La lipofección incrementa la eficiencia de mutagénesis dirigida en células troncoembrionarias de ratón E14 TG2a

Lipofection improves gene targeting efficiency in E14 TG2a mouse embryonic stem cells

Sandra M. López–Heydeck* Marcos Cajero–Juárez** Rogelio A. Alonso–Morales*** José S. Martínez–Castañeda* José F. Robles–González* Alberto Barbabosa–Pliego* Juan C. Vázquez–Chagoyán*

* Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma del Estado de México, Autopista Toluca–Atlacomulco, Km 15.5, Toluca, Estado de México, México, Tele/Fax: (01–722) 2968980.

** Centro Multidisciplinario de Estudios en Biotecnología, Universidad Michoacana San Nicolás de Hidalgo, Carretera Morelia–Zinapécuaro, Km 9.5, Colonia La Palma, Tarímbaro, Michoacán, México, Telefax: (01–443) 2958029.

Correspondencia:
Telefax: (01–722) 2965555,
Correo electrónico: jcvc@uaemex.mx

Recibido el 9 de octubre de 2007
Aceptado el 22 de agosto de 2008.

Abstract

Key words: gene targeting, homologous recombination, mouse embryonic stem cells, transfection, electroporation, lipofection.

Resumen

Durante los últimos 15 años se ha demostrado que la electroporación representa el método ideal para la transfección de células troncoembrionarias de ratón; sin embargo, demanda grandes cantidades de ADN y células, así como equipo caro y delicado, ello hace que este proceso sea costoso y laborioso. La lipofección es un método de transfección que requiere menos de células y ADN que la electroporación; asimismo, ha probado ser eficiente en gran número de líneas celulares. Se ha demostrado que después de lipofectar células troncoembrionarias de ratón, éstas mantienen su pluripotencia y son capaces de formar quimeras de línea germinal y se transfectan con mayor eficiencia que con electroporación, pero no se ha notificado la mutagénesis dirigida mediante la lipofección de células troncoembrionarias de ratón. El objetivo del presente trabajo fue saber si la lipofección puede ser utilizada con la misma o mayor eficiencia que la electroporación para los protocolos regulares de mutagénesis dirigida; en este contexto, se compara la eficiencia en mutagénesis dirigida entre estas técnicas en células troncoembrionarias de ratón E14TG2a, utilizando un vector de reemplazo. Entre las células transfectadas no se hallan diferencias en la eficiencia en mutagénesis dirigida entre grupos; sin embargo, los resultados que aquí se ofrecen muestran que la lipofección es tres veces más eficiente en la transfección, lo cual indica que la lipofección es un método alternativo menos costoso para obtener mutagénesis dirigida en células troncoembrionarias de ratón.

Palabras clave: mutagénesis dirigida, recombinación homóloga, células troncoembrionarias de ratón, transfección, electroporación, lipofección.

Introducción

Las células troncoembrionarias de ratón (TEr) se han usado para generar mutagénesis dirigida en ratones transgénicos desde hace más de 15 años, pues son muy importantes para la elaboración de diversos modelos biológicos para el estudio de enfermedades humanas, para desarrollos biotecnoló–gicos y para la biología del desarrollo.^1–4

Aunque se han probado algunas otras técnicas para transfectar células TEr para los protocolos de mutagénesis dirigida, la electroporación es el método elegido debido a los buenos resultados que obtiene. En la electroporación bajo condiciones tradicionales, las células son suspendidas en un medio acuoso junto con el transgen para someterlas a descarga eléctrica de algunos cientos de milivoltios, a un umbral acorde con la composición de la bicapa lipídica de la membrana celular de las células TEr. Estudios in vitro con membranas artificiales muestran que los potenciales transmembrana producidos generan gradientes de campo locales en la interfase agua–lípidos, formándose canales de agua con el ADN en suspensión; las cabezas de lípidos de la capa externa son invaginadas hacia las cabezas de lípidos de la capa interna formando poros por donde penetra el agua con ADN y se origina un complejo de ADN/membrana.⁵ Esta técnica tradicional tiene la desventaja de que constituye un proceso laborioso e intensivo debido a que requiere gran cantidad de células (> 10⁷) y de ADN (20 μg) por evento de transfección; asimismo, tiene baja frecuencia absoluta de mutagénesis dirigida, como consecuencia de alta mortalidad celular durante el choque eléctrico y de bajo número de células que incorporan el transgene.^6,7 Además, la electroporación requiere de equipo caro y delicado. Por ello sería valioso contar con un método alterno que permita realizar mutagénesis dirigida de manera igualmente eficiente y que consuma menos recursos.

