Estado nutrimental y crecimiento de vitroplantas de caña de azúcar en respuesta a reguladores de crecimiento

Nutritional status and growth of sugarcane vitroplants in response to growth regulators

Odón Castañeda-Castro¹, Fernando C. Gómez-Merino²*, Libia I. Trejo-Téllez², Miriam C. Pastelín-Solano¹, Yolanda Martínez-Ocampo¹, Ma. Teresa González-Arnau¹ y Marina Guevara-Valencia¹

¹ Universidad Veracruzana, Facultad de Ciencias Químicas. 94340 Orizaba, Veracruz, México.

Recibido: marzo de 2008.
Aceptado: agosto de 2008.

RESUMEN

En este estudio se analizó la influencia de auxinas y citocininas en el contenido de nutrimentos y crecimiento vegetal de vitroplantas de caña de azúcar (Saccharum spp.) de la variedad ITV 92-1424. Se evaluaron dos factores: ácido indol-3-acético (AIA), como fuente de auxina, y N6-fiirfiiriladenina (kinetina o KIN), como fuente de citocinina, con cinco niveles cada uno (0, 0.5, 1, 1.5 y 2 mg L^-1) en el medio Murashige y Skoog, en un experimento con distribución completamente al azar y arreglo factorial 5². El número y tamaño de brotes y la concentración de macro y micronutrimentos se determinaron cuatro semanas después de aplicados los tratamientos. Los datos se analizaron mediante un análisis de varianza y las medias se compararon con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05). La concentración de AIA de 0.5 mg L^-1 produjo las concentraciones más altas de P, K, Ca, Mg, Na, Fe, Cu, Zn y Mn. La KIN incrementó significativamente la concentración de P, K, Ca, Mg, Fe, Zn, Mn, Na y B, y los valores más altos se obtuvieron con las concentraciones de 1 y 1.5 mg L^-1. La interacción de las concentraciones 0.0 y 0.5 mg L^-1 de AIA con 0.5 y 1.5 mg L^-1 de KIN afectó significativamente la concentración de P, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, Mn y Na. El AIA tuvo mayor efecto en la emisión de brotes cuando se adicionó en dosis bajas (0.5 mg L^-1). La KIN no tuvo influencia sobre el número y tamaño de brotes. La interacción de ambos reguladores aumentó el número de brotes cuando no se suministró AIA o cuando se adicionó en dosis bajas, en combinación con dosis bajas y altas de KIN. Se concluye que el estado nutrimental y la emisión de brotes en caña de azúcar son afectados significativamente por la adición de AIA y KIN al medio de cultivo y y por los niveles de estos reguladores en el medio.

Palabras clave: nutrición vegetal in vitro, Saccharum, auxinas, citocininas.

ABSTRACT

Keywords: in vitro plant nutrition, Saccharum, auxins, cytokinins.

INTRODUCCIÓN

Uno de los retos que enfrenta la agroindustria de la caña de azúcar (Saccharum spp.) para ser más competitiva es aumentar su productividad y disminuir costos de producción, por lo cual es necesario introducir los adelantos científicos y técnicos en esta cadena productiva. La biotecnología, a través del cultivo in vitro, ha mostrado sus beneficios al posibilitar la producción de plantas con pureza genética y calidad fitosanitaria que aseguran un mayor amacollamiento, una vez que se han establecido en campo (Tiel et al., 2006). En la actualidad, existen numerosos medios de cultivo utilizados para la propagación in vitro de caña de azúcar, los cuales se basan, principalmente, en las sales de Murashigue y Skoog (MS) (Murashigue y Skoog, 1962), y varían las concentraciones de nutrimentos, elementos orgánicos y reguladores de crecimiento (Lakshmanan et al., 2005).

