Combinación de genes de frijol que le confieren resistencia contra Uromyces appendiculatus (Pers.) Unger
Bean genes combination conferring resistance to Uromyces appendiculatus (Pers.) Unger
Víctor Montero Tavera1, Jorge A. Acosta Gallegos2, Brenda Z. Guerrero García1, Bertha M. Sánchez García2 y Mario M. González Chavira1*
1 Programa de Biotecnología Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Km. 6.5 carretera Celaya–San Miguel de Allende. Apartado Postal 112. 38110, Celaya, Guanajuato, México. Tel. 01(461)6115323. *Autor para correspondencia (gonzalez.mario@inifap.gob.mx)
]]> 2 Programa de Frijol, Campo Experimental Bajío, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Km. 6.5 carretera Celaya–San Miguel de Allende. Apartado Postal 112. 38110, Celaya, Guanajuato, México. Tel. 01(461)6115323.
Recibido: 09 de Febrero del 2010.
Aceptado: 08 de Julio del 2010.
Resumen
U. appendiculatus es el agente causal de la roya del frijol (Phaseolus vulgaris L.), enfermedad que limita su producción en climas templados y con periodos húmedos de al menos 10 h. En México la roya ha provocado disminuciones de hasta 80 % en el rendimiento. La resistencia del frijol a la infección por U. appendiculatus está regulada por al menos 11 genes denominados Ur–3, Ur–4, Ur–5, Ur–6, Ur–7, Ur–9, Ur–11, Ur–12, Ur–Ouro Negro, más otros dos aún no denominados, los cuales confieren resistencia a múltiples razas en función de la combinación presente, lo cual indica que están organizados en grupos y que el tipo de resistencia es específica de razas. En esta investigación se identificaron los genes de resistencia a U. appendiculatus en un genotipo de frijol resistente ('PTB 08005') y dos susceptibles ('Pinto Maverick' y 'Pinto Fresnillo') con el fin de determinar la combinación específica de genes que confiere resistencia a las razas de este hongo presentes en el Estado de Guanajuato, México. Los genes presentes en la variedad resistente, pero no en las susceptibles, fueron Ur–3, Ur–4, Ur–7 y Ur–11. Adicionalmente se identificó la presencia de genes de resistencia en seis líneas experimentales de frijol Pinto con el fin de determinar su potencial de resistencia al patógeno. La línea 117 tuvo el mismo potencial de resistencia que el genotipo 'PTB 08005'.
Palabras clave: Phaseolus vulgaris, genes Ur, marcadores moleculares, resistencia genética a roya.
Abstract
]]> The responsible agent of rust in common bean (Phaseolus vulgaris L.) is U. appendiculatus, a pathogen that reduces bean production in temperate localities with humidity periods of 10 h at least. In México rust causes yield losses up to 80 %. Resistance of common bean to U. appendiculatus is regulated by at least 11 genes, namely Ur–3, Ur–4, Ur–5, Ur–7, Ur–9, Ur–11, Ur–12, Ur–Ouro Negro, plus two more unnamed genes. These genes confer resistance to several rust races depending on the combination present, which provide evidence that genes are arranged into clusters and that resistance is race–specific. The aim of our research was to identify the rust resistance genes contained in a rust–resistant common bean genotype ('PTB 08005') and in two rust–susceptible varieties ('Pinto Maverick' and 'Pinto Fresnillo'), in order to determine the specific gen combination conferring resistance to the U. appendiculatus races prevalent in the state of Guanajuato, México. The genes identified in the resistant variety, but not in the susceptible ones, were Ur–3, Ur–4, Ur–7 and Ur–11. In addition, six experimental lines of Pinto bean type were also tested to determinate their potential resistance to the fungus. The experimental line 117 had the same resistance genes as genotype 'PTB 08005'.Key words: Phaseolus vulgaris, Ur genes, molecular markers, rust disease resistance.
INTRODUCCIÓN
La roya del frijol (Phaseolus vulgaris L.) es ocasionada por el hongo basidiomiceto Uromyces appendiculatus (Pers.) Unger y se presenta en ambientes de clima templado a semicálidos con períodos humedos de al menos 10 h continuas. Se presenta en ambientes donde se siembra frijol y se ha convertido en una limitante para la producción de esta leguminosa, al causar pérdidas variables de hasta 80 %.
