identidad de aminoácidos entre cepas del mismo continente, y 52%–55% de identidad entre genotipos.33 En lo que respecta a las proteínas no estructurales (nsp, por sus siglas en inglés), codificadas por el ORF1a y ORF1b, hay publicaciones recientes que muestran que la nsp2 presenta una región de alta variabilidad (en las posiciones de aminoácidos 324 a 814) solamente con 40% de similitud de aminoácidos entre genotipos europeos y americanos, lo que representa el gen con la mayor tasa de variabilidad del PRRSV.36La alta variabilidad genética del PRRSV complica el desarrollo de una respuesta inmune efectiva entre las cepas heterólogas en reinfección. Constituye una de las principales limitantes en el desarrollo de vacunas, pues se ha observado que tras la vacunación no existe protección cruzada de 100% entre cepas heterólogas. Uno de los casos más representativos de este problema se presentó en Dinamarca, en 1996, donde se aplicó la vacuna a base de un virus atenuado de la cepa americana VR2332, y posteriormente se observó un brote de PRRSV con características atípicas. Cuando se analizó la secuencia de estos virus, la identidad fue de 99.3% y 99.5%, respecto al prototipo americano VR2332 y al vacunal.37 Este resultado indicó que la vacuna desarrolló un brote con el PRRSV e introdujo el genotipo americano al país. Actualmente se considera que en Dinamarca al menos 40% de las granjas están contaminadas con las cepas americana y europea.38
Respuesta inmune frente al PRRS
La respuesta inmune del cerdo frente al PRRSV es muy compleja y se deben considerar dos aspectos importantes que influyen en ella: alta variabilidad del virus y variabilidad en la respuesta de los cerdos infectados. Cuando estos últimos resultan con infección por el PRRSV inducen una inmunidad capaz de proteger en reinfecciones contra virus homólogos, e induce viremias prolongadas e infecciones persistentes.39 Estas características dan un panorama de la compleja interacción entre el PRRSV y la defensa de los cerdos al virus. Existen interrogantes sobre los eventos que inician la inmunidad durante la infección, así como del papel que desempeñan tanto los anticuerpos como las células T. Tampoco están claros los mecanismos moleculares y celulares involucrados en la regulación, inducción y maduración de la respuesta inmune. Además, aún faltan por esclarecer las consecuencias de la variabilidad genética del PRRSV, así como la variación genética de las diferentes poblaciones de cerdos frente al PRRSV en la respuesta inmune.39
La resistencia inicial que se presenta frente al PRRSV depende principalmente de la respuesta antiviral de las células infectadas y del sistema inmune innato en los primeros días antes del desarrollo de la respuesta adaptativa. El virus toma ventaja frente al cerdo al evadir en cierto grado la respuesta innata. Primeramente, el PRRSV infecta y se replica en algunas células que participan en la respuesta innata, como macrófagos y células dendríticas, importantes en el desarrollo de una respuesta inmune adecuada tanto innata como adaptativa.13,14,40 Otra característica importante del sistema innato frente a los virus es la producción de IFN tipo I (α/β), el cual induce la síntesis de una gran cantidad de proteínas antivirales, como es el caso de la proteína cinasa R, 2'–5' oligoadenilato–sintetasa, la adenosina–deaminasa específica de ARN, y de la proteína de mixoma (MxGTPasa), que inhiben la replicación viral y síntesis de proteínas virales.41 El PRRSV logra inhibir la expresión del IFN tipo I tanto in vivo como in vitro,42,43 pero la administración del IFN–α exógena inhibe la replicación del virus y favorece la respuesta humoral.44
En lo que respecta al perfil de citocinas proinfla–matorias, como el IFN–α, TNF–α e IL–1P, que son importantes en el inicio de una respuesta inflamatoria, la infección por el PRRSV inhibe la expresión de ARNm de estas citocinas.42–45 En experimentos in vitro utilizando macrófagos alveolares estimulados con acetato de forbol mirístico (PMA, por su siglas en inglés) e infectados con PRRSV, se observó una disminución en la expresión de ARNm de TNF–α.44 Mientras que los experimentos in vivo no logran detectar esta citocina (TNF–α) en los fluidos obtenidos de lavados broncoalveolares.42 Asimismo, se ha observado que el IFN–α es capaz de inhibir la replicación del PRRSV en cultivos de macrófagos alveolares; sin embargo, la expresión de esta citocina en lavados broncoalveolares fue mínima.43,45 Por lo anterior, se entiende que el virus logra, de alguna manera, modular la producción de INF–α en los macrófagos para asegurar su replicación en éstas y otras células. Se ha pensado que esta modulación puede ser a nivel de transcripción46 aunque otros estudios también sugieren que ésta se lleva a cabo al inhibir la síntesis de proteínas antivirales;47 sin embargo, es necesario realizar investigaciones para determinar el nivel al que actúa el PRRSV durante la inhibición del IFN tipo I. Se ha demostrado que al infectar células mononucleares con el PRRSV se induce la expresión de IL–10,48 la cual es una citocina antiinflamatoria que logra inhibir la expresión de la IL–1 y el TNF–α, y además participa en la diferenciación de células T reguladoras.49 La falta de una respuesta inflamatoria y la débil o nula respuesta antiviral (inducida por los IFN tipo I) crea un microambiente desfavorable en el desarrollo de la respuesta adaptativa.
