Persistencia de Salmonella Typhimurium en nopal verdura (Opuntia ficus-indica)

Salmonella Typhimurium persistance in prickle pear (Opuntia ficus-indica)

Patricia Landa Salgado¹, Ana María Hernández Anguiano^1*, Mateo Vargas Hernández², Carlos A. Eslava Campos³, Cristóbal Chaidez Quiroz⁴ y Jitu Patel⁵

¹ Campus Montecillo, Colegio de Postgraduados. km 36.5 Carretera México-Texcoco. 56230, Montecillo, Texcoco, Edo. de México. *Autor para correspondencia (ahernandez@colpos.mx)

³ Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad Universitaria. 04510, Coyoacán, Distrito Federal.

⁴ Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A. C. km 5.5 Carretera a El Dorado. 80129, Culiacán, Sinaloa.

⁵ USDA-ARS, ANRI, Bldg. 201, Rm 10. 110300 Baltimore Ave., BARC-East. Beltsville, MD 20705: 595 (95) 20200 Ext. 1610, 1606.

Recibido: 18 de Octubre del 2011
Aceptado: 22 de Febrero del 2013

Resumen

En este trabajo se evaluó la capacidad de S. entérica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) para persistir en cladodios de nopal verdura (Opuntia ficus-indica) y en suelo, así como determinar si las plantas responden a inoculaciones con la bacteria, y comparar dicha respuesta entre diferentes cladodios (cladodios madre, secundarios in planta, y secundarios cortados). S. Typhimurium persistió en suelo y tejido de nopal hasta por 14 d. La capacidad de la bacteria para persistir en el tejido dependió del tipo y la condición fisiológica del cladodio. En cladodio secundario in planta la bacteria persistió 9 d; en cladodio madre in planta y cladodio secundario cortado persistió 14 d, con diferencias (P ≤ 0.05) en la población bacteriana entre tipos y condiciones fisiológicas del cladodio. En tejido, S. Typhimurium indujo lesiones oscuras en el sitio de infiltración en todos los cladodios, lesiones que fueron más intensas en cladodios secundarios in planta a las 48 h, además de síntomas de deshidratación y desprendimiento de tejido. En ausencia de la bacteria no se registraron alteraciones en el tejido. Los síntomas observados indican que S. Typhimurium tiene capacidad de activar señales e inducir una respuesta de defensa en nopal verdura.

Abstract

In this study, S. enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) ability of to persist in prickle pear plants (Opuntia ficus-indica) was evaluated persistence in the soil, plant response to bacterial contamination, as well as comparison of the response among several cladodes (mother cladodes, secondary cladodes in planta, and cut cladodes). was evaluated S. Typhimurium persisted in soil and in plant tissue for up to 14 d. Its persistence in the cladode on the type and physiological condition of the cladode. In secondary in plant cladodes the bacterium persisted for 9 d, while in the mother in plant cladodes and cut secondary cladodes persisted for 14 d, with differences (P ≤ 0.05) in the bacterial population between cladode types and physiological conditions. In the tissue, S. Typhimurium induced dark lesions at the infiltration site in all cladodes, lesions were more intense in plant secondary cladodes at 48 h and showed symptoms of tissue dehydration and detachment. In the absence of the bacteria there were no changes in the tissue. The observed symptoms indicate that S. Typhimurium is capable of activating signals and induce a defense response in prickle pear plants.

Key words: Opuntia ficus-indica, Salmonella, persistence.

INTRODUCCIÓN

El nopal (Opuntia ficus-indica) es una de las principales especies hortofrutícolas producidas en México. Sus tallos o cladodios (nopales verdura o "nopalitos") se comercializan y se consumen en fresco, generalmente por sus propiedades alimenticias y medicinales. El nopal verdura ocupa el primer lugar entre las plantas utilizadas para el tratamiento de diabetes (Saucedo-Tamayo et al., 2006). Sin embargo, recientemente se advirtió la presencia de Salmonella en cladodios frescos obtenidos de plantaciones de nopal donde es común la aplicación de abono orgánico fresco (Hernández-Anguiano et al., 2009).