U. appendiculatus es un hongo genéticamente variable con numerosas razas fisiológicas, motivo por el cual el frijol se ha adaptado mediante la utilización de aproximadamente 11 genes de resistencia conocidos genéricamente como Ur. Araya et al., (2004) demostraron que en varios países de América Central y del Sur la diversidad de las razas de roya corresponde con los núcleos de domesticación del frijol, lo que sugiere la coevolución de ambas especies. Por otra parte se ha propuesto un sistema binario (Steadman et al., 2002) de genotipos de frijol que incluye seis de raza mesoamericana y seis andinos como variedades diferenciales para identificar las razas de U. appendiculatus. Se ha comprobado que los genes de resistencia se encuentran formando grupos y la resistencia que confieren son raza–específica; por ello diversas combinaciones de genes podrían confieren resistencia a diferentes razas (Corrêa et al. 2000).
En el Estado de Guanajuato, México se han observado reducciones de hasta el 80 % en el rendimiento atribuibles a la infección del patógeno y disminución de 40 a 50 % en el peso seco de planta. Los principales daños ocurren en la etapa de prefloración y floración (SIAFEG, 2009). Recientemente se registró la variedad 'Negro Guanajuato' resistente a U. appendiculatus (Acosta et al. 2008).
Se han identificado marcadores moleculares de diversos tipos, como RAPD, SCAR y STS diseñados para amplificar fragmentos específicos, asociados a la mayoría de los genes de resistencia a roya conocidos hasta la fecha, lo cual es una herramienta que permite caracterizar genéticamente el germoplasma de frijol.
El objetivo del presente trabajo fue identificar la combinación de genes de resistencia presentes en un genotipo de frijol resistente y dos susceptibles, a las razas de U. appendiculatus prevalentes en el Estado de Guanajuato y clasificar seis líneas experimentales de frijol con base en los genes de resistencia que poseen.
]]> MATERIALES Y MÉTODOS
Se seleccionó el genotipo de frijol 'PTB 08005' cuya genealogía es ' Pinto Durango' /' Pto.Villa/MAM 48' resistente a U. appendiculatus con una reacción promedio de 1.0 según la escala propuesta por el Centro Internacional de Agricultura Tropical (Shoonhoven y Corrales, 1987). Como variedades susceptibles se seleccionaron a 'Pinto Maverick' (Grafton et al., 1997) y a 'Pinto Fresnillo' (Rosales et al., 2004) cuya reacción a la roya es de 7.0 y 8.0 en la misma escala, en la que valores de 1 a 3 se asocian con genotipos resistentes, de 4 a 6 con tolerantes, y de 7 a 9 con susceptibles. Adicionalmente se incluyeron seis líneas experimentales de frijol originadas de la cruza 'Pinto Durango' × 'Pinto Saltillo'. Estas líneas se están usando en el mejoramiento de la resistencia en otros tipos de frijol ya que 'Pinto Durango' es resistente a la roya en Guanajuato.
Los nueve genotipos se sembraron durante el ciclo Primavera–Verano 2009 en condiciones de temporal o secano, en Celaya, Guanajuato. Se permitió la infección aleatoria natural del hongo y se colectaron esporas de las primeras plantas con síntomas severos para inocular los nueve genotipos.
La reacción a la roya se midió mediante la escala de Shoonhoven y Corrales (1987). En la etapa de floración se colectaron dos hojas trifolioladas de 10 plantas por genotipo, los cuales se mezclaron uniformemente para formar una mezcla compuesta. A partir de cada muestra compuesta se purificó el ADN total por el método de Dellaporta et al. (1983). La calidad del ADN se determinó por electroforesis en gel neutral de agarosa a 1 % y su concentración se estandarizó a 100 ng uL–1. La identificación de los genes de resistencia a U. appendiculatus presentes en cada genotipo se llevó a cabo con la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingles), con iniciadores correspondientes a 22 marcadores moleculares de ADN asociados con genes de resistencia previamente reportados en la literatura (Cuadro 1).
Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un termociclador Eppendorf® (New York, USA) y se preparó una solución de 25 µL con los siguientes componentes: dNTP's 160 µM, MgCk 2.0 mM, buffer de reacción 0.8X, iniciadores 5uM, Taq polimerasa 1U y ADN 30 ng. El programa de amplificación que se usó para los marcadores tipo SCAR (región amplificada caracterizada por secuencia) constó de desnaturalización inicial a 94 °C por 4 min, 34 ciclos compuestos por 10 s a 94 °C, 40 s a la temperatura de alineamiento que varío de acuerdo al número de bases y la secuencia de los iniciadores empleados (Cuadro 1) y 2 min a 72 °C; y una extensión final de 5 min a 72 °C. El programa de amplificación para los marcadores de tipo RAPD constó de tres ciclos compuestos por 1 min a 94 °C, 1 min a 35 °C y 2 min a 72 °C; 34 ciclos compuestos por 10 s a 94 °C, 20 s a 40 °C y 2 min a 72 °C; una extensión final de 5 min a 72 °C. Los productos amplificados se separaron por electroforesis en gel neutral de agarosa a 1.5 % con voltaje de 3 V cm–1 y TBE 1X como amortiguador. Las bandas obtenidas se documentaron por fotografía sobre luz ultravioleta, previa tinción por 5 min con bromuro de etidio.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En campo la reacción de los materiales de frijol a la roya se determinó en el ciclo de siembra Primavera–Verano bajo condiciones de temporal, evaluación en la que el genotipo 'PTB 08005' presentó un valor de 1.0, por lo cual se clasifica como resistente, 'Pinto Maverick' tuvo un valor de 7.0 y 'Pinto Fresnillo' de 8.0, valores que los ratifican como materiales susceptibles.
De los 22 marcadores estudiados, 20 amplificaron las bandas asociadas con el gen específico de resistencia; luego se seleccionaron los marcadores que permitieron identificar patrones diferentes de genes entre los materiales resistentes y susceptibles a roya, bajo la suposición de que estas diferencias son las responsables de la resistencia o susceptibilidad a la enfermedad. Se observó que cinco marcadores permitieron identificar genes diferentes en los genotipos estudiados, y éstos fueron los amplificados por los iniciadores OAC–20, OPK–14, OA–14, OPAD–12, OPAF–17, y OPU–1 (Cuadro 2), los cuales están ligados a los genes Ur–3, Ur–4, Ur–7 y Ur–11. Estos genes ya han sido caracterizados, marcados y mapeados (Miklas et al., 2006).
En la Figura 1 se observa que el genotipo 'PTB 08005' presentó los cuatro genes, ' Pinto Maverick' presentó tres y ' Pinto Fresnillo' solamente uno. Esto parece explicar los resultados de la reacción a la roya en campo, y permite establecer la asociación entre los genes presentes en el material vegetal, la reacción a la roya y la identificación de genotipos resistentes. Las dos secuencias que identifican al gen Ur–3 amplificaron el fragmento del tamaño esperado en todos los genotipos, excepto en 'Pinto Fresnillo'. Esto indica que la presencia del gen Ur–3 no es suficiente para proporcionar resistencia a la roya en el Estado de Guanajuato, y tampoco da resistencia la combinación de los tres genes que posee 'Pinto Maverick' (Ur–3, Ur–7 y Ur–11), ya que resultó susceptible.
]]> Los marcadores definidos por los iniciadores OPA–12 y OPAF–17 se ligan al gen Ur–7; sin embargo presentan patrones de bandas diferentes entre sí, lo cual indica la posibilidad de identificar dos alelos diferentes del mismo gen, el marcador OPA–12 presentó solamente en la variedad resistente y en una línea experimental.El patrón de bandas de la línea experimental 117 indicó un potencial de resistencia a la roya prevalente en Guanajuato, ya que su perfil fue idéntico al del genotipo 'PTB 08005'. La línea menos prometedora fue la 127 por presentar solamente dos bandas asociadas con genes de resistencia (Ur–3 y Ur–7). Las líneas 108, 125, 130 y 145 presentaron un perfil de bandas que difiere únicamente en una, la definida por el marcador OPAD–12, por lo que su reacción a la roya podría ser intermedia entre las líneas 117 y 127. Estos resultados se deberán corroborar en plantas inoculadas establecidas en campo en diversas localidades o bajo inoculación artificial en invernadero. Dada la alta diversidad genética de U. appendiculatus, en las diversas regiones productoras ocurren diferentes razas en forma simultánea (Araya et al., 2004); por tanto, para que un genotipo sea resistente debe poseer varios genes de resistencia.
Los resultados obtenidos en la reacción a U. appendiculatus de los diferentes materiales y el perfil genético de cada uno, permite establecer la relación entre las combinaciones de genes de resistencia y la reacción a este hongo en condiciones de campo. Los dos genotipos resistentes poseen los genes Ur–3, Ur–4, Ur–7 y Ur–11. El uso de sus marcadores asociados puede incrementar la eficiencia de los programas de mejoramiento de frijol para la obtención de nuevas variedades resistentes por medio de selección asistida por marcadores moleculares. Por otra parte, será posible aplicar este modelo para la identificación de genotipos resistentes para las razas de roya prevalentes en otras regiones del país.
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