La respuesta humoral frente al PRRSV se ha evaluado ampliamente. En suero de cerdos infectados se pueden encontrar anticuerpos IgM anti–PRRSV entre los días cinco y siete posinfección (PI); sin embargo, después de dos o tres semanas son indetectables.50–52 Posteriormente se detectan anticuerpos IgG entre los días siete y diez PI, con incremento entre la segunda y cuarta semanas.51,52 Los niveles de estos anticuerpos son detectables hasta 300 días PI a niveles bajos.53 Los anticuerpos anti–PRRSV del tipo IgA son detectados a partir de los 14 días PI con máximo a los 25 días hasta que desaparecen al mes, aproximadamente.51,52 Se ha informado que los AN aparecen a partir de la tercera semana PI;51,54 sin embargo, existen estudios que muestran la presencia de AN en la segunda semana PI (día 9).52 Esta respuesta temprana se presenta en algunos de los cerdos evaluados; sin embargo, a la tercera semana todos los cerdos muestran AN. Estas diferencias en la presencia de AN se debe a la variabilidad en la respuesta de los cerdos al PRRSV; de hecho, en algunos cerdos de otros estudios no es posible detectar niveles significativos de AN durante todo el ensayo.51,53 Sin embargo, los AN que se producen pueden permanecer durante periodos prolongados pero con títulos bajos.51, 52
Los primeros anticuerpos anti–PRRSV se dirigen contra la proteína N durante la primera semana PI.51,53 Recientemente se ha informado de evidencias de anticuerpos dirigidos contra varios epítopes lineares (formados por residuos de aminoácidos consecutivos incluidos en un mismo fragmento peptídico) y de conformación (constituidos por aminoácidos que, aunque están alejados en la secuencia primaria de la proteína, se aproximan cuando ésta se pliega para formar su estructura tridimensional) de la proteína nsp2 en la primera semana PI, y la respuesta fue más fuerte que la dirigida a la proteína N.55–58 Los anticuerpos contra la proteína N en las primeras semanas PI no tienen un efecto neutralizante. Estos anticuerpos se han relacionado con la diseminación del PRRSV en macrófagos, a través de un fenómeno conocido como incremento de la infección dependiente de anticuerpos (Antibody Dependent Enhancement, ADE, por sus siglas en inglés).59 A pesar de que existen anticuerpos no neutralizantes contra la GP5, también se pueden encontrar AN, éstos son los que se han relacionado principalmente con la neutralización del virus para ambos genotipos. Estos AN pueden ser detectados en algunos casos de manera temprana a partir del día 9 PI; sin embargo, generalmente se presentan a partir del día 28 PI.52 También se han detectado AN contra GP4, proteína M y en menor grado contra GP3.27,51,52,59
La participación de los AN en la protección contra el PRRSV se ha evaluado ampliamente, y existe cierta controversia respecto de su participación en la protección contra el PRRSV. Hay grupos que describen que éstos no participan en el control del virus, debido a que en cerdos que presentan un título elevado de AN fue posible aislar el virus de sangre. En el caso contrario, con un título indetectable de AN se logró resolver la viremia.60 Sin embargo, otros grupos han demostrado que la transferencia pasiva de AN a cerdas gestantes infectadas con PRRSV es capaz de bloquear la infección trasplacentaria.61 En otras palabras, los AN no son necesarios para la resolución de la viremia, son importantes para evitar la infección.