El plásmido pWAP–lox–neo–Tk–3 es un constructo para mutagénesis dirigida (11.8 kb) con base en un pBluescrip con fragmento de ADN genómico de 5 kb correspondiente al gen de proteína ácida sérica de leche de ratón (WAPr), insertado en el sitio de clonación múltiple, que incluye los cuatro exones del gen, modificado con un sitio múltiple de restricción enzi–mática (Kpn I, Sal I, Bam HI, Nsi I, EcoR I, KpnI) en un sitio Kpn I del exón I y un cassete lox–neo–Tk en un sitio BamH I del exón IV; el plásmido presenta un sitio único de restricción enzimática XhoI que lineariza al constructo en la terminación 5' del gen WAPr.¹⁶ Este plásmido fue amplificado en células competentes E. coli XL1* y el ADN fue purificado con el estuche comercial Concert Rapid Plasmid Maxiprep System** según las instrucciones del fabricante.

Las células TEr E14 TG2a¹⁷ fueron cultivadas en medio ES, de acuerdo con algunos autores,^17–19 modificado porque se usó medio knock out*** complementado con sustituto de suero knock out,† según las instrucciones del fabricante, con 1 000 U/mL del factor inhibidor de la leucemia murino (LIFm),‡ sin células alimentadoras. Como consecuencia de que en el crecimiento celular de las células TEr fue lento cultivando bajo medio químicamente definido, se adicionó 10% de medio condicionado esterilizado mediante filtración al medio ES (medio ES–LIF–C). El medio condicionado fue preparado cultivando células NSTO¹⁷ en medio ES sin LIFm durante 24 a 48 h. Las células se incubaron a 37°C, con 95% de humedad relativa y 5% de CO2; realizando pasajes cada 48 h. En dos ocasiones antes de la transfección (24 y 2 h, respectivamente), a las células TEr se les cambió el medio ES–LIF–C por medio recién preparado, antes de la transfección se dispersaron mediante tripsinización.

La electroporación se realizó según Vázquez et al.;¹⁷ se adicionaron 20 ug de ADN de plásmido linearizado con XhoI a una suspensión de células TEr (5 a 12 × 10⁶) en medio ES colocadas en una cubeta de electroporación de 4 mm de gap y se incubó durante 5 a 10 min; las células fueron electroporadas en un electroporador BTX ECM830* a 260 V, 6 ms, a 250 μFD en una onda cuadrática; se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente y finalmente se sembraron en la caja de cultivo celular gelatinizada con medio ES–LIF–C.

La lipofección se realizó con LipofectAMINE^TM** siguiendo las instrucciones del fabricante. Se prepararon dos tubos con 100 μL de medio knock out cada uno, a uno se le adicionaron 4 μL de LipofectAMINE^TM y al otro 1 μL (1 μg) del plásmido linearizado; el contenido de ambos tubos se mezcló e incubó durante 45 min a temperatura ambiente para dar lugar a la formación del complejo ADN–liposomas; posteriormente se adicionaron 800 μL de una suspensión de 1 × 10⁶ células en medio knock out, mezclando cada 20 min durante su incubación (37°C, 95% HR y 5% CO2) durante 2 h para después sembrarlas en cajas de cultivo celular de 10 cm de diámetro.

Después de 24 h de la transfección el medio ES–LIF–C fue sustituido por medio ES–LIF–C suplementado con 200 μg/mL de G418;*** este medio se cambió cada 24 h durante 12 días; después las colonias neomicina resistentes fueron contadas, colectadas y expandidas individualmente en cajas de 24 pozos con el mismo medio, con el fin de extraer de aquí el ADN para realizar el análisis mediante PCR.

