Neospora caninum: Detección de ADN en sangre durante la primera gestación de vaquillas infectadas naturalmente

Neospora caninum: DNA detection in blood during first gestation of naturally infected heifers

Omar Iván Santana* Carlos Cruz–Vázquez* Leticia Medina–Esparza* Miguel Ramos Parra* Ciro Castellanos Morales** Daniel Quezada Gallardo**

* Instituto Tecnológico El Llano Aguascalientes, Km 18, carretera Aguascalientes–San Luis Potosí, El Llano, Aguascalientes, Apartado Postal 74–2, Apartado Postal 2, C. P. 20041, Aguascalientes, Aguascalientes, México, Tel. (449) 9161251, correo electrónico: cruva18@yahoo.com.mx

** Agropecuaria Tepetatillo, S. A. de C.V., km 30, carretera Aguascalientes–San Luis Potosí, 20330, Aguascalientes, México.

Recibido el 26 de junio de 2009.
Aceptado el 12 de abril de 2010.

Abstract

The aim of the study was to detect the DNA presence of N. caninum in naturally infected animals, at two moments of their first gestation and at parturition, as well as to record the presentation of abortions. Twenty females between 12 to 14 months of age, seropositive to ELISA test, were selected from a dairy farm with presence of this parasitosis. The females were artificially inseminated and blood samples were taken in the first and second third of gestation and during parturition; DNA was isolated and it was analyzed by a single tube nested PCR with specific primers. In the sampling corresponding to the first third of gestation, 7/20 positive cases were observed (35%), in the second 15/20 (75%) and during parturition 10/20 positive cases (50%). From the total of the animals included in this study, three stayed negative to the test in the three samplings (15%), four were always positive (20%), eight were positive in the second sampling but negative in first (40%) and five were positive in the second and negative in first and the third sampling (25%). All animals remained seropositive during the study; four aborted in the last third of gestation. All the live born calves were seropositive to N. caninum.

Key words: Neospora caninum, DNA, blood, PCR, dairy herd, Mexico.

Resumen

El objetivo del trabajo fue detectar la presencia de ADN de N. caninum en animales infectados naturalmente, en dos tiempos de su primera gestación y al parto, así como registrar la presentación de abortos. Se seleccionó, en un establo, con presencia de parasitosis, un lote de 20 hembras de entre 12 y 14 meses de edad, seropositivas en ELISA, las hembras fueron inseminadas artificialmente y se tomaron muestras de sangre en el primero y segundo tercios de gestación y al parto; se aisló ADN y se sometió a PCR anidado en un solo tubo con iniciadores específicos. En el muestreo correspondiente al primer tercio de la gestación, se observaron 7/20 casos positivos (35%), en el segundo 15/20 (75%) y al parto 10/20 casos positivos (50%). De los animales incluidos en el estudio, tres se mantuvieron negativos a la prueba en los tres muestreos (15%), cuatro fueron siempre positivos (20%), ocho fueron positivos en el segundo muestreo pero negativos en el primero (40%) y cinco fueron positivos en el segundo y negativos en el primero y tercero muestreos (25%). No se presentó seroconversión en ningún animal durante el estudio; cuatro de ellos presentaron aborto en el último tercio de gestación. Todas las crías nacidas vivas resultaron seropositivas a N. caninum.

Introducción

La neosporosis bovina constituye una enfermedad causada por un parásito Apicomplexa, Neospora caninum, que puede provocar abortos entre el tercero y noveno meses de gestación, aunque es más común que suceda entre el quinto y sexto meses; afecta principalmente al ganado lechero y se considera importante causa de aborto en Europa, Sudáfrica, Japón, Australia, Nueva Zelanda y diferentes países de América, incluyendo México.^1–5

La transmisión de la parasitosis se realiza mediante dos formas: la transmisión vertical (endógena), de una madre infectada a su feto, y la transmisión horizontal (exógena), en la cual el bovino debe ingerir alimento o agua contaminados con ooquistes esporulados del parásito, que excreta el perro, principal portador definitivo de N. caninum.