]]> La respuesta celular se puede evaluar mediante la producción de IFN–γ o células productoras de IFN–γ. En la respuesta celular inducida por el PRRSV se han evaluado ambos aspectos.La respuesta de células T específicas contra el PRRSV, analizadas mediante la proliferación de células mononucleares, aparece en la cuarta semana PI con un máximo a la semana siete y un declive entre las semanas 9 y 11.62 Sin embargo, otros estudios muestran que esta respuesta se detecta de manera débil a moderada a partir de la segunda semana PI, y se incrementa en la semana cuatro PI.63 Estas diferencias pueden deberse a la cepa del virus utilizada o a la variabilidad en la respuesta de los cerdos, que permitió clasificar la respuesta en tres niveles: bajo, intermedio y alto. En ambos casos, el fenotipo de células T secretoras de IFN–γ en respuesta al PRRSV parece consistir de linfocitos CD4+CD8+ de memoria y CD4+ cooperadoras.64,65
La expresión de IFN–γ se evaluó a nivel de transcritos en células de ganglios linfáticos, pulmón y sangre periférica de cerdos infectados con PRRSV. En todos los casos hubo expresión significativa de ARNm del IFN–γ; sin embargo, el IFN–γ producido no es suficiente o no es efectivo en la eliminación del virus debido a que también fue posible detectarlo en estos ganglios y tejidos.66 Al analizar las células productoras de IFN–γ específicas contra PRRSV (a través de ensayos de ELIspot) en sangre de cerdos infectados, se observó un número bajo de células productoras específicas, entre 50–100 células por cada 1 × 106 células en la primera semana PI; sólo fue posible detectar un número mayor de células durante una reinfección (400 por cada 1 × 106).67 Sin embargo, otros grupos de trabajo, como el de Ronald et al., observaron una producción significativa de IFN–γ en suero a las dos semanas PI. Ellos atribuyen esta producción temprana de IFN–γ a varios factores, entre ellos a la activación de células NK (las cuales hasta el momento no han sido evaluadas en la infección con PRRSV), a la cepa utilizada y a una activación policlonal de linfocitos, lo cual llevaría a una reducción en la disponibilidad de células capaces de responder.68
El papel de la inmunidad mediada por células en la eliminación del PRRSV no está totalmente definida; sin embargo, es importante en la eliminación completa del virus, pues la respuesta humoral sola no es capaz de eliminar a este último.
Vacunas contra el PRRSV
Cómo funcionan las vacunas: fundamentos básicos para una vacuna ideal
Por definición, las vacunas son productos formados con un microorganismo completo, atenuado o muerto, o fracciones de él, capaces de inducir una respuesta inmune protectora y duradera a dicho microorganismo. Su función es prevenir y controlar futuras infecciones.69 Para lograrlo, deben desencadenar una respuesta inmune protectora y además ser inocuas, es decir, incapaces de desencadenar una reacción adversa.69,70 Para que las vacunas puedan prevenir o controlar una enfermedad, tienen que estimular eficazmente el sistema inmunitario e inducir una memoria inmunológica.70 Se puede hacer una clasificación de las vacunas teniendo en cuenta la tecnología empleada en su diseño y producción.69
Las vacunas clásicas pueden ser vacunas inactivadas, vacunas atenuadas o vacunas de subunidades. Las primeras están compuestas por microorganismos completos o inactivados por medios físicos y químicos. Las vacunas atenuadas están formadas por microorganismos cuya virulencia se ha reducido utilizando diversos métodos como pases sucesivos en medios de cultivo, por métodos químicos, recombinación, etc. Las vacunas de subunidades contienen un preparado de fracciones antigénicas, ya sean lipopolisacáridos, proteínas purificadas o sintetizadas, extractos ribosómicos, etc. Este tipo de vacunas se emplea cuando se conocen los componentes responsables de la patogenicidad de un microorganismo.69 Los avances en biología molecular han permitido el desarrollo de nuevas vacunas que utilizan la manipulación genética, péptidos sintéticos, vacunas antiidiotipo (anticuerpos que reproducen la morfología de un antígeno).71
Vacunas atenuadas contra el PRRSV
