Embriogénesis somática inducida con estrés osmótico en Bouteloua curtipendula (Michx.) Torr., especie recalcitrante y apomíctica

Induced somatic embryogenesis under osmotic stress in Bouteloua curtipendula (Michx.) Torr., a recalcitrant apomictic species

Álvaro Bernal-Flores, Adrián R. Quero-Carrillo*, Alejandrina Robledo-Paz, H. Araceli Zavaleta-Mancera y Paulino Pérez-Rodríguez

Campus Montecillo, Colegio de Postgraduados. Km. 36.5 carr. México-Texcoco. 56230, Montecillo,Texcoco, Estado de México. *Autor de correspondencia (queroadrian@colpos.mx)

Recibido: 21 de Noviembre del 2014
Aceptado: 18 de de Junio del 2015

Resumen

En el presente estudio varios medios de cultivo con diferentes auxinas fueron establecidos para la regeneración de plantas normales en pasto Banderita Bouteloua curtipendula (Michx.) Torr., a partir de callos inducidos en cariópsides (explantes) maduros cultivados en medio MS basal suplementado con 2,4-ácido diclorofenoxiacético y varias citocininas. Los medios MS+2,4-D+BAP suplementados con sorbitol (MI-13, MI-14) dieron origen a callos con características morfogénicas con potencial de regeneración. Los callos embriogénicos obtenidos a partir de MI-14 fueron colocados en diferentes medios de regeneración, entre los que MR-2 mostró la mayor frecuencia de regeneración (95.8 %) y eficiencia de conversión (13.9 %). Plántulas verdes, morfológicamente normales, fueron obtenidas con medio suplementado con cinetina (1 mg L^-1), ácido naftalenacético (0.2 mg L^-1) y ácido giberélico (0.2 mg L^-1). El estrés osmótico y el balance hormonal resultante de la adición de sorbitol, estimuló la formación de proembroides en callos friables y de embriones somáticos en pasto Banderita. Se presenta aquí el primer protocolo de regeneración en esta especie apomíctica recalcitrante, que pueda ser útil en trabajos futuros basados en técnicas de cultivo de tejidos.

Palabras clave: Bouteloua curtipendula, pasto Banderita, embriogénesis somática, regeneración de plantas, callos embriogénicos.

Abstract

Several basal MS culture media added with different auxins were tested on induced calli to promote normal plant regeneration, using mature caryopsis of sideoats grama Bouteloua curtipendula (Michx.) Torr. as explants. The induction media was supplemented with 2,4-diclorophenoxiacetic acid and several cytokinins. Basal MS + 2,4-D + BAP media supplemented with sorbitol (MI-13, MI-14) produced morphologically-viable regeneration calli. Potential highly embryogenic calli obtained from MI-14 were placed on different regeneration media. Medium MR-2 induced the highest plant regeneration frequency (95.8 %) as well as conversion efficiency (13.9 %). Green morphologically-normal plants were obtained on supplemented media added with kinetin (1 mg L^-1), naphtalenacetic acid (0.2 mg L^-1), and giberellic acid (0.2 mg L^-1). Osmotic stress or hormonal balance due to sorbitol addition produced pro-embryo within soft calli and induced somatic embryos in sideoats grama. This is the first report of a plant regeneration protocol for this apomictic species.

INTRODUCCIÓN

El pasto Banderita Bouteloua curtipendula (Michx.) Torr., es una especie C₄, apomíctica facultativa con genotipos diploides (2n = 2x = 20), poliploides (2n = 4x, 5x, ….10x) y aneuploides (Gould, 1979; Morales et al., 2006; Quero et al., 2010), nativa de zonas áridas y semiáridas del norte de México, país considerado centro de origen de esta especie (Quero, 2001; Morales et al., 2006). Su valor en la alimentación de herbívoros en pastoreo la hace de gran importancia forrajera. Su condición apomíctica ofrece ventajas que pueden ser aprovechadas en su mejoramiento genético, debido a que la apomixis preserva el genotipo maternal por partenogénesis, a la vez que mantiene las relaciones alélicas, fija la heterosis y las características de interés agronómico (Van Dick y Van Damme, 2000).