Los reguladores de crecimiento, en particular las auxinas y las citocininas, tienen funciones determinantes en el éxito de la micropropagación. Por lo general, la auxina ácido indol-3-acético (AIA) produce elongación celular, expansión de los tejidos, división celular (forma callo), formación de raíces adventicias, inhibición de brotes axilares y adventicios y, con frecuencia, embriogénesis en los cultivos en suspensión. La citocinina kinetina (KIN) se utiliza para estimular la división celular, el crecimiento y el desarrollo. La KIN, en concentraciones elevadas (1.0 a 10 mg L^-1), induce la formación de brotes adventicios, inhibe la formación de raíces y retarda el envejecimiento, por lo que es necesario encontrar un balance entre estos reguladores del crecimiento en el medio de cultivo (Pierik, 1990).

Algunos estudios indican que existe una relación entre reguladores de crecimiento, nutrición y crecimiento vegetal. Por ejemplo, Jiang et al. (2001) estudiaron el efecto de la remoción del meristemo apical y la aplicación de ácido naftalenacético (ANA) en la partición y el flujo de potasio en tabaco (Nicotiana tabacum) y encontraron que la aplicación del regulador de crecimiento incrementó la asimilación del K, principalmente en tallos (64.5% del K abastecido) y hojas (27% del K abastecido).

En plantas de papa (Solanum tuberosum) crecidas en suelos deficientes de Zn y B, Puzina (2004) estudió el efecto de tratamientos con 3 mM Zn (como sulfato de zinc) y 8 mM B (como ácido bórico) en el contenido y la relación de reguladores de crecimiento en hojas y tubérculos maduros. El tratamiento con Zn incrementó sustancialmente el contenido de citocininas y la relación citocininas/ácido abscísico, pero disminuyó la relación AIA/citocininas. El tratamiento con B provocó un incremento en el contenido de AIA y la relación AIA/citocinina. El tratamiento con Zn evitó la dominancia apical e incrementó el peso de tubérculos.

López-Bucio et al. (2005) realizaron análisis genéticos y moleculares con diversos mutantes lpr (low phosphate-resistent root) de Arabidopsis thaliana que exhiben formación reducida de raíces laterales en condiciones de deficiencia de P; estos mutantes son alelos del gen BIG, cuya proteína se requiere para el transporte normal de auxinas. La aplicación exógena de auxinas recuperó la formación normal de raíces laterales en los mutantes lpr cuando el medio contenía 1 mM ó 1 μM de P. Cuando los mutantes se trataron con brefeldina A, un metabolito de origen fúngico que bloquea el transporte de auxinas, las alteraciones en el desarrollo de raíces fueron semejantes a las observadas en los mutantes crecidos tanto en 1 mM como en 1 μM de P, lo que sugiere que la proteína BIG participa en la activación de transportadores de auxinas en los tejidos vasculares. En conclusión, el transporte de auxinas y la función de BIG afectan significativamente la elongación de los pelos radicales.

Sakakibara et al. (2006) reportan que el N inorgánico funciona como una señal que regula la expresión de genes relacionados con la modulación del metabolismo y con el desarrollo. Para integrar las señales de N, las plantas utilizan múltiples rutas de señalización. Una de esas rutas depende del nitrato, mientras que otra usa citocininas como mensajero. Las señales específicas del nitrato pueden regular el metabolismo del N y el C, y la biosíntesis de citocininas. Las señales mediadas por las citocininas están relacionadas con el control del desarrollo, síntesis de proteínas y absorción de macronutrimentos.

MATERIALES Y MÉTODOS

La presente investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología del Colegio de Postgraduados, Campus Córdoba (km 348 carretera federal Córdoba-Veracruz, Congregación Manuel León, Amatlán de los Reyes, Ver.), localizado a 646 m de altitud, 18° 51' N y 96° 51' O.

Se utilizó el medio de cultivo de Murashige y Skoog (MS) (Murashige y Skoog, 1962) con los nutrimentos y compuestos orgánicos a 100%, incluyendo 2% de sacarosa (p/v) y 2.15 g L^-1 de Phytagel (Sigma-Aldrich) como agente gelificante. El pH del medio se ajustó a 5.7 ± 0.1 y se esterilizó en autoclave vertical a 1.05 kg cm^-2 y 120 °C durante 15 min.