La extracción y purificación del ADN genómico se hizo utilizando FTAcardsf de acuerdo con las recomendaciones del fabricante con algunas modificaciones, según se describe brevemente. Las colonias expandidas fueron dispersadas por tripsinización, las células se contaron, se diluyeron y 100 μL (1 célula/ μL) de la suspensión de células se colocaron en la tarjeta, dejando secar a temperatura ambiente durante 1 h y después se guardaron en un sobre con desecante hasta ser utilizadas para su análisis por PCR. Llegado el momento se cortó un círculo de 2 mm de diámetro de cada muestra de la tarjeta, se lavó agitando con vórtex en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL, tres veces con 200 μL de reactivo FTA, dos veces con TE–1 amortiguador y un lavado final con agua desionizada estéril libre de nucleasas; el fluido se elimino después de cada lavado y al final del último lavado el papel con la muestra de ADN se dejó secar durante 1 h a temperatura ambiente, en condiciones estériles.

El PCR y el PCR anidado (Figura 1a) se realizaron utilizando agua desionizada estéril, la muestra de ADN, 1.5 mM de MgCl2, 0.2 μM de cada primer,* 1U de Taq ADN polimerasa,** 200 μM de cada dNTP*** y tampón de PCR del fabricante bajo las siguientes condiciones en un termociclador: Desnaturalización inicial 1 min a 94°C; 35 ciclos de denaturalización 94°C 30 s, alineación 54°C 70 s, elongación 72°C 90 s; elongación final 72°C 8 min; periodo de estabilización 4°C 8 min. Los iniciadores externos AF 5'GCCTCCACACTCTTAGAA3' y AR 5'TTGGAACATGGACTGAAC3', fueron diseñados para alinearse en la región del promotor del gen WAPr (ausente en el transgene pWAP–lox–neo–Tk–3), corriente arriba de la región de homología del transgene, y con el exon 2 de WAPr; esta reacción se preparó con el recorte de papel Whatman que contenía la muestra de ADN genómico (o bien, 0.5 μL de ADN para el testigo positivo con aproximadamente 5 ng), para una reacción de 10 μL, amplificando un fragmento de 1 474 pb (para el tipo silvestre) o 1 504 pb (para el fragmento con mutagénesis dirigida).

Los iniciadores internos para el PCR anidado BA 5'TGTGTGGCCAAGAAGGAA3' y BR 5'AGAAGTGACCAGGGCCT3' amplificaron un fragmento de 475 pb (tipo silvestre) o 505 bp (mutación dirigida) de la región interna del gen WAPr amplificado por el PCR. Como fuente de ADN se utilizaron 5 μL de la primera reacción de PCR para una reacción de 50 μL.

Para el análisis por RFLP, el producto del PCR anidado fue digerido con EcoRI† para diferenciar las colonias con integraciones al azar de las colonias con mutagénesis dirigida (Figura 1a). Se agregaron 10 μL de la reacción del PCR anidado de cada muestra junto con 0.2 μL de EcoRI (12U/μL),‡ 3 μL de tampón 10X^° para la reacción de digestión, 0.3 uL de albúmina sérica bovina^°° (10 ug/μL), 0.3 μL de 100X espermidina,^°°° 4 μL de pBR322^ 10 ng/μL (como testigo interno de la digestión), 12.2 uL de agua desionizada estéril para una reacción de 30 μL, que fue incubada a 37°C durante 1 h Cada reacción de RFLP se dividió para analizarla en dos diferentes geles de agarosa, uno al 3% (Figura 1b) y otro al 1% (para el plásmido testigo interno de la digestión, Figura 1c). El RFLP del PCR anidado generó en las colonias con mutagénesis dirigida (RH+) dos (338 pb y 167 pb) o tres (475 pb fragmento no digerido, adicional a los fragmentos antes mencionados) bandas según si la mutación dirigida afectó a los dos alelos (homocigótica) o a uno solo (heterocigótica); en el caso de las colonias con recombinación azarosa (RH–) el gen WAPr de tipo silvestre no se esperaba que se digiriera (banda de 475 pb de ambos alelos) por carecer del sitio de restricción Eco RI .

La eficiencia de transfección fue 3.2 veces mayor para la lipofección (0.0032%) que para la electroporación (0.0010%). La eficiencia de recombinación homóloga fue muy similar entre lipofección (4.68%) y electroporación (4.51%). Haciendo un aproximado, la eficiencia de recombinación homóloga absoluta fue de 1.5 × 10^–6 para la lipofección y de 0.478 × 10^–6 para la electroporación.