]]> La vacuna más utilizada contra el PRRSV utiliza virus vivo modificado (MLV, por sus siglas en inglés), atenuado por pasaje múltiple en cultivo celular. En el caso del PRRSV, las vacunas atenuadas son más eficientes que las inactivadas debido a que inducen mayor respuesta celular y humoral; sin embargo, esta respuesta es insuficiente para proteger completamente contra la infección frente a virus heterólogos.72,73La vacunación de cerdos utilizando vacuna atenuada de tipo americano o europeo estimula la respuesta celular.65,73,74 Sin embargo, la proporción de células productoras de IFN–γ es muy baja (especialmente en cepas europeas) y su desarrollo muy lento si se compara con otras vacunas atenuadas como la del virus de Aujeszky, en la que la producción de células productoras de IFN–γ es de dos a cuatro veces mayor después de la vacunación.65,73,74 Por lo anterior, se afirma que la vacunación utilizando virus atenuados no es del todo eficiente, pues la respuesta celular medida por células productoras de IFN–γ tiene una evolución a partir del día 28 hasta el 42, en una proporción moderada pero significativa.74 En lo que respecta a la respuesta humoral que induce la vacuna de virus atenuado, los anticuerpos no neutralizantes aparecen en etapas tempranas de la infección y permanecen hasta por 96 semanas PI.75 Los AN sólo aparecen en algunos animales vacunados;65 sin embargo, algunos autores detectaron AN después de desafiar a cerdos vacunados.76
A pesar de lo anterior, varios experimentos han demostrado que el uso de la vacuna MLV reduce significativamente las lesiones y signos clínicos frente al desafío con cepas homólogas de PRRSV. Además, muestra una reducción en la proporción de cerdos infectados en forma persistente y en el tiempo de excreción viral utilizando cepas homólogas del virus vacunal.72,77 Sin embargo, es claro que la vacuna no previene la reinfección con cepas homólogas, sólo disminuye los signos de la enfermedad. Frente a cepas heterólogas, se presenta el mismo escenario pero la protección es menor. Un problema importante relacionado con la seguridad de esta vacuna es el hecho de que en algunos casos, los virus atenuados pueden revertirse a virulencia y ocasionar la propagación del virus en la población porcina.37
Vacunas inactivadas
La principal ventaja de las vacunas inactivadas es la debilidad de la mayoría de vacunas atenuadas, una de ellas es que no pueden revertir a la virulencia, pues utilizan virus muerto. Después de la vacunación no es posible, en ningún momento, detectar ARN viral en muestras de sangre o tejidos.78 Algunos autores han logrado cierto grado de protección en campo.79,80 Sin embargo, estudios más recientes que utilizan técnicas más precisas han obtenido respuesta nula frente al PRRSV. Nilubol et al. 78 y Zuckermann et al.,74 en cepas americanas y europeas, respectivamente, no encontraron incremento significativo en células productoras de IFN–y contra PRRSV, incluso después de desafiar a cerdos vacunados.
Las vacunas inactivadas de cepas americanas no son capaces de inducir una respuesta humoral; es decir, no son capaces de estimular la producción de AN.65 Aun cuando se observa un aumento de anticuerpos después del desafío, éstos no neutralizan.78 Sin embargo, las vacunas inactivadas de cepas europeas inducen una ligera producción de AN, aunque esto último no se refleja ni en la disminución de la viremia ni en la carga viral en tejidos.74
Alternativas de vacunas en campo
Las vacunas comerciales se han utilizado en gran número de granjas con resultados controversiales, lo cual puede deberse a la poca homología entre cepas (vacunal y de la granja), pues la protección cruzada es limitada.81 Ante este escenario se han instrumentado estrategias de control en las granjas, que se basan en el uso de sueros virémicos durante la aclimatación de las cerdas, en el pie de cría o en el simple contacto de animales enfermos con los animales que se pretende inmunizar.82–84 Shibata et al.85 mostraron que la exposición al virus de campo que circulaba en la granja, prevenía los signos clínicos de la enfermedad y observó disminución en los títulos de infección, así como su duración al integrar estos animales inmunizados con el resto.84,86 Esta estrategia se sigue utilizando y ayuda a controlar la diseminación de reinfección en la granja. Sin embargo, este método de exposición conlleva algunos riesgos; por ejemplo, el suero utilizado para la aclimatación puede contener algún otro patógeno, por lo que el lugar donde se lleva a cabo la aclimatación debe estar lo suficientemente lejos para prevenir reinfecciones en la granja o la introducción de nuevas cepas.86
Mejoras a las vacunas convencionales
En la mayoría de los casos la protección conferida por las vacunas convencionales no es eficaz en la prevención de la infección. Por esta razón se han desarrollado nuevas alternativas para mejorar la respuesta inducida por las vacunas. Básicamente se ha buscado aumentar la respuesta celular, la producción de AN y, además, fomentar la respuesta entre las cepas heterólogas. Una de las estrategias utilizadas para mejorar las vacunas convencionales consiste en la administración de citocinas recombinantes como adyuvantes.