Las técnicas de cultivo de tejidos in vitro han sido una herramienta valiosa para el desarrollo de protocolos de regeneración en especies forrajeras apomícticas; se han usado en programas de mejoramiento o transformación genética en especies como B. gracilis (Aguado-Santacruz et al., 2001), B. eriopoda (Osuna y Barrow, 2004), Festuca alta (Arundinacea gigantea; Chen et al., 2004), Brachiaria brizantha (Cabral et al., 2011), Paspalum notatum (Mancini et al., 2014), Eragrostis curvula (Zappacosta et al., 2014) y pasto buffel (Cenchrus ciliaris; Carloni et al., 2014).

Frecuentemente, los factores genotipo, medio de cultivo, fuente de auxinas, concentración (Rakshit et al., 2010), tipo de explante y edad (Aina et al., 2012), son considerados en la inducción de callos morfogénicos para incrementar la respuesta de regeneración de plantas morfológicamente normales. Se ha reportado alta eficiencia en la inducción de callos en diferentes explantes en especies apomícticas, pero la capacidad de regeneración ha sido muy pobre (Hu et al., 2006; Bernal-Flores et al., 2013), capacidad que constituye la principal limitante para la obtención de protocolos eficientes de mejoramiento.

La baja respuesta de regeneración en especies apomícticas comparada con especies sexuales ha sido notable (Stephens et al., 2006; Mancini et al., 2014); aunque las causas no han sido bien entendidas en todas las especies, pudieran ser, principalmente debidas a desequilibrio hormonal endógeno (Huang et al., 2012). En especies denominadas recalcitrantes, los tratamientos con estrés osmótico (Wei et al., 1986; Huang et al., 2012; Zhang et al., 2013), frío (Immonen y Anttila, 1999; Narusaka et al., 2003), salinidad o adición de ABA (ácido abscísico; Narusaka et al., 2003), han sido usados en diferentes especies para incrementar los porcentajes de regeneración o la expresión de genes.

La función del estrés osmótico comúnmente utilizado en varias especies, se relaciona con el incremento en la generación de H₂O₂ (peróxido de hidrógeno), O₂^- (superóxido), O₂ (oxígeno "singlet") y radicales OH (hidroxilo), que incrementan la fuga de electrones en el oxígeno molecular (Xiong et al., 2002), los cuales pueden alterar por oxidación el metabolismo normal de lípidos, proteínas y ácidos nucleicos (Fridovich, 1986), aunque la mejor respuesta bioquímica es la acumulación de osmolitos orgánicos como prolina y betainas (McCue y Hanson, 1990).

En cambio, los niveles moderados de estrés incrementan el metabolismo e inducen mecanismos de adaptación (Lichtenthaler, 1998). Esta inducción caracterizada por reorganización celular, desencadena cambios fisiológicos, metabólicos y de expresión génica, en caso de que las señales apropiadas sean percibidas (Fehér et al., 2003), que provocan des-diferenciación celular. El estrés osmótico moderado estimula la producción de hormonas endógenas (principalmente ABA) e incrementa la regeneración de callos (Huang et al., 2012), debido a su función en la diferenciación celular (Park et al., 2011). Por tanto, el objetivo fue evaluar diferentes reguladores de crecimiento para la producción de callos embriogénicos y la regeneración de plántulas viables en pasto Banderita.

De un ecotipo apomíctico (2n = 4x = 40) de Banderita sobresaliente en la producción de forraje, se obtuvieron semillas (cariópsides) maduras mediante eliminación manual de bráctas accesorias de la espiguilla; este material es originario de la evaluación de una colecta nacional (Morales et al., 2006).

Manejo experimental

Desinfección de semilla. Se hizo con solución de etanol a 70 % (v/v) por 2 min, colocadas en solución con dos fungicidas (Ridomil 3 mL L^-1 y Promyl 1 g L^-1), durante 30 min en agitador; finalmente, fueron colocadas en solución con cloro a 30 % (v/v), suplementada con dos gotas de jabón líquido por 30 min en agitador, y luego enjuagada cinco veces con agua esterilizada.