La transmisión vertical se reconoce como responsable de la perpetuación de la infección en el hato.^4–7 En vacas infectadas de forma crónica, la transmisión al feto durante la gestación sucede como consecuencia del recrudecimiento de la infección latente, debido a la inmunodepresión generada por la gestación;^8–10 la parasitemia consecuente permite que las formas infectantes del parásito invadan la placenta y diferentes tejidos fetales. En estos casos, generalmente la cría nace infectada pero clínicamente sana, aunque el aborto también puede presentarse.^4,11–13

El diagnóstico de la neosporosis bovina se puede realizar en el ganado mediante diferentes técnicas serológicas indirectas, como el inmunoensayo enzimático (ELISA) y la inmunofluorescencia indirecta, mientras que en los fetos abortados se usan métodos de detección directos, como la histopatología, la inmunohistoquímica y recientemente las pruebas de PCR, utilizando principalmente cerebro, corazón e hígado, que son los órganos comúnmente más afectados;^7,14 asimismo, se ha informado que mediante PCR es posible detectar ADN del parásito en leucocitos, linfocitos y sangre, lo cual demuestra la presencia del parásito de manera directa en animales vivos con infecciones naturales o experimentales.^15–18

El objetivo del presente trabajo fue detectar la presencia de ADN de N. caninum mediante PCR anidado en un solo tubo, en animales naturalmente infectados en dos momentos de su primera gestación y al parto, así como registrar la presentación de abortos.

El estudio se realizó en un establo lechero ubicado en Aguascalientes, México, que se localiza en la región centro–norte de México; el establo mantiene a los animales alojados en corrales abiertos bajo el sistema de estabulación libre con ganado Holstein,¹⁹ y la alimentación consiste en una ración integral que incluye silo de maíz, alfalfa, mezcla de granos y complementos minerales; este establo ya había sido registrado como seropositivo y con abortos asociados a N. caninum.^3,20

Se seleccionó un lote de 20 vaquillas de entre 12 y 14 meses de edad, seropositivas en la prueba de ELISA que detecta IgG específicas a N. caninum; aquélla se mediante el uso del paquete comercial Herd Check anti–N. caninum* con sensibilidad de 100% y especificidad de 98.9%, de acuerdo con el fabricante, siguiendo el procedimiento recomendado por este último. La prueba se trabajó con una sola dilución de suero (1:100), para detectar positivos y negativos; los sueros se corrieron pareados y el punto de corte fue de 0.50, considerándose como positivos los que tuvieran lecturas medias > 0.50. Estos animales fueron inseminados artificialmente en fechas posteriores a su selección para el presente estudio.

Las muestras de sangre recolectadas sin anticoagulante, se procesaron para obtener el suero mediante centrifugación a 1 000 g durante 15 min, el cual se recuperó y almacenó a –20°C hasta su uso. Estas muestras fueron procesadas mediante ELISA, como se describió anteriormente, con la finalidad de registrar el valor de las densidades ópticas (DO), presentes en los tres muestreos para cada animal incluido en el estudio.

Las muestras de sangre, con anticoagulante, se procesaron para extraer ADN utilizando el paquete comercial Ultraclean DNA BloodSpin,*** siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras de ADN se sometieron a una PCR anidada en un solo tubo, similar a la descrita por Ellis et al.,²¹ utilizando testigos positivos y negativos previamente definidos.³ La concentración de ADN en cada muestra fue verificada por espectrómetro UV y en los ensayos de PCR se usaron 5 μl de la muestra con 2 μg de ADN. Los productos de la amplificación se analizaron en geles de agarosa al 2.5%, corriendo en cada gel un marcador de peso molecular† para estimar el peso del producto amplificado; los geles fueron teñidos con bromuro de etidio y visualizados en una lámpara de luz UV. Se consideró como resultado positivo aquel que mostrara un producto de 146 pares de bases.

Se aplicó una prueba de Ji cuadrada (P < 0.05) para comparar las proporciones de positivos y negativos a la prueba de PCR anidado en cada muestreo.

Los 20 animales incluidos en el estudio se mantuvieron como seropositivos durante el periodo de seguimiento, aunque presentaron fluctuaciones en los valores de DO en los diferentes muestreos; sin embargo, el correspondiente al segundo tercio de la gestación presentó los valores de DO más elevados en la mayoría de los animales (Cuadro 1).