Salmonella es una bacteria enteropatógena cuyo hábitat natural es el tracto intestinal de mamíferos (domésticos y silvestres), reptiles, aves e insectos. Diferentes serotipos de Salmonella han mostrado capacidad de persistir, es decir, de mantenerse por tiempo prolongado fuera de su hábitat natural y adaptarse a condiciones adversas del ambiente. Por ejemplo, los serotipos Typhimurium y Montevideo de S. entérica persistieron en tomate (Solanum lycopersicon) por 9 y 49 d, respectivamente (Guo et al., 2002; Guo et al., 2001); y por 231 d en perejil (Petroselinum hortense) (Islam et al., 2004). En aguas de río y potable, el serotipo Typhimurium persistió por 45 y 152 d (Santo Domingo et al., 2000; Guan y Holley, 2003). Este mismo serotipo persistió por 7 d en suelo seco y por 63 d en suelo húmedo (Zibilske y Weaver, 1978).

Salmonella tiene capacidad de proliferar en la superficie de tejidos vegetales (Solomon et al., 2002) y también de colonizar tejidos internos de los mismos (Guo et al., 2001), como en semillas, hojas y frutos. Muchos de estos productos consumibles han sido involucrados en brotes de salmonelosis (Doyle y Erickson, 2008). Guo et al. (2001) identificaron células de S. enterica en la pulpa de frutos de tomate, frutos que fueron colectados de plantas inoculadas en etapa de floración, por inyección de tallo y cepillado de flores, con los serotipos Poona, Michigan, Enteritidis, Montevideo y Hartford.

Algunos genotipos vegetales responden específicamente a Salmonella (Klerks et al., 2007 a, b), lo que indica que las interacciones entre plantas y patógenos de humanos no son accidentales, sino programadas genéticamente (Holden et al., 2009). Al respecto, Barak et al. (2005) mencionaron que Salmonella requiere de genes de virulencia, como el gen invA, para colonizar los tejidos de las plantas.

Por su parte, Iniguez et al. (2005) y Schikora et al. (2012) indicaron que las plantas activan mecanismos de defensa en respuesta a enteropatógenos como Salmonella, con efecto en las poblaciones de estos patógenos; según estos autores, la activación del sistema de defensa se debe esencialmente a la presencia del sistema de secreción tipo tres (TTSS, por sus siglas en inglés) y de compuestos extracelulares como la flagelina, en las cepas de Salmonella, compuestos que son reconocidos por receptores de las plantas involucrados en las respuestas de defensa dependientes e independientes del ácido salicílico y de la activación de proteínas relacionadas con el desarrollo de la enfermedad. En contraste, los mutantes del serotipo Typhimurium carentes de estos componentes pudieron colonizar con éxito a tejidos internos de las plantas (Iniguez et al., 2005).

Se ha señalado que las plantas infectadas por Salmonella son asintomáticas, pero estudios recientes han mostrado el desarrollo de síntomas como marchitez, pérdida de biomasa y amarillamiento (Schikora et al., 2008), así como inducción de una reacción hipersensible en el tejido vegetal (Shirron y Yaron, 2011). En observaciones preliminares de cladodios de nopal verdura infiltrados in planta con Salmonella se registraron cambios en la coloración del tejido interno durante las primeras horas después de la infiltración; por la rapidez y características de la respuesta del tejido, así como por la delimitación de la lesión al sitio de inoculación, se consideró que podría tratarse de una respuesta de defensa en la planta de nopal a Salmonella.

Por lo anterior, los objetivos de este trabajo fueron: 1) Evaluar la capacidad de S. enterica serovar Typhimurium ( S. Typhimurium) de persistir en nopal verdura y en suelo plantado con nopal, cuando la planta o la rizosfera del suelo son inoculados con Salmonella; 2) Registrar la respuesta del tejido de nopal a la presencia de S. Typhimurium; y 3) Comparar dicha respuesta entre cladodios in planta y cladodios cortados.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal y cepa bacteriana

Se utilizaron plantas de nopal de la var. 'Milpa Alta', de nueve meses, crecidas en macetas de plástico con una mezcla de suelo-vermicomposta (3.5:1.5 kg) de textura franco arenosa (arena 62 %, limo 31.3 % y arcilla 6.7 %), regadas por gravedad con agua de pozo (dos riegos por semana) y mantenidas en invernadero para la producción de cladodios. Previo a su utilización, se hizo un análisis bacteriológico de muestras del agua de riego, con resultado negativo a la presencia de organismos coliformes, termotolerantes y E. coli presuntiva (NMX-AA-102-SCFI-2006).