Inducción de callos. Los medios de inducción (MI) elaborados con las sales basales (Murashige y Skoog, 1962; MS), fueron suplementados con distintas concentraciones y combinaciones de reguladores de crecimiento (Cuadro 1). Tanto el ácido giberélico y thidiazurón fueron preparados en solución mediante etanol y NaOH 1N respectivamente, y posteriormente incorporados al medio de cultivo; finalmente el pH fue ajustado a 5.7 ± 0.1. Se colocaron cariópsides maduras como explantes (40 por caja Petri), con 30 mL de cada medio de cultivo. Los callos obtenidos se cultivaron por ocho semanas antes de ser transferidos a medio de regeneración y sub-cultivados cada 20 d. Los explantes con pretratamiento de estrés osmótico provocado con D-sorbitol (Sigma® 8143) permanecieron 14 d en los medios MI-13 y MI-14; posteriormente, se transfirieron al mismo medio de inducción sin sorbitol y luego fueron sub-cultivados cada 20 d. Los callos fueron mantenidos en cámara de crecimiento a temperatura de 25 ± 2 ºC, en obscuridad.

Callos embriogénicos (CE). Los callos obtenidos en MI-14 fueron subcultivados cada 15 d para rápida multiplicación y luego probados en cuatro medios de regeneración (MR-1, MR-2, MR-3, MR-4). Las masas proembriogénicas de callos fueron mantenidas en medio suplementado con cinetina (1 mg L^-1), ácido naftalenacético (ANA, 0.3 mg L^-1), ácido giberélico (AG₃, 0.5 mg L^-1) y ácido indolacético (AIA, 0.1 mg L^-1).

Regeneración de planta. Callos jóvenes obtenidos de todos los medios de inducción (Cuadro 1) y menores a ocho semanas de edad, fueron colocados en cuatro medios de regeneración (MR-1, MR-2, MR-3, MR-4) preparados con el medio MS basal adicionado con cinetina o thidiazurón, ANA y AG₃. Seis piezas de 1 g de callo suave (organogénico) y embriogénico (CE) se colocaron en cada medio de regeneración, y luego sub-cultivados cada 25 d. Los callos permanecieron 20 d y posteriormente fueron transferidos al medio de maduración y conversión (AG₃ 0.5 mg L^-1). Las plántulas regeneradas normales fueron mantenidas por 20 d más en el mismo medio, y posteriormente fueron transferidas a medio de mantenimiento con MS₅₀ basal (2.2 g L^-1), suplementado con sacarosa (10 g L^-1). Las plántulas fueron cultivadas en cámara de crecimiento con 16 h luz e intensidad lumínica de 28 µmol m^-2 s^-1.

Histología y microscopia electrónica de barrido. Callos embriogénicos obtenidos del medio de maduración fueron fijados en FAA (10 % formaldehído, 5 % ácido acético, 52 % etanol, 33 % agua, v/v; Jensen, 1962), deshidratados en serie de alcoholes (etanol 30 %, etanol 40 %, etanol 50 %, etanol 70 %, etanol 85 %, etanol 100 % (1 y 2)) y xileno (alcohol etílico 50 % - xileno 50 % y xileno puro (1, 2, 3)), luego embebidos en parafina; los cortes se realizaron a 15 µm de grosor con micrótomo de rotación (American Optical®, modelo Spencer 820, USA).

Las muestras fueron luego desparafinadas con xileno (100 %), serie de alcoholes (etanol 50 %, etanol 70 %, etanol 85 %, etanol 100 %) y teñidas con O-safranina-verde fijo (Johansen, 1940), y después infiltradas y embebidas en resina sintética. Las muestras fueron observadas y las imágenes obtenidas en un microscopio Axiostar Plus Zeiss® (Carl Zeiss, Germany) provisto con cámara digital (Moticam 2000®, 2.0 MP).

Análisis estadísticos

Inducción de callos. Los datos fueron analizados mediante un modelo de regresión logística (Rencher y Schaalje, 2008), para modelar la probabilidad de inducción o no inducción de callos (p). Dado que la variable respuesta es binaria, se puede modelar como una variable aleatoria con distribución Bernoulli, con p como una función de los reguladores de crecimiento. El modelo de regresión logística aplicado es el siguiente (Agresti, 2002):

log p/(1-p) = β₀ + β₁ D + β₂ K + β₃ B + β₄ S + β₅ D × K + β₆
D × B + β₇ D × S + β₈ K × B + β₉ K × S + β₁₀ B × S

donde: D, K, B y S representan el contenido de ácido diclorofenoxiacético (2, 4-D), cinetina, 6-bencilaminopurina y sorbitol, respectivamente. El modelo fue ajustado con el procedimiento PROC LOGISTICA, del paquete estadístico SAS 9.4 (SAS, 2004), para Windows.

