Modeling of holding time of water biological samples

Roger Iván MÉNDEZ NOVELO, Liliana SAN PEDRO CEDILLO, Elba René CASTILLO BORGES y Elizabeth VÁZQUEZ BORGES

Facultad de Ingeniería, Ingeniería Ambiental, Universidad Autónoma de Yucatán, Av. Industrias no Contaminantes por Anillo Periférico Norte s/n. Tel. (999) 9300577 ext. 1069; Fax. (999) 9300559; e–mail: mnovelo@uady.mx

Recibido octubre 2009
Aceptado junio 2010

RESUMEN

Según los métodos analíticos convencionales, se debe mantener la temperatura por debajo de 10 °C para la preservación de muestras de agua para análisis microbiológicos por un periodo máximo de 6 horas para aguas no potables y 30 horas para aguas de consumo. Aunque explícitamente no se hace referencia de la carga orgánica, la diferencia del tiempo de preservación puede estar relacionada. Es decir, muestras con cargas orgánicas menores pueden preservarse por más tiempo que aquéllas con cargas orgánicas mayores. Se analizaron muestras de agua con diferentes cargas orgánicas; el análisis de los datos permitió desarrollar modelos para determinar las UFC/100 mL de organismos indicadores (coliformes totales, coliformes fecales y enterococos) en muestras de agua, en función de la DBO₅. Las determinaciones se hicieron entre 6 y 48 horas después de la toma de muestras. El tiempo de conservación de muestras de agua con alta concentración de DBO₅ no es un factor determinante para la estimación de UFC/100 mL de organismos indicadores (no existe diferencia significativa de coliformes totales, coliformes fecales ni de enterococos entre 0 y 48 horas). Para aguas con bajos valores de DBO₅, existe diferencia significativa entre las UFC/100 mL de coliformes totales determinadas a 0 y 6 horas, lo que contradice lo establecido en diversas normas analíticas. Con relación a coliformes fecales, estas muestras pueden preservarse hasta 6 horas, pero a las 18 horas se presenta una diferencia significativa de los valores de UFC/100 mL. Para los enterococos, no existe diferencia significativa de 0 a 48 horas de preservación.

Palabras clave: preservación de muestras, coliformes fecales, coliformes totales, enterococos, microorganismos patógenos, bacterias.

ABSTRACT

According to standard analytical methodologies, in order preserve water samples for microbial determination, they must be maintained under 10 °C for a maximum period of 6 hours for non–drinking water and 30 hours for drinking water. Although there is not an explicit reference to the water organic content, the difference between recommended preservation times could be related with it. Therefore, water samples with low organic content can be preserved for longer periods than those with a higher content. Several samples of water with different organic content (domestic wastewaters, from slaughterhouses and poultry farms, and from shallow wells) were analyzed. Models were developed in order to determine indicator organisms in CFU/100 mL (total and faecal coliforms, and enterococcus) as a function of BOD₅. The assessment was carried out 6 to 48 hours after sampling. It was found that high BOD₅ concentration in water is not a decisive factor when indicator organisms in CFU/100 mL are to be estimated (there is not a significant difference between total or faecal coliforms, neither between enterococcus between 0 and 48 hours). Nevertheless, there is a significant difference between total coliforms in CFU/100 mL when determined at 0 and 6 hours. This contradicts the established in several analytical methods. Samples for faecal coliforms determination can be preserved up to 6 hours, but at 18 hours there is a significant difference for results obtained in CFU/100 mL. For enterococcus, there is no significant difference in preservation between 0 and 48 hours.

Key words: sample preservation, faecal coliforms, total coliforms, enterococcus, pathogen microorganisms, bacteria.

INTRODUCCIÓN

En el estudio microbiológico de aguas no potables (fuentes de agua, corrientes contaminadas, agua para uso recreacional o residuales), las muestras deben mantenerse por debajo de 10 °C durante el transporte, sin exceder 6 horas entre la toma de la muestra y el análisis. En agua de consumo, la muestra se mantendrá por debajo de 10 °C durante el transporte y hasta la realización del análisis, sin exceder 30 horas (APHA 2005).