El índice de transfección (3.2:1) entre lipofección y electroporación en células TEr, es similar al obtenido por otros autores,^7,14 quienes han notificado un índice de 3–4:1. Existen otros estudios que comparan lipofección contra electroporación en otros tipos de células y condiciones; sus resultados no los podemos comparar con los de este estudio, debido a que se ha comprobado que la eficiencia en la transfección varía entre técnicas de acuerdo con el tipo de célula²⁰ o a su aplicación in vivo o in vitro, ya que hay factores in vivo que afectan la eficiencia de transfección con liposomas, como es la presencia de suero o bien una mala perfusión de liposomas hacia algún órgano.^21,22

Los resultados que aquí se presentan sugieren que la lipofección puede utilizarse para producir mutación dirigida en células TEr, lo que sumado a los hallazgos de Ma et al.,¹⁴que demostraron que este método no afecta el estado de indiferenciación ni la pluripotencialidad de las células TEr ni su capacidad para producir quimeras de línea germinal cuando trabajaron con la expresión del gen GFP, sugiere que la lipofección podría ser utilizada en la producción de ratones transgénicos.

La microelectroporación²³ es un método de transfección in vitro que han adoptado recientemente muchos investigadores, tiene alta eficiencia de recombinación homóloga (10^–1); sin embargo, este método presenta la desventaja de requerir equipo sofisticado, delicado y de personal altamente calificado, lo cual mantiene a la lipofección como un método de transfección de elección si se considera que es una técnica sencilla y económica para producir mutagénesis dirigida en células TEr. Sería interesante comparar estos métodos bajo las mismas condiciones de gen diana, vector utilizado, tipo de célula (TEr) y mismo personal (con mismas habilidades técnicas), ya que los resultados pueden verse afectados grandemente por estos factores.^4,20,23

En conclusión, la lipofección es buena alternativa sobre la electroporación convencional como método de transfección para producir mutagénesis dirigida en células TEr, debido a que es igualmente eficiente que la electroporación para obtener mutación dirigida por recombinación homóloga y más eficiente para obtener células transfectadas con menos esfuerzo, dinero y equipo.

Agradecimientos

El presente trabajo fue financiado por la Universidad Autónoma del Estado de México bajo el proyecto 1887/2004 SIyEA–UAEM y el proyecto 28207M del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt), de México. Se agradece el soporte en becas de la UAEM, del Conacyt (174059) y el Comecyt (FO–CMCYT–05), así como el apoyo técnico del Dr. James Derr, de la Universidad de Texas A&M, a través del Programa de Movilización Estudiantil (SEP–FIPSE), Globalization of Education in Animal and Poultry Science.

1. THOMAS K, CAPECCHI R. Site–directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo–derived stem cells. Cell 1987; 51(3): 503–512.        [ Links ]

2. HASTY P, RIVERA–PEREZ J, CHANG C, BRADLEY A. Target frequency and integration pattern for insertion and replacement vectors in embryonic stem cells. Mol Cell Biol 1991; 11: 4509–4517.        [ Links ]

3. AMURA C R, MAREK L, WINN R A, HEASLEY L E. Inhibited neurogenesis in JNK1–deficient embryonic stem cells. Mol Cell Biol 2005; 25: 10791–10802.        [ Links ]

4. BOLLAG R J, WALDMAN A S, LISKAY M. Homologous recombination in mammalian cells. Annu Rev Genet 1989; 23 : 199–225.        [ Links ]

5. TAREK M. Membrane electroporation: A molecular dynamics simulation. Biophys J 2005; 88: 4045–4053.        [ Links ]

6. CAPECCHI M R. How close are we to implementing gene targeting in animals other than mouse. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 956–957.        [ Links ]

7. BUGEON L, SYED N, DALLMAN M J. A fast and efficient method for transiently transfecting ES cells: application to the development of systems for conditional gene expression. Transgenic Res 2000; 9: 229–232.        [ Links ]

8. HASEGAWA S, HIRASHIMA N, NAKANISHI M. Microtubule involvement in the intracellular dynamics for gene transfection mediated by cationic liposome. Gene Ther 2001; 8: 1669–1673.        [ Links ]

9. LAKKARAJU A, RAHMAN Y, DUBINSKY J M. Low–density lipoprotein receptor–related protein mediates the endocytosis of anionic liposomes in neurons. J Biol Chem 2002; 277: 15085 – 15092.        [ Links ]