La cepa utilizada para inocular fue el serovar Typhimurium ATCC23564, resistente a kanamicina (Sigma-Aldrich®) (50 μg mL^-1) (S. Typhimurium), donada por el Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (Landa-Salgado et al., 2009), y almacenada en una solución de agua-glicerol (50:50) a -20 °C. Previo al establecimiento de los experimentos, la bacteria se reactivó en caldo soya tripticaseína (CST) más kanamicina (CST-Km⁵⁰) a 37 °C por 48 h, y se creció en agar soya tripticaseína más Km⁵⁰ (AST-Km⁵⁰). De las cajas con crecimiento bacteriano se preparó el inóculo en agua peptonada amortiguada (APA) 0.1 %, con pH de 7.0. El suelo y los cladodios (de 20 a 25 cm) se inocularon durante las primeras 2 h después de haberse preparado el inóculo.

Inoculación de suelo

Un volumen de 300 mL de suspensión de S. Typhimurium con 8.4 Log₁₀/mL de unidades formadoras de colonias (UFC) en APA 0.1 %, se infiltró en el suelo de una maceta con una planta de nopal, sin salpicar la planta. En total se inocularon 45 macetas con suspensión bacteriana, y como testigo se contó con 15 macetas a las que se les aplicó solo APA 0.1 %. Este experimento de inoculación se hizo dos veces.

Inoculación de cladodios in planta y cladodios cortados

Para determinar la capacidad de S. Typhimurium de persistir en los tejidos internos del nopal, un volumen de 300 μL de suspensión bacteriana con 7.4 Log₁₀ UFC en APA 0.1 % se infiltró a través de la aguja metálica (30G x 13 mm) de una jeringa de 1 mL (BD Ultra-Fine®), en la parte superior del cladodio. In planta se inocularon 45 cladodios madre y 45 cladodios secundarios, uno de cada uno por planta; más 15 cladodios secundarios cortados. Como testigos se usaron cinco cladodios madre y cinco secundarios in planta, y cinco cladodios cortados, todos ellos inyectados con APA 0.1 % sin la bacteria. Este método de inoculación se repitió de nuevo con el mismo número de cladodios. Después de la inoculación los cladodios in planta se mantuvieron en invernadero, y los cortados en laboratorio. Durante 14 d se colectó cada 24 h un cladodio madre y uno secundario in planta, y uno cortado, para observar la aparición de síntomas y detectar cambios en la coloración en el tejido interno mediante cortes longitudinales en los cladodios.

Persistencia de Salmonella en suelo y tejido de nopal

Después de la inoculación, cada 24 h durante 15 d se colectaron muestras de suelo, de cladodios madre y secundarios in planta, de plantas elegidas al azar, así como de cladodios cortados.

Persistencia en suelo. Se analizaron muestras de suelo (25 g por maceta) de tres macetas inoculadas con S. Typhimurium y de una maceta testigo por día. Cada muestra se depositó en una bolsa Ziploc® estéril y se analizó inmediatamente de acuerdo con la norma NOM-114-SSA1-1994. Cada muestra de suelo se mezcló con 225 mL de APA 0.1 %, con agitación por 30 s. De la mezcla homogeneizada se tomó una alícuota de 2 mL; 1 mL se transfirió a un tubo con 9 mL de APA 0.1 % para hacer diluciones seriales, y de cada dilución se depositaron 100 μL por duplicado en agar entérico Hektoen más Km⁵⁰ (AEH-Km⁵⁰), y se incubaron a 37 °C por 48 h. El otro mililitro se usó para enriquecimiento en CST-Km⁵⁰. De las suspensiones bacterianas obtenidas se tomaron muestras con un asa estéril y se estriaron en AEH-Km⁵⁰. El medio inoculado se incubó a 37 °C por 48 h.