La DBO₅ puede estar relacionada con la manera de preservar una muestra para análisis biológico: si la materia orgánica disponible es alta, la curva de crecimiento de células microbianas se encontrará en etapa exponencial al tomar la muestra y mantenerla a una temperatura adecuada; esto se debe a que la velocidad de crecimiento estará influenciada por las condiciones ambientales, así como por las características genéticas de los microorganismos. Por lo tanto, dependiendo del tiempo transcurrido entre la toma de muestras con elevadas concentraciones de DBO₅ y su análisis, es probable que el número de organismos indicadores obtenidos sea más alto al momento de la determinación. Inversamente, cuando la DBO₅ es baja y se mantiene la temperatura adecuada, la determinación del número de microorganismos puede ser inferior: al consumir el poco sustrato disponible, las células continúan vivas y metabólicamente activas, pero pueden morir, por lo que el análisis de la muestra con microorganismos en decaimiento no arrojaría el resultado real.

Cuando se conserva una muestra bacteriológica, se espera que el método usado conserve el número de células microbianas sin dañar su metabolismo. Por ello se mantiene una temperatura en la cual se retrasan sus funciones metabólicas o incluso se detienen, sin causarles la muerte.

El crecimiento se define como un aumento en el número de células microbianas de una población; también puede medirse como un incremento de la masa celular. La velocidad de crecimiento es el cambio en el número de células experimentado por unidad de tiempo. El intervalo para la formación de dos células a partir de una supone una generación, y el tiempo transcurrido para que esto ocurra se denomina de generación. En un cultivo cerrado o en condiciones de lote se pueden distinguir en una curva de crecimiento las siguientes etapas: latencia, exponencial, estacionaria y endógena o muerte (Madigan et al. 2004). El tiempo de generación varía en función de las condiciones del medio: se observa que al aumentar la temperatura o el pH, se produce un aumento significativo de este indicador (Beldarraín et al. 2009). La persistencia de microorganismos patógenos es afectada por muchos factores, siendo la temperatura el más importante. El decaimiento es usualmente más rápido a altas temperaturas y puede ser incrementado por los efectos de la radiación solar UV que actúa sobre la superficie del agua (WHO 2008).

Las bacterias necesitan alimento para su crecimiento y desarrollo; reducir los nutrientes, por consiguiente, lo limita. El problema, sin embargo, radica en que basta una cantidad mínima para alimentar grandes comunidades microbianas. Teóricamente, 1 ppb de sustrato es suficiente para producir 9500 bacterias/L (Muñoz 2005).

La cantidad de microorganismos es frecuentemente usada como un indicador de contaminación en el agua (Otabbong et al. 2007), por lo que bacterias y virus juegan un papel significativo en la determinación de la calidad del agua (Nevecherya et al. 2005). Actualmente, los procedimientos para el monitoreo de la calidad del agua requieren una evaluación microbiológica mediante el uso de organismos indicadores, como son coliformes totales o fecales (Cook y Bolster 2007). Los métodos microbiológicos estándar usados para detectar bacterias en ambientes acuáticos están basados en las cuentas de unidades formadoras de colonias (UFC), por lo que sólo se permite la detección de bacterias capaces de dividirse (Lleo et al. 2005).

Las bacterias indicadoras de contaminación fecal –que incluyen a los coliformes totales y fecales y a los enterococos– han sido usadas como herramientas para el monitoreo de la calidad microbiológica del agua y para la predicción de la presencia de bacterias, virus y protozoos patógenos. Estos microorganismos son de origen animal y su presencia en el agua puede indicar contaminación fecal y una posible asociación con patógenos entéricos.