]]> Se han utilizado citocinas que son importantes en el desarrollo de la respuesta celular, es el caso de la interleucina–12 (IL–12) y el IFN–α.87 La IL–12 induce la diferenciación de los linfocitos T vírgenes a linfocitos Th1 y se ha comprobado que el IFN–α induce un estado antiviral en las células. Cuando se utiliza la IL–12 como adyuvante existe un aumento significativo en las células productoras de IFN–γ; sin embargo, el desarrollo de AN es nulo.73,76 Al evaluar el IFN–α, se observó que su comportamiento fue similar al de IL–12, ya que induce sólo aumento de la respuesta celular; sin embargo, éste fue temporal.65,73,76 En ambos casos el aumento de IFN–γ no se refleja en disminución de la viremia o en la sintomatología.Foss et al.88 probaron la IL–1, IL–6 y la toxina del cólera como adyuvantes, debido a que son agentes de inducción de la respuesta inflamatoria en cerdos e importantes en la presentación de antígenos; sin embargo, sólo la toxina del cólera resultó buen adyuvante. La toxina del cólera indujo la producción de AN específicos contra ORF5, pero no estimuló la respuesta celular. Otra estrategia utilizada son los oligodeoxinucleótidos, éstos son polímeros sintéticos con secuencias ricas en los nucleótidos citocina y guanidina, que se utilizan como inmunoestimuladores.89,90 Este adyuvante indujo la producción de AN, así como ligero aumento en las células producto de IFN–γ. Incluso, se observó reducción en algunos de los signos de la enfermedad, como insuficiencia respiratoria.
Se han llevado a cabo varios intentos para evaluar la respuesta entre cepas heterólogas para disminuir el efecto debido a la gran variabilidad genética del PRRSV. Se han utilizado la combinación de vacunas atenuadas e inactivadas. Sin embargo, no se obtuvieron resultados satisfactorios pues hubo disminución de las células T efectoras y supresión de la respuesta humoral.91
Charerntantanakul et al.76 utilizaron vacunas atenuadas y evaluaron la respuesta inmune a péptidos de ORF5 de varias cepas, por la importancia de la GP5 en la inducción de AN. Sin embargo, esta adición no indujo mejoría clínica, aumentó ligeramente la respuesta celular sin incrementar la producción de anticuerpos. A pesar de todas las instrumentaciones de vacunas atenuadas o muertas, no se ha encontrado un adyuvante o estrategia adecuada para promover la prevención de la infección por el PRRSV; por tanto, es necesaria una nueva generación de vacunas con mayor seguridad y eficacia protectora para controlar el PRRS.
Vacunas de nueva generación: una alternativa para PRRSV
Se han evaluado varios sistemas de expresión de antígenos de PRRSV incluyendo bacterias,62,92,93 bacoluvirus,94 vacunas de ADN,95,96 adenovirus97,98 y el sistema del virus de Ankara (MVA, por sus siglas en inglés)99 en busca de una alternativa para mejorar la respuesta inmune contra el PRRSV o para utilizarse como vacunas. Se han utilizado bacterias como Salmonella typhymurium y el bacilo de calmette–Guérin (BCG) de Mycobacterium bovis como vectores en la expresión de la GP5 y la proteína M del PRRSV, utilizando ratones como modelo de estudio.93,100 En el caso donde se utiliza el BCG, sólo se logró la expresión de GP5 después de remover los primeros 30 residuos hidrofóbicos de la glicoproteína. La GP5 y la proteína M se expresaron en la membrana de Mycobacterium y se detectaron anticuerpos anti–GP5 y proteína M, también se detectaron células productoras de IFN–γ específicas del PRRSV en esplenocitos. Sin embargo, la respuesta en cerdos podría variar.101 Cuando se utilizó una cepa atenuada de S. typhymurium para evaluar la respuesta a la GP5 del PRRSV, se utilizó un plásmido que codificaba a la GP5, contenido en cepas de S. typhimurium. Sin embargo, en este caso la utilización de S. typhimurium como vector de expresión no marcó ninguna diferencia respecto a la utilización de ADN desnudo (plásmido que contiene la región que codifica a la GP5), resultando en ambos casos en una respuesta humoral y celular prácticamente nulas.100