La detección de ADN en sangre fue intermitente entre los animales y entre los muestreos (Cuadro 2), por lo que fue posible determinar que en el muestreo correspondiente al primer tercio de la gestación se observara 35% (7/20) de casos positivos; en el segundo muestreo, se observó 75% de casos positivos (15/20), y en el muestreo realizado al momento del parto, 50% (10/20) de casos positivos; se detectaron diferencias (P < 0.05) entre los muestreos. De los 20 animales incluidos en el estudio, tres se mantuvieron negativos a la prueba de PCR anidado en los tres muestreos (15%), cuatro fueron siempre positivos (20%), ocho fueron positivos en el segundo muestreo pero negativos en el primero (40%) y cinco fueron positivos en el segundo y negativos en el primero y tercero muestreos (25%).

El aborto se presentó únicamente en cuatro animales, en todos los casos sucedió en el último tercio de la gestación; en dos de estas vacas se detectó ADN en los tres muestreos y en una más en el segundo tercio de la gestación y al momento del parto (Cuadro 2); no fue posible contar con muestras de suero sanguíneo de los fetos abortados para determinar la presencia de anticuerpos anti–N. caninum. Todas las crías nacidas vivas fueron seropositivas.

Los resultados observados en el lote bajo estudio permiten inferir presencia de formas infectantes de N. caninum circulando por el cuerpo de los animales, lo cual indica que el fenómeno de reactivación de la infección durante la gestación en animales crónicamente infectados se presenta de forma dinámica desde el primer tercio de gestación, aunque no de forma continua; otros autores^15,16 observaron una situación similar en animales de dos años de edad. Anteriormente este fenómeno sólo era evidente en animales vivos por la elevación en el título de anticuerpos, situación que se presenta particularmente en el segundo tercio de la gestación,^4,5 y que se relaciona con aumento en la multiplicación del parásito, y como indicio de la transmisión vertical, así como de la probabilidad de aborto.²²

Diversos estudios informan que los abortos por N. caninum suceden con mayor frecuencia entre el quinto y sexto meses de gestación; es decir, en el segundo tercio de ésta, periodo durante el cual se ha observado detrimento de la inmunidad mediada por células, lo cual parece favorecer la reactivación de la infección.^4,8–10 En el presente estudio, en el muestreo correspondiente a ese periodo, se detectó ADN del parásito en 75% de los animales; de igual forma, en este periodo se detectaron los valores de DO más altos del estudio en la mayoría de los animales; en la literatura se reconoce que la probabilidad de abortar en el segundo tercio de la gestación es mayor que en otras etapas,^5,23 mientras que en otro estudio se informa que en dicha etapa es posible encontrar 0.155 ng de ADN del parásito en sangre por cada 1 ng de genoma bovino, ello representa dos veces más que el encontrado en la etapa temprana de gestación.¹⁶

Por otra parte, los valores de DO altos se asocian con mayor parasitemia, y son consecuencia de mayor producción de anticuerpos, los cuales pueden ayudar a proteger del aborto,^9,24 ya que animales sanos no producen anticuerpos específicos.¹⁷ En el presente estudio, los cuatro animales que presentaron aborto lo hicieron en el último tercio de la gestación y sólo uno de ellos fue negativo a la presencia de ADN al momento de presentarse el aborto, aunque sus valores de DO fueron elevados; el aborto por N. caninum puede presentarse a partir de los tres meses de gestación,^4,5 y se ha observado que alrededor del momento en que ocurre el aborto es posible detectar ADN en sangre.^15,16 El estado endémico de la infección por N. caninum conlleva a la presentación de baja proporción de abortos, pero éstos se pueden desencadenar por factores asociados con la idiosincrasia de cada animal.^4,5,24

En conclusión, el presente estudio permitió detectar la presencia de ADN de N. caninum en circulación sanguínea en diferentes momentos de la gestación en vaquillas infectadas naturalmente de forma crónica, lo que demostró que el fenómeno de reactivación de la infección se puede presentar desde el primer tercio de la gestación como un mecanismo utilizado por el parásito para realizar la infección del feto y, finalmente, provocar abortos.

Agradecimientos

Se agradece a la Dirección General de Educación Superior Tecnológica, de la Secretaría de Educación Pública, por el financiamiento otorgado para la realización de este trabajo.

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Notas

* IDDEX Laboratories, Inc., Westbrook, Maine, Estados Unidos de América.

** Venoject, Terumo Europe N.V, Bélgica.

*** MO BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, California, Estados Unidos de América

† Phix 174 DNA Promega Co., Madison, Wisconsin, Estados Unidos de América.