En la literatura se señala que los coliformes son microorganismos aerobios y anaerobios facultativos, bastones Gram negativos, no formadores de esporas, que fermentan la lactosa a 37 °C (coliformes totales) y producen gas. El grupo total de coliformes incluye los siguientes géneros de la familia de las Enterobacteriaceae: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Klebisella, Serratia y Yersinia. El género Escherichia es el más representativo de la contaminación fecal. Los coliformes fecales incluyen todos los coliformes de dicho origen y que pueden fermentar la lactosa o producir colonias a 45 °C. Los enterococos son cocos Gram positivos, catalasa negativa, inmóviles, anaerobios facultativos y no forman endosporas ni cápsulas. Entre las características fisiológicas que distinguen al género Enterococcus se encuentra la habilidad para crecer en presencia de 6.5 % de NaCl, a 10 y 45 °C y pH 9.6. Son capaces de hidrolizar la esculina en presencia de 40 % de bilis y poseen la enzima pyrrolidonyl arylamidasa. Entre las especies de mayor importancia clínica destacan E. faecalis y E. faecium de 5 a 10 % de las cepas detectadas (Suárez 2002).

De acuerdo con Savichtcheva y Okabe (2006), existen numerosas limitaciones asociadas con la aplicación de bacterias coliformes totales, fecales y enterococos como indicadores de contaminación fecal, como es su escasa supervivencia en cuerpos de agua y fuentes no fecales, su habilidad para multiplicarse después de su liberación en una columna de agua, la debilidad a los procesos de desinfección, la falta de asociación para identificar las fuentes de contaminación fecal, bajos niveles de correlación con la presencia de patógenos y baja sensibilidad de los métodos de detección. Por esta razón se han utilizado como indicadores alternativos los anaerobios fecales (Bacteroides spp., Bifidobacterum spp., Clostridium perfringens), virus (colifagos, fago B. fragilis) y componentes orgánicos fecales (coprostanol).

Método de conservación. De acuerdo con Standard methods (APHA 2005), el estudio microbiológico de muestras de agua no puras (fuentes, corrientes contaminadas, agua para uso recreacional o residuales) debe iniciarse después de realizada la toma de muestra para evitar cambios imprevisibles; en caso de ser necesaria su transportación, deberán mantenerse por debajo de 10 °C, durante no más de seis horas. Una vez en el laboratorio se procederá a su refrigeración y procesamiento en las dos horas siguientes. En aguas puras, la muestra se mantiene por debajo de 10 °C durante el transporte y hasta la realización del análisis, no excediendo 30 horas.

La mayoría de los factores físicos, químicos y ambientales afectan la supervivencia de los organismos coliformes en muestras de agua conservadas y hacen improbable que se establezcan los efectos que el almacenamiento tiene sobre ellas (McCarthy 1957).

De acuerdo con MacLeod et al. (1967), el congelamiento puede ser una alternativa para preservar una muestra biológica de agua, aun cuando se corre el riesgo de ocasionar un daño en la estructura celular de algunos microorganismos. Así también, temperaturas de 5 (Unda y Salinas 2000) o 4 °C (Dahling y Wright 1984) pueden ser usadas en la preservación de muestras hasta por 24 horas. En ocasiones, la adición del agente quelante ácido tetra–acético etilendiamida, EDTA (Shipe y Fields 1956), o peptona (Straka y Stokes 1957) tiene la misma finalidad de conservación.

Considerando todo lo anterior, el objetivo del estudio fue desarrollar un modelo que permitiera determinar el tiempo de conservación de muestras biológicas de diferentes tipos de agua, a fin de estimar las unidades formadoras de colonias (UFC) de coliformes totales (CT), coliformes fecales (CF) y enterococos (EN) existentes. Asimismo, establecer si existe relación entre la concentración de DBO₅ presente en el agua y el tiempo de conservación de la muestra, lo que podría explicar las diferencias en el conteo de células bacterianas a través del tiempo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Selección de tipos de agua. Se seleccionaron muestras de distintos tipos de agua con diferentes concentraciones de DBO₅ y de UFC/100 mL de CT, CF y EN. La toma de muestras, el método de conservación y los análisis para la determinación de DBO₅ y UFC/100 mL de los organismos indicadores mediante el filtro de membrana, se realizaron de acuerdo a Standard methods for the examination of water and wastewater (APHA 2005). Los tipos de agua analizados fueron de pozo, residual de rastro, residual doméstica y residual porcina. El agua de pozo corresponde a una oquedad de aproximadamente 10 m de profundidad, ubicada en la Facultad de Ingeniería de la Universidad Autónoma de Yucatán. El agua de rastro y la cerdaza se obtuvieron en la Facultad de Veterinaria perteneciente a la misma universidad. El agua residual doméstica procede de la planta de tratamiento de aguas Pensiones II, ubicada en la colonia Residencial del Norte (Jardín Pensiones), en la ciudad de Mérida, Yucatán.