También se ha evaluado el uso de virus como vectores de expresión para las proteínas GP5 y M del PRRSV en cerdos. Al virus de la seudorrabia (PRV, por sus siglas en inglés, causante de la enfermedad de Aujeszky) como vector de expresión, se le insertó la secuencia de la GP5 en el PRV y se obtuvo una vacuna doble dirigida al virus de Aujeszky y GP5–PRRSV. Esta vacuna redujo los daños causados por el virus en pulmón en cerdos infectados; sin embargo, no se detectaron niveles de AN.102,103 En contraste con estos resultados, cuando se utilizó el baculovirus (expresando el heterodímero GP5–M) en un modelo murino, se detectó un título alto de AN anti–GP5 y células productoras de IFN–γ. Sin embargo, la producción de IFN–γ no fue específica del PRRSV pues el baculovirus que no contenía el heterodímero GP5–M usado como testigo, indujo un nivel de células productoras de IFN–γ similar.104 El virus de la viruela aviar también se ha utilizado como vector de expresión para PRRSV dirigido al heterodímero GP3/GP5 e incluyendo como adyuvante la IL–18 porcina en el plásmido.105 El potencial del virus de la viruela aviar como vacuna para PRRSV ofrece resultados alentadores.106 Utilizando este modelo en cerdos se observó una reducción de la carga viral en pulmones y algunos ganglios, se detectaron títulos bajos de AN durante las primeras semanas PI, que aumentaron de manera significativa a los 56 días PI. También se observó aumento de linfocitos CD4+ y CD8+, y a pesar de encontrarse un gran número de células productoras de IFN–γ se cuantificó un aumento de IFN–γ por ELISA en suero.105 Además del virus de la viruela aviar se utilizó un virus recombinante de viruela modificado, conocido como virus de Ankara, el cual es un excelente sistema de expresión como vacuna.99 En este caso se expresó el heterodímero GP5/proteína M en modelo murino. Se obtuvieron AN a partir de la tercera semana posinoculación, pero con un título muy bajo, en la séptima semana posinoculación aumentó el título de AN. Este sistema indujo en los ratones ligera y tardía producción de IFN–γ, que se detectó a partir del día 30 posinoculación y se mantuvo hasta el día 90.99
Los adenovirus (Ad5) son excelentes sistemas para la expresión de genes de interés en el desarrollo de vacunas.107 Por ello también se han utilizado en el diseño de vacunas contra el PRRSV. Algunas de las construcciones que se han evaluado incluyen el Ad5 expresando GP5, la proteína M y su combinación (GP5–M). El constructo que expresaba el heterodímero GP5–M indujo un título mayor de AN y mayor proliferación de linfocitos específicos anti–PRRSV.98 Posteriormente se probaron otros constructos evaluando las combinaciones de las GP que inducen la producción de AN, GP3–GP5, GP4–GP5 y GP3–GP4–GP5.108 En el desarrollo de AN, la GP5 fue un común denominador al igual que en la mayoría de las construcciones que no son de Ad5, debido a su importancia inmunogénica. Se observaron AN contra todos los constructos; sin embargo, no fue posible determinar hacia qué GP eran dirigidos, debido a la falta de proteínas recombinantes de su especificidad (GP3, GP4 y GP5). Estos anticuerpos fueron detectados a partir de los 14 días PI, al igual que la proliferación de linfocitos PRRSV específicos para todos los constructos.108 Una de las ventajas del sistema de Ad5 sobre los otros sistemas utilizados consiste en que la expresión se lleva a cabo en células eucarióticas, lo cual hace que la conformación de la proteína sea similar a la del virus, facilitando la exposición de los epítopes neutralizantes. Sin embargo, para el caso de la GP5 el epítope "natural" pudiera no estar expuesto, debido a que el virión forma un heterodímero con la proteína M. Esta respuesta se observa si se compara la de los Ad5 que expresan GP3 y GP4, cuando se coadministra el constructo con la GP5 y no hay ningún aumento en esta respuesta.108
Además de los vectores usados para la expresión de las proteínas del PRRSV, recientemente se han utilizado las vacunas de ADN. Lo que distingue a estas vacunas de otras es la expresión de su naturaleza física.