Regeneración de callos. Los datos fueron analizados mediante regresión (Rencher y Schaalje, 2008) para determinar la tasa de regeneración de plantas en callos embriogénicos, con base en diferentes medios de regeneración (1 = MR-1, 2 = MR-2, 3 = MR-3, 4 = MR-4). El modelo aplicado fue el siguiente:

y_i = Trat_i + ε_i

donde: y_i = variable de respuesta medida en tratamiento i; i = efecto del tratamiento (1, 2, 3, 4). Las diferencias entre tratamientos fueron probadas con la prueba de razón de verosimilitudes. Las comparaciones de medias se hicieron mediante la prueba de Tukey (P ≤ 0.05).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Medios de inducción y tipo de callo. La formación de callos fue afectada significativamente (P ≤ 0.05) por el medio de cultivo y la concentración de los reguladores de crecimiento empleados. El origen y crecimiento de callos fue visible 2 semanas después de la incubación, iniciando en la región principal del vástago conforme la semilla germinó; se observó una relación entre germinación e inducción de callos. Similar a lo reportado en arroz (Oryza sativa L.) por Mirlohi et al., (1989) y en Panicum spp., aquí se observó una correlación positiva entre germinación e inducción de callos por semilla (Seo et al., 2008).

Los seis tipos de callo que fueron encontrados a partir de cariópsides se ilustran en la Figura 1. Se observó mayor variabilidad de callos en medios suplementados con 6-bencil-aminopurina (6-BAP; MI-12, MI-13, MI-14), comparados con los suplementados con cinetina, ácido indolacético (AIA) o ácido naftalenacético (ANA). Callos morfológicamente similares a los observados fueron reportados por Wang et al. (2010) para Zoysia spp. Los medios MI-12 y MI-14 mostraron los mayores porcentajes de inducción (66 y 66 %, respectivamente; P ≤ 0.001). El estrés osmótico inducido por el medio MI-14 estimuló la aparición de masas proembriogénicas de callos en el ecotipo apomíctico, y fueron fácilmente confirmados en el medio de regeneración (Cuadro 2).

Los callos embriogénicos (CE) obtenidos a partir de medios suplementados con sorbitol (0.6 mM), presentaron mayor frecuencia de inducción, comparado con medio suplementado con 6-BAP, sin sorbitol (MI-12). Similarmente a lo reportado en trigo, Triticum aestivum L. (Ul-Hassan et al., 2009), los CE obtenidos mostraron coloración amarillo-pálida a blanca, de estructura compacta, con forma nódulo-globulares, y relativamente secos; en contraste, los callos no embriogénicos presentaron color amarillo-café, sin textura, de forma irregular, acuosos en apariencia y de mayor desarrollo.

En la inducción de callos se detectaron mayores diferencias (≤ 0.0001) para cinetina, y 6-BAP, mientras que hubo una menor respuesta con sorbitol (P > 0.05), y no se observaron diferencias para 2,4-D. Las mejores respuestas en la inducción de callos fueron observadas en 2,4-D + 6-BAP y 2,4-D + sorbitol; además, se observaron interacciones significativas (P < 0.01) en la variable de respuesta debida a los niveles evaluados (Cuadro 3).

Embriogénesis somática. Callos suaves y embriogénicos (Figuras 2A y 2B) fueron obtenidos en medio MI-13 y MI-14, mediante organogénesis indirecta y embriogénesis; en los callos embriogénicos se pudo observar a las fases propias de la embriogénesis somática en monocotiledóneas: globular, escutelar y coleoptilar. Las masas embriogénicas colocadas en medio de maduración estimularon su desarrollo a embriones somáticos y regeneración de plantas (Figuras 2C y 2D). La formación de pigmento clorofílico en callos embriogénicos fue observable cuando fueron colocados en los medios de regeneración, respuesta similar a la que se observó en Zoysia spp. (Wang et al., 2010).

El pretratamiento de 14 d con sorbitol estimuló la aparición de callos con mejores características morfogenéticas así como la sobrevivencia de células totipotentes y competentes, capaces de sobrevivir a tal efecto e inducir embriogénesis somática. Se detectaron embriones somáticos desarrollados de cariópsides en B. curtipendula, que mostrabano coleoptilo y zonas meristemáticas en los extremos y embrión globular (Figuras 3A y 3B). También se observó un primordio foliar y proembriones, caracterizados por su estructura globular que muestran células meristemáticas y haces de tejido vascular (Figuras 3C y 3D). Otra característica propia identificada es el cotiledón, el cual, según Cabral et al. (2011) envuelve al eje embrionario donde el coleoptilo es típicamente tubular, y se encuentra localizado cerca de la vaina del meristemo del vástago (Figura 3E).