El material biológico utilizado consistió en vitroplantas de caña de azúcar (Saccharum spp.) de seis semanas de la variedad ITV 92-1424. Se disectaron los ápices de 3 mm de longitud de estas plántulas y se depositaron en frascos de vidrio con capacidad de 45 mL, con 10 mL de medio MS, el cual contenía diferentes concentraciones de AIA y KIN (Cuadro 1). Cada tratamiento tuvo cinco repeticiones y cada una de éstas consistió de un frasco con un explante. Los cultivos establecidos en el medio de cultivo in vitro se mantuvieron en un cuarto de incubación de ambiente controlado, con luz blanca fluorescente, cuya radiación fotosintética activa fue de 50 μmol m^-2 s^-1, con un fotoperíodo de 16 h y temperatura promedio de 24 °C ± 2. El material se mantuvo en estas condiciones por cuatro semanas.

Para el análisis nutrimental, las vitroplantas se lavaron perfectamente con la finalidad de remover por completo residuos de medio de cultivo que pudieran existir. Después, se secaron en estufa de aire forzado a una temperatura de 70 °C durante 72 h. Una vez concluido este tiempo, se evaluó la materia seca y las plantas se molieron en morteros de porcelana con pistilo y luego se determinó la concentración de P, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, Mn, B y Na, por espectrofotometría de gases de absorción atómica de plasma acoplado (ICP-AES Liberty II).

Para analizar el crecimiento de las plantas, en cada repetición, se evaluaron el número (NB) y el tamaño de brotes (TB), cuatro semanas después del establecimiento de los tratamientos.

RESULTADOS Y SISCUSIÓN

El análisis estadístico de las medias de los datos relacionados con la nutrición de las vitroplantas muestra que existen diferencias significativas entre tratamientos (P ≤ 0.05). El factor AIA afectó significativamente la concentración de macro y micronutrimentos en el tejido vegetal (Cuadro 2). Para el P, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, Mn, y Na, los valores más altos se obtuvieron con 0.5 mg L^-1 AIA. Para estos mismos elementos, la ausencia de este regulador del crecimiento (0 mg L^-1 AIA) ocasionó concentraciones que se ubicaron enseguida de las más altas observadas con 0.5 mg L^-1 AIA en el medio de cultivo. Los valores más bajos, por lo general, se obtuvieron en plantas crecidas en medios de cultivo con 1.0, 1.5 y 2.0 mg L^-1 AIA. A este respecto, se sabe que para caña de azúcar una concentración de 0.1 mg L^-1 de ácido naftalenacético (ANA, otra auxina) en el medio de cultivo es suficiente para promover un sano crecimiento in vitro de esta especie (Franklin et al., 2006). Por su parte, Gill et al. (2005) sostienen que 5 mg L^-1 de ANA mejoran la regeneración de vástagos en las variedades CoJ64, CoJ83 y CoJ86 de caña de azúcar y que en ausencia de auxinas no hay regeneración de tejidos en estas variedades. Sin embargo, ningún autor discute aspectos que relacionen las concentraciones de reguladores de crecimiento en el medio de cultivo con la nutrición de la planta.

En el caso del B se excluye la tendencia general observada en la mayoría de los nutrimentos analizados en este estudio, pues, los valores más altos de este elemento se encontraron en plantas crecidas en medios con 2.0 mg L^-1 AIA.

Diversos estudios han demostrado la esencialidad del B en el metabolismo de las auxinas; ejemplo de estos hallazgos es el incremento de la tasa de oxidación del AIA en soya (Glycine max) deficiente en B (Blevins y Lukaszewski, 1998), lo que se atribuye a las interacciones de este elemento con el cofactor AIA oxidasa, magnesio y ácido p-cumérico. La fertilización foliar con B ocasiona menor concentración de Mn en hoja, tanto en menta (Mentha piperita) como en soya y se ha observado la inhibición de la enzima alantoato amidohidrolasa, la cual es dependiente del Mn. El ácido bórico, aplicado al follaje en soya, incrementa hasta 10 veces la concentración de alantoato en hojas tratadas. La acumulación de aloantoato, en respuesta a B, es significativamente menor en plantas asperjadas con Mn. En ensayos in vitro, la actividad de la enzima alantoato amidohidrolasa está determinada por la relación B/Mn en la reacción (Blevins y Lukaszewski, 1998).

