Sobrevivencia de bacteriófagos en una presa recreativa del noreste de México

Bacteriophage survival in a recreation dam of the northeast of México

Luis SAMANIEGO-MORENO¹, Juan A. VIDALES-CONTRERAS^2*, Rodolfo A. GARCÍA-ZAMBRANO², Humberto RODRÍGUEZ-FUENTES², Emilio OLIVARES-SÁENZ², Rigoberto VÁZQUEZ-ALVARADO², Ernesto J. SÁNCHEZ-ALEJO² y Pablo GORTARES-MOROYOQUI²

¹ Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Departamento de Riego y Drenaje. Calzada Antonio Narro No. 1923, C.P. 25315, Saltillo, Coahuila, México *Autor responsable; javidalesc@hotmail.com

Recibido noviembre 2010,
aceptado mayo 2012

RESUMEN

La tasa de decaimiento (k) de los colifagos PRD1 y MS2, modelos de virus entéricos, fue evaluada in situ en el agua de la presa recreativa "La Juventud" ubicada en Marín, N.L., México. Su relación con la temperatura (T), pH, conductividad eléctrica (CE), sólidos suspendidos totales (SST), oxígeno disuelto (OD) y coliformes totales (CT) y fecales (CF) fue también analizada. Los resultados mostraron que para ambos colifagos la menor sobrevivencia fue en verano y la mayor en invierno. Comparado con PRD1, MS2 presentó mayor tasa de decaimiento. Sin embargo, PRD1 sobrevivió por más tiempo en el fondo de la columna de agua de la presa que en su superficie. La tasa de decaimiento no estuvo relacionada con la CE ó la concentración de OD medida en cada uno de los sitios de muestreo. La concentración de SST fluctuó entre 45 y 80 mg/L, CT entre 75 y 335 unidades formadoras de colonias (UFC)/100 mL, mientras que la densidad de Cf se ubicó entre 25 y 125 UFC/100 mL de muestra. Estos valores están muy por debajo de los máximos permisibles para descargas de aguas residuales a aguas y bienes nacionales, cumpliendo con las normas mexicanas para aguas de recreación en SST y CF.

Palabras clave: inactivación, colifagos, PRD1, MS2, patógenos.

ABSTRACT

Key words: inactivation, coliphages, PRD1, MS2, pathogen.

INTRODUCCIÓN

Una de las formas más comunes de contaminación de los cuerpos de agua superficiales es por patógenos entéricos asociados a las heces fecales de individuos infectados. Entre estos patógenos, los virus entéricos han sido considerados la causa más común de muerte entre la niñez a nivel mundial, especialmente en países subdesarrollados (Walsh y Warren 1979, Butler 1984, Clark y McKendrick 2004). Al ser evacuados al ambiente ellos pueden alcanzar los cuerpos de agua superficiales, que abastecen a las poblaciones o que se utilizan como sitios de recreación, poniendo en riesgo la salud pública al ser capaces de causar diversas enfermedades entre la población (Bosch et al. 2006); por ejemplo, gastroenteritis, hepatitis A, hepatitis E, meningitis y miocarditis, entre otras.

La presencia de virus entéricos en cuerpos de agua superficiales o subterráneos es un riesgo importante que puede afectar la salud pública, ya que ellos pueden sobrevivir por largos periodos manteniendo la posibilidad de brotes de enfermedades entéricas o en casos más graves epidemias. Para determinar la tasa de decaimiento en el ambiente se puede recurrir a virus no patogénicos; por ejemplo, colifagos, incapaces de reproducirse en el ambiente (Campos 1993, Grabow 2001), con una morfología similar a la que presentan los virus entéricos y con la ventaja de que su análisis es relativamente sencillo, económico y rápido (Vidales-Contreras et al. 2006). Los más comúnmente utilizados como modelos de virus entéricos son PRD1 y MS2. Entre otras características, PRD1 infecta bacterias gram negativas como Escherichia coli y Salmonella typhimurium, posee una membrana lípido-protéica bajo su cápside similar al adenovirus y al rotavirus (McNulty 1978, Balakireva el at. 2003). El virus es de forma icosaédrica, con un tamaño de 62 nm y 24 x 10⁶ daltones de peso molecular (Olsen et al. 1974). MS2 es un virus desnudo, similar a los enterovirus, coxsackievirus, polivirus y enterovirus. Infecta a Escherichia coli ATCC15597, es de forma icosaédrica, con un tamaño de 27 nm y tiene un peso molecular de 3.5 x 10⁶ daltones (Kuzmanovic et al. 2003, Harvey y Ryan 1993).