]]> Las vacunas de ADN están compuestas de un plásmido de ADN que codifica para alguna proteína o fracción de interés y no son infecciosas.109 Las vacunas de ADN tienen algunas características que les confieren ciertas ventajas frente a las convencionales, entre ellas la facilidad de producción, bajo costo, estables al calor, etc.110 Las vacunas de ADN han demostrado inducir anticuerpos séricos y una fuerte respuesta de células T cooperadoras y citotóxicas contra varios antígenos: virus, bacterias, parásitos y algunos tumores.En vacunas de ADN contra el PRRSV se han evaluado todos los ORF del PRRSV en distintos plásmidos.95,96,111,112 Barfoed et al.112 caracterizaron la contribución de cada proteína viral en el desarrollo de una respuesta protectora. Sólo se encontró una respuesta de anticuerpos en los cerdos vacunados con el plásmido que contenía el ORF7 después del desafío con una cepa homóloga del PRRSV; sin embargo, esta es la proteína más inmunogénica del virus y contra la cual se crean anticuerpos en la etapa inicial de la infección.53 También se observaron anticuerpos dirigidos a Nsp2 y GP4 tras la inoculación; sin embargo, después de retar a los cerdos con una cepa del PRRSV no se observó ninguna respuesta específica.112 Una de las razones probables para la falta de respuesta ante la vacunación con GP2, GP3, GP5 y GP6, pudo ser la estrategia de inoculación (pistola de genes y el plásmido cubierto de partículas de oro), además en ningún momento se evaluó la expresión de las proteínas virales en el cerdo.112 Estos resultados coinciden con los de otros autores para el caso de la proteína N (plásmido con ORF7); sin embargo, ellos sí encontraron respuesta en la sueroneutralización para la GP5 y GP6.95
Debido a que los AN van dirigidos en su mayoría a la GP5, se han probado vacunas de ADN contra la GP5 del virus; pero éstas no producen AN, lo que confirma la importancia de la conformación de esta proteína.111 Lo anterior se ha comprobado al desarrollar nuevas vacunas mediante el uso de vectores, como el adenovirus, que expresan la GP5 y desarrollan AN, aunque su desarrollo es débil y lento.97,113 Además de estos resultados, se demostró que la GP5 formaba dímeros con la proteína M en las partículas virales,32 por lo que se han dirigido algunas investigaciones al desarrollo de vacunas de ADN que expresan este heterodímero (GP5–proteína M).96,99,114,115 Los resultados obtenidos con estas vacunas muestran que existe mayor producción de AN que cuando se utiliza la GP5 o la proteína M individualmente. El uso de este heterodímero desarrolla una respuesta similar a la descrita antes con el uso del baculovirus, seudorrabia, adenovirus, etc., que consiste en la producción de AN, la cual se desarrolla de manera lenta y débil a partir de la sexta semana.95,97,101,116 Por otra parte, la respuesta de células T específicas es alta, pero se desarrolla entre la sexta y octava semanas PI.114
La GP5 de la cepa americana contiene dos epítopes en el extremo N terminal que producen anticuerpos; sin embargo, sólo uno de ellos es neutralizante, mientras que el otro funciona como señuelo que provoca la reducción de AN, lo cual se observa en la respuesta a la infección por PRRSV nativa y en vacunas. Fang et al.117 determinaron si el efecto del epítope señuelo puede ser reducido o eliminado, con este propósito se insertó, entre el epítope neutralizante y el señuelo, una secuencia de aminoácidos conocida como PADRE (Pan DR helper T cell epitope). Ésta consta de los aminoácidos: AKFVAAWTLKAA,118 y favorece la respuesta de AN y producción de IFN–γ.119–121 Los resultados de Fang et al.117 muestran que en ratones, la producción de AN es mayor y más rápida con la vacuna de ADN, en donde la secuencia de la GP5 contiene la secuencia PADRE, comparada con la que tiene la GP5 sin modificaciones. Sin embargo, estos resultados pueden deberse a la función de la secuencia PADRE como adyuvante y no por la interrupción del epítope señuelo en la secuencia de la GP5.117
Para mejorar la respuesta de las vacunas de ADN también se ha estudiado la administración de citocinas. Se ha utilizado IL–2 e IFN–y por su importancia en la proliferación celular y la actividad de los linfocitos. Xue et al.122 encontraron que la administración de estas citocinas como adyuvantes en vacunas de ADN que codifican para ORF5 y ORF7, protegen al cerdo de las lesiones pulmonares características de PRRSV. También se observó reducción en cierto grado de la replicación del virus. Sin embargo, estos resultados son parciales debido a que el efecto protector fue sólo en 33% de los animales cuando se utilizó la IL–2 y en 66% de los animales con el IFN–γ. Rompato et al.123 estudiaron el efecto de la IL–2 e IL–4 en el desarrollo de la respuesta inmune inducida por una vacuna de ADN que codifica ORF7, utilizando el vector de expresión phCMV. Los resultados demuestran que la IL–2 induce una respuesta celular específica, mientras que IL–4 parece tener un efecto supresor en este tipo de respuestas. Estos datos también sugieren que ORF7 puede participar en la reducción de la carga viral de los animales infectados con PRRSV, esto último coincide con otros autores.122
Una alternativa para mejorar las vacunas de ADN contra PRRSV es el procesamiento y presentación de antígenos a través de la conjugación de la ubiquitina con la GP5 en un plásmido. En este caso la proteína expresada junto a la ubiquitina se dirigió al proteosoma para ser degradada, con lo que se favorece el procesamiento y la presentación, pues los antígenos degradados por esta vía facilitan su presentación vía MHC I, y permiten la repuesta celular. Hou et al.124 determinaron la respuesta inmune de cerdos vacunados con un plásmido que expresaba la GP5 conjugada a la ubiquitina porcina. Se observó aumento en la expresión IFN–γ, disminución de la carga viral en sangre después del desafío de cerdos y disminución en el número y severidad de lesiones en pulmón de los cerdos desafiados, respecto de los testigos (vacuna sin la conjugación a ubiquitina y el del plásmido libre de GP5 y ubiquitina). Sin embargo, la respuesta de anticuerpos fue nula, probablemente debido a la rápida degradación intracelular de la proteína ubiquitina–GP5, sin dejar un nivel de proteína suficiente para la interacción con linfocitos B.