La extracción y estimación del número de células viables de S. Typhimurium se hizo con el protocolo de Madigan et al. (2001). Del área de inoculación de cada cladodio se cortó 1 cm² de tejido con una navaja estéril, se depositó en 900 μL de APA 0.1 %, y la mezcal se maceró en un molino (Seward®, Stomacher 400 circulator) por 1 min a 300 rpm. Del macerado se tomaron tres muestras de 100 μL cada una; una para siembra directa en AEH-Km⁵⁰, otra para hacer diluciones seriales, y una más para enriquecimiento en CST-Km⁵⁰. De las suspensiones obtenidas se tomaron muestras con un asa estéril y se estriaron en AEH-Km⁵⁰, y luego los medios se incubaron a 37 °C por 48 h.

Se obtuvieron 12 cepas presuntivas de Salmonella aisladas en AEH-Km⁵⁰: 3 de suelo, 5 de cladodios madre, 1 de cladodios secundarios in planta, y 3 de cladodios secundarios precortados. De cada cepa se extrajo ADN de células crecidas en tubos con 5 mL de CST-Km⁵⁰ sin agitación, a 37 °C por 24 h; la extracción se hizo de acuerdo con Guo et al. (2000) para la amplificación del gen invA con los iniciadores Sal-3 y Sal-4, y con un paquete (PCR Master Mix, Promega®) para la determinación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), como propusieron Rahn et al. (1992). Como testigo positivo se incluyó ADN de S. Typhimurium. La reacción se efectuó en un termociclador de gradiente (Techne®, TC-512) con el programa: desnaturalización inicial a 94 °C por 1 min; 35 ciclos, cada uno con: desnaturalización a 94 °C por 1 min, alineación de iniciadores a 50 °C por 1 min, extensión de ADN a 72 °C por 2 min; y extensión final a 72 °C por 5 min. El producto de PCR esperado, una banda de 275 pb, se analizó por electroforesis en gel de agarosa 0.8 % con bromuro de etidio (1 μL) y se visualizó en un transiluminador (Gene Wizard®, Syngene Bio Imaging).

Respuesta del tejido de nopal a Salmonella

Para el seguimiento de la aparición de síntomas (daños) en los cladodios después de la inoculación, cada 24 h durante 7 d se colectaron tres cladodios madre y tres secundarios in planta y tres cladodios cortados, tanto de plantas inoculadas con S. Typhimurium como de plantas testigo no inoculadas. Inmediatamente después se realizaron cortes longitudinales en los cladodios y se registraron los cambios en coloración y consistencia del tejido interno inoculado. Para el análisis comparativo entre cladodios in planta y los cortados, se usó una escala porcentual donde: 0 = sin oscurecimiento de tejido; 25 = oscurecimiento tenue de tejido; 50 = oscurecimiento denso de tejido; 75 = oscurecimiento y deshidratación de tejido; y 100 = oscurecimiento, deshidratación y desprendimiento de tejido (Figura 1).

Análisis estadístico

Los datos de poblaciones bacterianas obtenidos de ensayos se transformaron a Log₁₀ UFC/g de suelo o tejido. Los datos se sometieron a análisis de varianza con un diseño completamente al azar, y a una prueba de comparación múltiple de medias (Tukey, 0.05). La respuesta del tejido a Salmonella se sometió a análisis de correlación de Pearson entre el tiempo y el nivel de daño registrado en los cladodios.

Persistencia de Salmonella Typhimurium

Persistencia en suelo. S. Typhimurium persistió por 14 d después de la inoculación (ddi) del suelo plantado con nopal. Después de este tiempo no se detectó la bacteria, aun en muestras sometidas a enriquecimiento en CST-Km⁵⁰. En suelo, el decremento de la población bacteriana fue paulatino y constante, hasta alcanzar niveles de 1 Log₁₀ UFC/g o menos, después de 9 ddi (Cuadro 1). La capacidad de Salmonella de persistir en suelo es muy variable, con periodos desde 7 hasta 63 d (Natving et al., 2002; Ziblinske y Weaver, 1978). Diversos factores pueden afectar la persistencia de bacterias enteropatógenas en suelo. Por ejemplo, Vidovic et al. (2007) reportaron alta tasa de mortalidad de E. coli O157:H7, a 22 °C en suelo franco arenoso limoso con baja concentración de carbono (2 %) y presencia de microbiota nativa, en contraste con un suelo esterilizado y rico en carbono.