Los factores que pueden afectar a la sobrevivencia del virus en agua incluyen a la temperatura, materia orgánica, microorganismos aeróbicos y luz solar, entre otros (Bosch et al. 2006). Sin embargo, el factor más importante es la temperatura, ya que su incremento favorece el decaimiento del virus principalmente por la actividad de enzimas extracelulares (Gundy et al. 2009) y en casos extremos la desnaturalización de proteínas (Hurst et al. 1980). Yahya et al. (1993) evaluaron la sobrevivencia de PRD1 y MS2 en agua subterránea de diferentes sitios de Estados Unidos de América a diferentes temperaturas. Las tasas de decaimiento observadas fueron 0.05 y 0.55 log₁₀/día para PRD1 y MS2, respectivamente, a 23 °C en agua colectada de Tucson AZ, EUA. A 7 °C la diferencia en decaimiento para ambos colifagos fue despreciable. Por otra parte, John y Rose (2005) realizaron una revisión de factores que afectan la sobrevivencia de microorganismos en agua subterránea. En este estudio el valor de la media geométrica para las tasas de inactivación para colifagos, poliovirus, echovirus, bacterias coliformes, enterococos y Salmonella spp., fue aproximadamente de 0.07-0.1 log₁₀/día, mientras que las tasas de inactivación para el virus de hepatitis A, coxsackievirus y PRD1 fueron de 0.02-0.04 log₁₀/día. Los estudios anteriores sugieren que la tasa de decaimiento de colifagos y virus entéricos es dependiente de la temperatura, mayor decaimiento a mayores temperaturas.

La presa "La Juventud" ubicada al noreste de México, recibe anualmente 32 000 visitantes con fines de recreación y pesca deportiva. A esta presa llegan principalmente los escurrimientos superficiales producidos por las precipitaciones que ocurren en su cuenca, sin embargo, en ella se ubican pequeños desarrollos urbanos y explotaciones de cerdos y ganado vacuno, además del predio donde se confinan los desechos de la cabecera municipal de Marín N. L. México. La presa se encuentra aproximadamente a 1.5 km de un sistema de lagunas de oxidación donde se tratan las aguas residuales de la cabecera municipal, lo que sugiere que en temporada de precipitaciones existe el riesgo que efluentes contaminados lleguen a ella. Es importante mencionar que al noreste de la presa se establecen cultivos irrigados con agua residual tratada. Los objetivos de la presente investigación fueron: (i) evaluar in situ la tasa de decaimiento de los colifagos PRD1 y MS2; (ii) analizar su relación con T, pH, CE, OD y SST, y (iii) cuantificar CT y CF en las aguas de la presa para compararla con las normas oficiales mexicanas.

MATERIALES Y MÉTODOS

El sitio para la prueba de sobrevivencia (Fig. 1) de MS2 y PRD1 se localizó a los 25° 52' 29'' N, 100° 04' 07'' O, con una profundidad de 4 m al inicio del estudio y de aproximadamente 3 m durante la época de estiaje. Los colifagos PRD1 y MS2 se obtuvieron del Laboratorio de Remediación Ambiental y Análisis de Aguas, Suelos y Plantas de la FAUANL. Ambos virus fueron replicados por el método de doble capa (Adams, 1959) usando como hospedero Salmonella typhimurium LT2 y Escherichia coli 15597, respectivamente, en agar de soya tripticaseina (BDBioxon, México) a concentración de 40 g/L. Una alícuota de 0.1 mL de una suspensión del virus se mezcló con 0.5 mL de su hospedero en 30 g/L de caldo de soya tripticaseina (BDBioxon, México) preparado con agar bacteriológico al 1.0 % (BDBioxon, México). Esta suspensión se añadió a la placa de agar de soya y posterior a su solidificación se incubó a 37 °C por 24 h. Inmediatamente después de este periodo se añadieron 6 mL de agua destilada estéril incubándose por 3 h a temperatura ambiente (25 °C). La suspensión se recuperó en una botella de polipropileno de 250 mL y se centrifugó a 15 000 x g (Centrifuge 5804 R Eppendorf) por 15 min. El sobrenadante se filtró a través de una membrana de nitrocelulosa de 47 mm de diámetro y 0.45 μm de tamaño de poro (Millipore, Billerica, MA, EUA). La sobrevivencia se realizó in situ utilizando membranas de diálisis (Spectra/Por Spectrum) con un umbral de permeabilidad de 12 000 a 14 000 daltones de peso molecular, lo que permite que los iones solubles del agua pasen la membrana e impidiendo el paso de MS2 y PRD1 (3.5 y 24 x 10⁶ daltones, respectivamente). Se colocaron bolsas de aproximadamente 100 mm de largo y 25 mm de ancho en agua destilada para suavizarlas y atarlas en uno de sus extremos. Las bolsas se llenaron con 3 mL de una mezcla de 300 mL de agua de la presa y 0.3 mL de solución concentrada de cada colifago, atando su extremo superior. La concentración de PRD1 y MS2 (Co) en esta suspensión fue cuantificada, cuadro I, al inicio de cada experimento.