Recientemente surgió una nueva estrategia en el desarrollo de vacunas, basada en la manipulación del genoma viral para introducir modificaciones específicas para crear virus mutantes genéticamente modificados: clonas infecciosas. El desarrollo de éstas se describe como la formación de ADN complementario a partir del virus, bajo el control de un promotor.125 La importancia de las clonas infecciosas en el desarrollo de una vacuna contra el PRRSV radica en el hecho de dirigir cambios específicos en el PRRSV y con ello determinar la participación de alguna proteína o de algún aminoácido específicos en la infección, unión a receptores, etc. Actualmente se cuenta con clonas infecciosas de prototipo americano y europeo. Se han evaluado modificaciones puntuales en los sitios necesarios para formar el heterodímero GP5–proteína M, se encontró que la cisteína 23 de la proteína N es indispensable para formar un homodímero, el cual está estrechamente ligado a la infectividad del PRRSV, mutaciones en el epítope neutralizante de GP5, produciendo cepas sin capacidad de infección.125 Además, con esta tecnología se han desarrollado virus quiméricos que amplían el conocimiento de los factores importantes para la virulencia, atenuación, patogenicidad e inmunogenicidad. Wang et al.126 utilizaron una cepa altamente patógena del PRRSV (aislado MN184) y un virus vacunal (a base de virus vivo modificado), para desarrollar virus quiméricos. Uno de éstos contenía ORF1a y 1b de la cepa vacunal y las proteínas estructurales de la cepa patógena y viceversa. Se utilizaron estos virus quiméricos como vacunas y después del reto con PRRSV, disminuyeron las lesiones en los pulmones, el desarrollo de los AN presentó un incremento más oportuno y ligeramente mayor que en las cepas originales.126
Conclusiones
La aparición del PRRSV trajo consigo un gran problema para la industria porcina debido a las cuantiosas pérdidas económicas que causa. Como consecuencia de lo anterior se ha trabajado en el desarrollo de vacunas y estrategias de control del virus en el campo. Actualmente se comercializan dos vacunas que involucran virus atenuado e inactivado. Aunque estas vacunas han sido ampliamente utilizadas en el campo, los estudios realizados analizando la respuesta inmune, muestran que éstas son ineficientes para prevenir la infección. Sin embargo, en algunas granjas han tenido buenos resultados en el control de la enfermedad; no obstante la vacuna comercial de virus vivo modificado PRRSV al utilizarse en granjas ha introducido nuevas cepas de virus. Tal fue el caso en Dinamarca, en 1996, pues el virus al estar sólo atenuado puede provocar infección en los cerdos. La falta de control del PRRSV en la mayoría de las granjas infectadas ha provocado que se desarrollen estrategias alternas para el control de la enfermedad. Sin embargo, estas estrategias, aun cuando ayudan en el control de la enfermedad no resuelven el problema de raíz. Por ello se crearon nuevos prototipos de vacunas que incluyen vacunas de ADN, diferentes sistemas de expresión de antígenos de PRRSV, desarrollo de clonas infecciosas, etc. Todas estas estrategias han contribuido al conocimiento de distintos antígenos que inducen un título alto de AN, así como un número significativo de células productoras de IFN–γ; también se han localizado los epítopes que favorecen estas respuestas. Sin embargo, a pesar de los adelantos logrados aún no se cuenta con una nueva vacuna contra el PRRSV que logre una respuesta óptima contra el virus. Por esta razón deben explorarse nuevas estrategias, tanto en el uso de nuevos vectores como en las cepas del virus, las proteínas o péptidos involucrados, como respuesta, con la finalidad de desarrollar una vacuna más eficaz y segura.
]]>Agradecimientos
Este trabajo recibió el apoyo de Fondos Sectoriales SEP–Conacyt, proyecto número 82850.
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