Persistencia en tejido. En cladodios madre in planta S. Typhimurium persistió por 14 d, con decremento gradual y constante de la población, hasta alcanzar niveles de 1 Log₁₀ UFC/g o menos, después de 9 ddi. En cladodios secundarios in planta, Salmonella persistió por 9 ddi, pero la población decreció rápidamente durante las primeras 24 h hasta alcanzar niveles de 1 Log₁₀ UFC/g o menos, después de 5 ddi; a partir de los 10 ddi no se recuperó a la bacteria, ni en medios enriquecidos. En cladodios secundarios cortados la bacteria persistió en el tejido por 14 ddi; al inicio la población bacteriana registró un decremento durante los primeros 8 ddi, para luego mostrar un incremento paulatino de cerca de 2 Log₁₀, resultado que contrasta con lo registrado en suelo y en cladodios in planta (Cuadro 1). En persistencia hubo diferencia significativa (α = 0.05) entre los cladodios in planta y los cortados.

Los productos de amplificación por PCR de todas las muestras de las cepas presuntivas de Salmonella (de suelo y de cladodios in planta y cortados en AEH-Km⁵⁰), dieron bandas de 275 pb, similares al de la banda obtenida con el serotipo de S. Typhimurium.

Estos resultados muestran que S. Typhimurium tiene capacidad de persistir en tejido interno de plantas de nopal, aunque su duración depende del tipo de cladodio y de su condición fisiológica. En cladodio secundario la capacidad de persistir y de crecimiento fue limitada, posiblemente asociado con un cambio de color en este tipo de tejido, de verde a café. En contraste, en cladodio secundario cortado el incremento en la población puede estar relacionado con una respuesta tardía en procesos metabólicos como degradación de lípidos en membranas celulares, y por el deterioro postcosecha del tejido que expone nutrimentos esenciales para el desarrollo de Salmonella (Stintzing y Carle, 2005).

Según Pu et al. (2009), las hojas de espinaca ( Portulaca oleracea) de tres a cinco semanas de edad fueron más susceptibles a la colonización por E. coli O157:H7, que las hojas de tres semanas. En contraste, Brandl y Amudson (2008) encontraron poblaciones similares de Salmonella en tejido joven de lechuga in planta y en lechuga cortada. Estas diferencias indican que la colonización por Salmonella puede estar relacionada con el tipo de planta y de tejido.

La capacidad de Salmonella de persistir y de colonizar tejidos vegetales internos es relevante para evaluar contaminación de frutas y hortalizas para consumo en fresco. Actualmente ningún proceso de lavado y desinfestación es 100 % efectivo para remover o eliminar las células bacterianas que pudieran venir adheridas a la superficie de los productos hortofrutícolas frescos. Además, los desinfectantes solamente previenen la contaminación superficial, pero no tienen acceso al interior del tejido vegetal ni a las células endófitas de patógenos como Salmonella (Solomon et al., 2002).

Respuesta del tejido de nopal a Salmonella

En tejido de cladodio madre in planta la lesión se registró con oscurecimiento tenue y ningún otro daño. En cladodio secundario in planta la lesión se registró con oscurecimiento denso a las 48 h ddi, oscurecimiento tenue a 72 h ddi y deshidratación a las 96 h; ningún otro cambio se registró en las siguientes horas. En contraste, en cladodio secundario cortado la lesión se encontró a las 48 h ddi con oscurecimiento tenue, seguida de oscurecimiento denso a las 72 h ddi, y de apariencia deshidratada a las 144 h. En este último caso se encontró que las lesiones se desprendían fácilmente del tejido sano. Los resultados obtenidos muestran que el porcentaje de daño se incrementó con el tiempo en los tejidos de cladodios inoculados. En los cladodios madre in planta y en los cortados la correlación fue de 0.98 y 0.99 (P ≤ 0.0002); en los cladodios secundarios in planta, la correlación fue de 0.77 (P = 0.042) (Cuadro 2).