Inicialmente los ensayos se llevaron a cabo colocando grupos de 12 bolsas con la suspensión viral previamente preparada a 0, 1, 2, 3 y 4 m de profundidad en la primavera del 2007 (17-24 de abril). Posteriormente, los periodos de monitoreo fueron: primavera (23 de abril-02 de mayo) y verano del 2008 (01-11 de julio), a profundidades de 0, 1, 2, y 3 m. Sin embargo, esta condición cambio en otoño del 2008 (12-21 de diciembre), debido a las precipitaciones ocurridas en julio de ese año e invierno del 2009 (23-28 de enero) cuando la altura de la columna del agua fue de 4 m. Diariamente una bolsa de diálisis colectada de cada profundidad de muestreo se colocó en un recipiente con hielo y se llevó al Laboratorio de Remediación Ambiental Análisis de Suelos Aguas y Plantas de la FAUANL para su análisis por el método de doble capa (Adams 1959). Una alícuota de 0.5 mL de S. tiphymuruim LT2 o E. coli 15597 para los colifagos PRD1 y MS2, respectivamente, y 0.1 mL de la suspensión de la bolsa de diálisis diluida mediante diluciones decimales sucesivas, se mezclaron en 4.5 mL de caldo de soya tripticaseina (30 g/L), conteniendo 1.0 % de agar bacteriológico, mantenido en baño María a una temperatura de 47 °C. Esta mezcla se vació en una placa de agar de soya tripticaseina (40 g/L); una vez solidificada, se incubó por 24 h a 37 °C. La concentración (C) se determinó mediante el promedio de la enumeración de las unidades formadoras de placa (UFP) por placas Petri, preparadas por duplicado, multiplicado por el factor de dilución (F), el cual es expresado como:

Donde v es el volumen ensayado, 0.1 mL, y d es la dilución usada para el análisis, 10^-1, 10^-2, 10^-3, y así sucesivamente, que permitió la cuantificación de los colifagos. Al momento del muestreo y a las profundidades mencionadas anteriormente fueron medidos pH, CE y T, con un medidor multiparámetros de campo (YSI Mod. 63150, EUA), lo mismo para OD (Hanna Instruments, HI 9143 EUA). Sin embargo, las observaciones de pH fueron realizadas sólo en primavera, verano y otoño de 2008.

Para la determinación de SST se utilizó la técnica de diferencias de peso (APHA 1992), tomándose solamente muestras de la superficie del sitio de muestreo. Brevemente, una muestra bien mezclada se filtró a través de un filtro de fibra de vidrio de 47 mm de diámetro (Whatman EUA) y el residuo retenido se secó hasta peso constante a 103-105 °C. El incremento en el peso del filtro representa el total de sólidos suspendidos. Los volúmenes de muestra, por triplicado, que se usaron fueron de 20 mL. La medición de turbidez (Hanna Instruments, HI 93703, EUA) se realizó in situ. Para CT y CF se tomaron muestras de agua de la superficie de los sitios de muestreo, conservadas en hielo y llevadas al laboratorio para su análisis por la técnica de filtración por membrana (APHA 1992) utilizando M-Endo para CT y MFc (Difco, EUA) para CF. Las membranas de filtración fueron de nitrocelulosa de 47 mm de diámetro y 0.45 μm de tamaño de poro (Millipore, Billerica, MA, EUA). Alícuotas de 1 y 10 mL fueron los volúmenes ensayados, por duplicado, para determinar la concentración de ambos grupos bacterianos.

Con la concentración relativa (C/Co) de los colifagos expresada en unidades logarítmicas base 10 en el eje de las ordenadas y el día de muestreo como pareja ordenada en el eje de las abscisas, se trazó un modelo de regresión lineal para determinar k mediante la pendiente del modelo. Los valores de k reportados como negativos indican inactivación, mientras más negativo más alta la tasa de decaimiento (Yates et al. 1985, McLaughlin y Brooks 2008).

Los datos de precipitación y la temperatura ambiente y del agua que se registraron durante los experimentos se muestran en la figura 2 y en todos ellos el mayor valor se encontró en verano (INIFAP 2009).