El B es requerido para la elongación celular y la morfogénesis normal de embriones. La deficiencia de B en presencia de ácido indolacético exógeno ocasiona ausencia de elongación celular. En presencia de ácido giberélico, la deficiencia de B provoca ausencia completa del desarrollo celular. Cuando se adicionan tanto ácido indol-3-acético como ácido giberélico, la ausencia de B tiene menores efectos detrimentales en el desarrollo vegetativo. En efecto, se ha demostrado que el B está asociado a la regulación enzimática, la división celular, el metabolismo de la célula y la elongación de raíces (Martínez-Pastur et al., 2000).

Puzina (2004) demostró que la aplicación de B incrementa el contenido de ácido indol-3-acético en plantas de papa y postula que resultados similares se podrían esperar cuando los explantes in vitro reciben concentraciones crecientes de B, lo cual se observa en este estudio, pues la concentración más alta de AIA (2 mg L^-1) produjo la mayor concentración de este elemento en tejido vegetal. Como lo establecieron Blevins y Lukaszewski (1998), el B interacciona con la AIA oxidasa, el Mn y el ácido cumárico, y permite un equilibrio dinámico para mantener el crecimiento homeostático de la planta.

La kinetina (KIN) afectó significativamente (P ≤ 0.05) la concentración de todos los elementos analizados (Cuadro 3).

En general, los valores más altos de concentración nutrimental se obtuvieron con la adición de 1 a 1.5 mg L^-1 KIN, excepto en el caso del Cu, pues el valor más alto se observó con una concentración de 0.5 mg L^-1 KIN. El Cu desempeña funciones catalíticas y es parte de enzimas como la polifenol oxidasa (POO) y la ácido ascórbico oxidasa (AOO); la primera guarda una relación positiva con la resistencia a patógenos y el ataque de herbívoros (Mayer, 2006), mientras que la actividad de AOO está relacionada con el desarrollo, en la degradación del ácido ascórbico y el control de la homeostasis de oxígeno en plantas (De Tullio et al., 2007). Además, el Cu está presente en la plastocianina de los cloroplastos (componente importante del sistema transportador de electrones de la fotosíntesis) y puede estar involucrado en la reducción de nitritos (Bidwell, 1993).

Tanto para la concentración de P como para la de K (Cuadro 4), de manera coincidente, los valores más altos se obtienen en los tratamientos T3 y T10. Éstos incluyen la combinación nula y baja de AIA (0 y 0.5 mg L^-1 AIA, respectivamente) con concentraciones medias y altas de KIN (1.5 y 2.0 mg L^-1 KIN, respectivamente). Por otra parte, para el caso de Ca y Mg, los mayores valores se observaron de manera consistente en los tratamientos T4 (0.0 mg L^-1 AIA + 1.5 mg L^-1 KIN), T7 (0.5 mg L^-1 AIA + 0.5 mg L^-1 KIN) y T9 (0.5 mg L^-1 AIA + 1.5 mg L^-1 KIN), lo cual indica que la ausencia y las concentraciones bajas de AIA, combinadas con concentraciones bajas y medias de KIN, incrementan la concentración de estos dos macronutrimentos. Resulta aún más interesante el hecho de que en los cuatro macronutrimentos analizados en este experimento, las concentraciones más bajas de los mismos se observaron en los tratamientos T12 y T21, los cuales incluyen la combinación de concentraciones medias y altas de AIA (1.0 y 2.0 mg L^-1 AIA, respectivamente) con concentraciones bajas y nulas de KIN (0.5 y 0.0 mg L^-1 KIN, respectivamente).

De manera reiterada se observó que para Fe, Cu, Mn y Na, las concentraciones más altas se obtienen con el tratamiento T7 (0.5 mg L^-1 de ambos reguladores de crecimiento) (Cuadro 5).