Aunque Salmonella se ha considerado un patógeno de humanos que puede contaminar cladodios de nopal verdura (Hernández-Anguiano et al., 2009), aquí se demuestra su habilidad para inducir una respuesta de defensa en cladodios in planta y de enfermedad (oscurecimiento denso) en cladodios cortados. En el primer caso podría tratarse de una respuesta de hipersensibilidad por los síntomas característicos de rápido oscurecimiento durante las primeras 48 h, y deshidratación de tejido a las 96 h en los cladodios secundarios in planta. En el tejido oscurecido se aíslan microorganismos que acceden a las sustancias nutritivas de la planta, y sustancias con actividad antimicrobiana como compuestos fenólicos.

Al respecto, Gómez-Flores et al. (2006) encontraron algunos compuestos extraídos de plantas de Nopalea cochenillifera, aparentemente de naturaleza fenólica, que presentaron actividad antimicrobiana contra S. Typhimurium. La rápida disminución en la población bacteriana registrada en los cladodios secundarios in planta, se asoció con el pronto oscurecimiento del tejido infiltrado. En contraste, en cladodios secundarios cortados se detectó recuperación del nivel de la población bacteriana, después de un descenso temporal (Cuadro 1), lo cual permite inferir que la respuesta en los cladodios secundarios in planta está relacionada con la síntesis temprana o la acumulación de compuestos con actividad antimicrobiana, los cuales estarían ausentes o reducidos en los cladodios cortados.

Schikora et al. (2008) descubrieron que aunque S. Typhimurium puede activar el sistema inmune de las plantas, la bacteria puede vencer este sistema al activar la transcripción de genes relacionados con la virulencia, e invadir, proliferar y dispersarse para ocasionar síntomas de clorosis y marchitez en el tejido de plantas de Arabidopsis thaliana. De igual forma, Shirron y Yaron (2011) reportaron en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) que S. Typhimurium indujo una rápida respuesta de tipo hipersensible, la cual se asoció con la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés); la intensidad de esta respuesta fue menor que en plantas inoculadas con la bacteria fitopatógena Pseudomonas syringae.

En nopal la supervivencia de S. Typhimurium se asoció principalmente con la condición fisiológica de los cladodios; in planta el crecimiento de la bacteria se suprimió rápidamente y pocas o ninguna célula viable se recuperó a los 14 d, mientras que en los cladodios cortados la bacteria pudo sobrevivir y multiplicarse. Según Saénz et al. (2006), una vez cosechados los productos hortofrutícolas entran en un rápido proceso de senescencia y se tornan más susceptibles a la invasión por microrganismos.

Por otra parte, las plantas pueden no "reconocer" a los patógenos de humanos como Salmonella y E. coli como potencialmente peligrosos para ellas y consecuentemente no iniciar respuesta de defensa (Berger et al., 2010). Pero estas bacterias no solo pueden inducir una respuesta de defensa en la planta sino que también tienen capacidad para suprimirla (Iniguez et al., 2005; Schikora et al., 2008; Shirron y Yaron, 2011), lo que indica la complejidad de estas interacciones. Por ello, la información del presente estudio contribuye al entendimiento de la interacción entre patógenos de humanos y plantas, fenómeno que aún no se conoce bien, así como de la función de las plantas en el ciclo de vida de bacterias enteropatógenas, como lo señalaron Barak y Schroeder (2012).

CONCLUSIONES

Salmonella Typhimurium presentó capacidad para persistir en suelo y tejido de nopal hasta por 14 d. La capacidad de la bacteria para persistir en el tejido dependió del tipo y la condición fisiológica del cladodio. Esta bacteria también mostró capacidad de inducir una respuesta de defensa en cladodios in planta y enfermedad en los cortados.

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología y al Colegio de Postgraduados, por la beca número 160232 otorgada a la primera autora durante sus estudios de doctorado.

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