Relación entre DBO₅ y el tiempo de conservación. Se determinó por triplicado DBO₅ de las aguas residuales porcinas y se realizaron las siguientes diluciones: 10^–1, 10^–2, 10^–3, 10^–4, 10^–5, 10^–6 y 10^–7. Para cada dilución se determinaron los valores de UFC/100 mL de CT, CF y EN a diferentes tiempos de conservación: 0, 6, 18, 24 y 48 horas.

Los resultados se analizaron mediante un modelo multifactorial, donde las variables de respuesta fueron UFC/100 mL de CT, CF y EN al tiempo t (CT_t, CF_t, EN_t); las fuentes de variación fueron la concentración inicial de DBO₅ y el tiempo de conservación de la muestra.

Y_ij = CT_t, CF_t o EN_t

µ = Media global

λ_i = Efecto que tiene el tiempo de conservación (h) sobre la variable de respuesta

β_j = Efecto que DBO₅ inicial tiene sobre CT_t, CF_t o EN_t.

ε_ijk = Error aleatorio

Relación entre el tiempo de conservación y el tipo de agua. Se determinaron por triplicado la DBO₅ y las UFC/100ml de CT, CF y EN de cada muestra de agua (de pozo, residual doméstica, de rastro y cerdaza) en los tiempos de conservación: 0, 6, 18, 24 y 48 horas.

Los resultados se analizaron mediante un modelo de 2 vías de efectos fijos, donde las variables respuesta fueron CT_t, CF_t ó EN_t y las fuentes de variación fueron el tipo de agua y el tiempo de conservación de la muestra.

Y_ij = CT_t, CF_t o EN_t

λ_i = Efecto que tiene el tiempo de conservación (h) sobre la variable de respuesta

β_j = Efecto que tiene el tipo de agua sobre CT_t, CF_t o EN_t

ε_ij = Error aleatorio

Modelación del tiempo de conservación de muestras biológicas. Dado que la concentración de DBO₅ resultó significativa, se ensayaron modelos de regresión múltiple para estimar la concentración de CT, CF y EN de la muestra original (al tiempo 0) en función de DBO₅ de la concentración de CT, CF y EN al tiempo t.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en la determinación de DBO₅ de cada tipo de agua se muestran en el cuadro I. En el cuadro II se muestran los valores promedio obtenidos de los análisis microbiológicos en cada tipo de agua, de acuerdo con el tiempo de conservación de las muestras.

En el cuadro IV se muestra el resultado del análisis de varianza según la ecuación 2, donde se observa que el tipo de agua es un factor significativo para estimar los CT_t, CF_t o EN_t.

El comportamiento de los intervalos de la prueba de diferencia significativa mínima (DSM) de la variable respuesta CT_t a través del tiempo se aprecia en la figura 1; el gráfico del agua de pozo presenta un tiempo significativamente diferente a los demás, el cual corresponde a la hora 0 de análisis microbiológico. A partir de la siguiente observación del mismo gráfico (6 horas de conservación) ya no se reportan UFC de CT. Esto indica que para que la determinación en este tipo de agua sea válida, es necesario realizarla al momento de tomar la muestra, lo cual no concuerda con lo establecido en los procedimientos analíticos estándar (APHA 2005). Estas aguas se caracterizan por bajos niveles de materia orgánica (DBO₅ promedio de 1 mg/L), por lo que no se esperaba que hubiera un crecimiento microbiano en ellas.