10. RAVIV U, NEEDLEMAN D J, LI Y, MILLER H P, WILSON L, SAFINYA C R. Cationic liposome–microtu–bule complexes: Pathways to the formation of two–state lipid–protein nanotubes with open or closed ends. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102: 11167–11172.        [ Links ]

11. HYUN S, LEE G, KIM D, KIM H, LEE S, NAM D et al. Production of nuclear transfer–derived piglets using porcine fetal fibroblast transfected with the enhanced green fluorescent protein. Biol Reprod 2003; 69: 1060–1068.        [ Links ]

12.MCCREATH K J, HOWCROFT J, CAMPBELL K H, COLMAN A, SCHNIEKE A E, KIND A J. Production ofgene–targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells. Nature 2000; 29, 405: 1066–1069.        [ Links ]

13. LEE J T, JAENISCH R. A method for high efficiency YAC lipofection into murine embryonic stem cells. Nucleic Acids Res 1996; 24: 5054–5056.        [ Links ]

14. MA H, LIU Q, DIAMOND S L, PIERCE E A. Mouse embryonic stem cells efficiently lipofected with nuclear localization peptide result in a high yield of chimeric mice and retain germline transmission potency. Methods 2004; 33: 113–120.        [ Links ]

15. YANG S, TUTTON S, PIERCE E, YOON K. Specific double–stranded RNA interference in undifferentiated mouse embryonic stem cells . Mol Cell Biol 2001; 21: 7807–7816.        [ Links ]

16. DEKKER M, BROWERS C, RIELE H. Targeted gene modification in mismatch–repair–deficient embryonic stem cells by single–stranded DNA oligonucleotides. Nucleic Acids Res 2003; 31: 27–34.        [ Links ]

17. VÁZQUEZ J C, NOGUESS C, RUCKER E B, PIE–DRAHITA J A. Factors affecting the efficiency of introducing precise genetic changes in ES cells by homologus recombination: tag–and–exchange versus the creIoxp system. Transgenic Res 1998; 7 : 181–193.        [ Links ]

18. JOYNER A L. GENE TARGETING A Practical Approach. In: Rickwood D, Hames D, editors. The Practical Approach Series. Toronto, Canada: OIRL Press., 1992: 85–97.        [ Links ]

19. HOGAN B, BEDDINGTON R, CONSTANTINI F, LACY E. Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual. Cold spring, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994.        [ Links ]

20. HANSON K D, SEDIVY J M. Analysis of biological sections for High–efficiency gene targeting. Mol Cell Biol 1995; 15: 45–51        [ Links ]

21. ABE A, MIYANOHARA A, FRIEDMANN T. Enhanced Gene Transfer with Fusogenic Liposomes Containing Vesicular Stomatitis Virus G Glycoprotein. J Virol 1998; 72: 6159–6163.        [ Links ]

22. GROSSINI L, COURNIL–HENRIONNET C, MIR L M, LIAGRE B, DUMAS F, ETIENNE S et al. Direct gene transfer into rat articular cartilage by in vivo electroporation. FASEB J 2003; 17: 829–835.        [ Links ]

23. TEMPLETON N S, ROBERTS D D, SAFER B. Efficient gene targeting in mouse embryonic stem cells. Gene Therapy 1997; 4 : 700–709.        [ Links ]

Notas

* Life Technologies, Gibco BRL, Invitrogen, Estados Unidos de América.

** Life Technologies, Gibco BRL, Invitrogen, Estados Unidos de América.

*** Life Technologies, Gibco BRL, Invitrogen, Estados Unidos de América.

† Life Technologies, Gibco BRL, Invitrogen, Estados Unidos de América.

* Genotronics, Holanda.

** Life Technologies, Gibco BRL, Invitrogen, Estados Unidos de América.

*** Sigma Chemical, Estados Unidos de América.

† Whatman Laboratorios, Estados Unidos de América.

* Life Technologies, Gibco BRL, Invitrogen, Estados Unidos de América..

** Biogénica/Biotecnologías Universitarias, México.

*** Biogénica/Biotecnologías Universitarias, México.

† Promega, Estados Unidos de América.

‡ Promega, Estados Unidos de América.

°° Promega, Estados Unidos de América.

°°° Biogénica/Biotecnologías Universitarias, México.