La sobrevivencia de PRD1 y MS2, representada como el promedio de las concentraciones relativas de los colifagos, a lo largo de toda la columna de agua, se muestran en las Figs. 3 y 4, respectivamente. Las tasas de decaimiento se ilustran en el cuadro II. Para ambos virus la menor sobrevivencia fue en verano y la mayor en invierno. En comparación con PRD1, MS2 exhibió una mayor tasa de decaimiento a excepción de la primavera de 2008. Es importante señalar que en este periodo solo se consideraron los datos obtenidos en el punto ubicado a 3 m de profundidad para MS2, debido a las pocas observaciones realizadas en los puntos superficiales (Fig. 5). Comparando los resultados entre profundidades de muestreo, la tendencia general, a excepción del verano 2008, fue que el PRD1 sobrevivió por periodos más largos en el fondo de la columna de agua (Fig. 6) que en la superficie. Con respecto a MS2, este comportamiento también se observó, sin embargo, los dos sitios intermedios no siempre mostraron menor sobrevivencia comparado con el fondo de la columna. La mayor sobrevivencia de PRD1 en relación con MS2 ha sido observada en diversos estudios (Yates et al. 1985, Yahya et al. 1993, Blanc y Nasser 1996, Schijven et al. 2000, Enriquez et al. 2003, Brion et al. 2004). Por ejemplo, Yahya et al. (1993) observaron que PRD1 sobrevivió periodos 7 a 10 veces más prolongados que MS2 en muestras de agua subterránea. En comparación con MS2, Enriquez et al. (2003) encontraron una mayor sobrevivencia de PRD1 en suelos; mientras que Blanc y Nasser (1996) sugieren que PRD1 es un indicador más adecuado que MS2 para predecir la sobrevivencia de virus patogénicos a temperatura ambiente.

Los resultados para pH, T, CE y OD se presentan en las Figs. 7, 8, 9 y 10, respectivamente. Para pH, su tendencia fue a incrementarse hacia la superficie del agua probablemente a consecuencia de una mayor actividad fotosintética de las algas presentes que consumieron el CO₂ modificando su equilibrio (Jenkis 1999) e incrementando el pH. Durante los estudios no se observó alguna relación entre la tasa de decaimiento con la CE u OD en cada uno de los sitios de muestreo. Sin embargo, comparado con los valores en la superficie, la concentración de oxígeno y temperatura fueron menores en el fondo de la columna, probablemente, como consecuencia del efecto del viento, la estratificación por temperatura, la baja capacidad de difusión del oxígeno en el agua, la capacidad fotosintética de las algas presentes y la actividad microbiológica en el fondo de la presa. Algo similar se observó con la CE, aunque es valioso señalar que las curvas A y B (Fig. 9) corresponden al mismo periodo de monitoreo en el verano 2008, durante el cual se presentaron fuertes precipitaciones en la cuenca, resultando en una reducción de la CE, curva B. La mayor CE en el fondo de la presa puede atribuirse a una renovación más rápida del agua en la superficie de la columna debido al vertido del volumen almacenado por el vertedor de demasías. Para los muestreos mensuales, los SST fluctuaron entre 45 y 80 mg/L ligeramente superior a los 75 mg/L de promedio mensual señalados como límite máximo para aguas recreativas, aunque inferior a los 125 mg/L de promedio diario, establecidos por la Norma Oficial Mexicana NOM-001-ECOL-1996 (SEMARNAT 1996). Los niveles de turbidez se ubicaron entre 15 y 33 unidades nefelométricas durante los meses de muestreo del presente estudio.

Por otra parte, las concentraciones de CT fluctuaron entre 75 y 335 UFC/100 mL mientras que las CF se ubicaron entre 25 y 125 UFC/100 mL de muestra. Estos valores están muy por debajo de los máximos permisibles, NOM-003-ECOL-1997 (SEMARNAT 1997), para descargas de aguas residuales a aguas y bienes nacionales (1000 UFC/100 mL de promedio mensual para coliformes fecales ó 2000 UFC/100 mL de promedio diario). Por lo que hasta el momento de llevar a cabo esta investigación, la calidad microbio-lógica, con base en CT y CF, así como física, SST, de las aguas de la presa se encuentran en los niveles recomendados por la normatividad mexicana.

 

CONCLUSIONES

En comparación con MS2, los resultados del presente estudio sugieren que PRD1, al sobrevivir por más tiempo en el ambiente, es un indicador más adecuado para evaluar la sobrevivencia de virus entéricos en el agua de la presa "La Juventud". En comparación con PRD1, MS2 podría indicar una tasa de decaimiento más alta que virus entéricos similares a PRD1 como adenovirus o rotavirus. Aparentemente, los patógenos de efluentes residuales municipales podrían sobrevivir por mayor tiempo durante el invierno que en otra época del año, lo que significa un mayor riesgo para las personas que visitan la presa durante ese tiempo, en caso de una descarga de agua residual. Actualmente, el embalse cumple con las normas mexicanas para aguas de recreación en SST y CF, sin embargo, el crecimiento urbano de la cabecera municipal de Marín, N.L., puede cambiar estas condiciones.

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