En el agua de rastro, los intervalos de confianza de la variable CT_t correspondientes a las horas 18, 24 y 48 son diferentes al de la hora 0 debido a que existe un ligero incremento en el número de CT. No obstante, se pueden obtener estimaciones del número de CT utilizando el modelo estimado correspondiente.

Para el agua residual doméstica, a las 18 horas se presenta un decremento en las UFC de CT, media diferente respecto a las de las horas 0 y 6; sin embargo, a las 24 y 48 horas las cuentas son estadísticamente iguales que las reportadas en los dos primeros tiempos. En el agua residual porcina las medias de Log(CT_t) son estadísticamente iguales en todos los tiempos.

En la figura 2 se aprecia el comportamiento de CF_t de cada tipo de agua a través del tiempo, donde el gráfico para el agua de pozo presenta cuentas iguales en las horas 0 y 6; para las 18 horas los CF decaen totalmente, lo que significa que llegan a su etapa endógena. Para las aguas de rastro, residual doméstica y cerdaza, las medias son semejantes a través del tiempo respecto a las UFC de CF a la hora 0.

En la figura 3 se presentan los cuatro gráficos de DSM correspondientes a cada tipo de agua, donde se analizan los intervalos de confianza de EN_t en cada tiempo de conservación. En los gráficos del agua de pozo, rastro y residual doméstica, los intervalos correspondientes a los tiempos 6, 18, 24 y 48 horas son iguales a los de la hora 0. En el agua residual porcina se observa un incremento en las UFC/100 mL de EN a las 18 horas de conservación, lo que diferencia este intervalo respecto a los obtenidos a las horas 0, 6, 24 y 48.

Finalmente en el cuadro V se observa que la conservación de la muestra para el análisis de CT de agua de pozo no es viable: de no ser analizadas las muestras al momento de la toma, no se detectará dicha comunidad microbiana. Para las determinaciones de CF pueden conservarse hasta por 6 horas. Los enterococos, por su naturaleza, sobreviven por más tiempo en el agua, así que aun con muestras conservadas durante 48 horas, las cuentas de EN permanecerán constantes. En el caso del agua residual doméstica, las muestras pueden conservarse hasta por 48 horas para el análisis microbiológico; sin embargo, para la determinación de CT se debe usar el modelo propuesto en el cuadro III, pues para este tipo de microorganismos las cuentas pueden variar respecto a UFC iniciales. En el agua residual de rastro, las cuentas de CT incrementan a partir de las 6 horas de conservación, por lo que para muestras preservadas hasta por 48 horas se puede hacer uso del modelo propuesto en el cuadro III; las UFC de CF y EN permanecen iguales aún cuando la muestra se conserve hasta por 48 horas. En el caso del agua residual porcina, las muestras se pueden conservar hasta por 48 horas, pero es recomendable utilizar los modelos propuestos en el cuadro III para la determinación de EN, ya que dicha cuenta varía respecto a las UFC iniciales.

CONCLUSIONES

Los modelos para estimar UFC en función del tiempo de conservación de muestras de aguas para pruebas biológicas son:

Coliformes totales (R² = 82.82 %):

CT_i = 216.24+28.56 log(DBO) – 0.00093 CT_t

Coliformes fecales (R² = 99.33 %):

CF_i = –5.43+1333.38 DBO – 0.00021 CF_t

Enterococos (R² = 99.86 %):

EN_i = –107.95+1334.04 DBO – 0.00289 EN_t

Las muestras de agua cuya carga orgánica sea > 200 mg DBO₅/L pueden ser preservadas hasta por 48 horas.

AGRADECIMIENTO

Al Fondo Mixto CONACyT–Gobierno del Estado de Yucatán, por financiar el proyecto de investigación (YUC–2005–CO4–21317) donde se generaron los resultados presentados.

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