Regeneración de planta. Los callos inducidos bajo estrés osmótico fueron los únicos que mostraron respuesta de regeneración. Sorpresivamente, los callos suaves (organogénicos) y secos en apariencia mostraron una frecuencia de regeneración de 20 % en medio MR-2 (Figura 2A). Sin embargo, las plántulas anormales (brotes adventicios) obtenidas a partir de estos callos mostraron necrosis y murieron a los pocos días. Un alto porcentaje de regeneración en CE se observó en medios suplementados con cinetina/ANA/AG₃, con el mayor valor (95.8 %) en MR-2, mientras que el menor porcentaje de regeneración (66.7 %) se observó en el medio suplementado con thidiazurón (TDZ, MR-4; Cuadro 4).

Los embriones somáticos colocados en medio de maduración respondieron con regeneración temprana de plantas la cual continuó cuando fueron transferidos a medio de regeneración (Figuras 2C y 2D). El papel del sorbitol ha sido relacionado con el balance entre hormonas vegetales endógenas y exógenas, lo que ha permitido incrementar la regeneración (Huang et al., 2012). Según Cabral et al. (2011), los callos embriogénicos obtenidos a partir de cariópsides maduros normalmente no se producen. Por tanto, se infiere que la inducción de embriogénesis somática aquí lograda en B. curtipendula se debió a la inducción de estrés osmótico (o sinergia hormonal) para propiciar la formación de masas proembriogénicas.

En callos inducidos a partir de los medios MI-7 y MI-8 se desarrollaron escutelos fusionados, en los cuales no se observó regeneración de plantas cuando fueron colocados en los diferentes medios de regeneración. En B. brizantha Cabral et al. (2011) sí lograron la regeneración con estos medios, que atribuyeron a la acumulación de 2,4-D en la célula. Los callos embriogénicos colocados en diferentes medios de regeneración no mostraron diferencias en conversión a planta (Cuadro 5).

La mayor regeneración (13.9 %) fue observada en el medio MR-2 que contenía cinetina (1 mg L^-1), ANA (0.2 mg L^-1) y AG₃ (0.2 mg L^-1). Los bajos porcentajes de conversión encontrados (11 a 14 %) muestran que solamente una mínima parte de embriones diferenciados llegan a ser plantas, tal y como ha ocurrido en otras plantas apomícticas. Una de las funciones del sorbitol es como fuente primaria de carbono y regulador osmótico para incrementar la regeneración en callos (Geng et al., 2008); el ácido abscísico (ABA) también ha sido empleado para promover el desarrollo de embriones somáticos y mejorar la regeneración (Huang et al., 2012), así como en inducir la maduración de embriones somáticos tardíos (Fernando y Gamage, 2000).

Los presentes resultados muestran la influencia positiva del estrés osmótico en la inducción de embriogénesis somática de B. curtipendula. Las masas de callos proembriogénicas estuvieron bien diferenciadas cuando se colocaron en medio de regeneración. La relación CIN/ANA/AG₃ fue determinante en regeneración de callos embriogénicos, y se encontró mejor respuesta conforme se redujo la concentración de reguladores de crecimiento en los medios de regeneración. El efecto del thidiazurón observado en callos embriogénicos no se detectó en otros tipos de callos obtenidos. En todos los casos que se alcanzó la regeneración se obtuvieron plantas normales, por lo que esta investigación constituye el primer paso para el mejoramiento de la especie mediante cultivo de tejidos.

CONCLUSIONES

Callos inducidos bajo estrés osmótico o con balance hormonal inducido por la presencia de sorbitol estimularon la formación de callos organogénicos y embriogénicos en B. curtipendula. Solamente los callos embriogénicos formados en medios de cultivo con 2 mg L^-1 de 2,4-D + BAP + sorbitol, dieron origen a plantas regeneradas normales, mostrando diferentes porcentajes de regeneración en los medios evaluados. En esta investigación queda establecido el primer protocolo de regeneración mediante embriogénesis somática desarrollado en Bouteloua curtipendula.

AGRADECIMIENTOS

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