Un comportamiento diferente se presentó con los elementos Zn y B. Para Zn, el tratamiento T9 (0.5 mg L^-1 AIA + 1.5 mg L^-1 KIN) es el que ocasionó mayor concentración de este elemento en tejido vegetal, mientras que la de B se incrementó con el tratamiento T24 (2.0 mg L^-1 AIA + 1.5 mg L^-1 KIN). Por su parte, los tratamientos T12 (1.0 mg L^-1 AIA + 0.5 mg L^-1 KIN), T21 (2.0 mg L^-1 AIA + 0.0 mg L^-1 KIN) y T22 (2.0 mg L^-1 AIA + 0.5 mg L^-1 KIN) provocaron las concentraciones más bajas de Fe, Zn, B y Na. Para Cu y Mn, las concentraciones más bajas se observaron en los tratamientos T18 y T24, los cuales incluyen de 1.5 a 2.0 mg L^-1 AIA 1.0 mg L^-1 KIN, respectivamente.

El efecto de las concentraciones de AIA en el número de brotes (NB) y tamaño de brotes (TB) se muestra en la Figura 1. El mayor número de brotes (P ≤ 0.05) se observó en los tratamientos que incluyeron 0.5 mg L^-1 AIA, el cual fue de 48.12. En seguida se ubicaron las medias de los tratamientos que no incluyeron el regulador del crecimiento AIA en el medio de cultivo. Al aumentar la concentración de AIA por arriba de 0.5 mg L^-1, el número de brotes disminuyó. A pesar de que este regulador no afectó en forma significativa (P > 0.05) el tamaño de brotes, la tendencia observada indica que a mayor nivel de este regulador del crecimiento en el medio de cultivo, el tamaño de brote tendió a ser mayor.

Las auxinas promueven el crecimiento en tallos y coleóptilos; este crecimiento se produce por un aumento en la extensibilidad de la pared celular, debido a que estos reguladores inducen el transporte de protones hacia la pared celular, tanto por estimulación de H⁺-ATPasas existentes como por el incremento en la síntesis de estas proteínas (Zandonadi et al., 2006). La capacidad de los protones para provocar la pérdida de pared celular está mediada por expansinas, proteínas que rompen los puentes de hidrógeno entre polisacáridos de la pared. La elongación celular, en forma adicional, está regulada por la captación de solutos, la síntesis y el depósito de polisacáridos y proteínas necesarios para mantener la capacidad de desgaste de la pared inducida por ácidos (Zhao, 2008).

Las auxinas también promueven la formación de raíces adventicias en hojas y tallos y la dominancia apical, y favorecen la floración e inducen la diferenciación vascular (Perrot-Rechenmann y Napier, 2005). La proteína ABA I es el receptor de auxinas, pues se une y fija estos reguladores del crecimiento vegetal en primer lugar en la cadena de transducción de señales celulares. Su sistema de transducción involucra AMPc y la cascada de MAP cinasa. La activación transcripcional de genes involucra la ubiquitinación de proteínas reguladoras de ADN (Zhao, 2008). En este estudio se demostró que hubo una influencia significativa de la concentración de 0.5 mg L^-1 AIA en el número de brotes emitidos, aunque no afectó el tamaño de éstos.

El factor KIN no tuvo efectos significativos sobre las variables de crecimiento evaluadas (P > 0.05; datos no mostrados).

Este comportamiento puede explicarse a la luz de que en cada especie existe un balance entre auxinas y citocininas para mantener el crecimiento y desarrollo de órganos; mientras las auxinas (como AIA) aumentan el tamaño de la célula, las citocininas (como la kinetina) incrementan el número de éstas. En este estudio, la variable TB (crecimiento celular) estuvo estimulada por concentraciones altas de ambos reguladores de crecimiento, lo que también afectó la concentración de nutrimentos en el tejido vegetal analizado, y se observó un mejor estado nutrimental en plantas sometidas a las concentraciones más altas de los reguladores de crecimiento evaluados.

CONCLUSIONES

- La concentración de ácido indol-3-acético (AIA) tuvo influencia sobre la concentración de P, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, Mn y Na; los valores más altos se obtuvieron con 0.5 mg L^-1 AIA. La kinetina (KIN) también afectó significativamente la concentración de todos los elementos analizados; en general, los valores más altos se obtuvieron con concentraciones de 1 a 1.5 mg L^-1 KIN. La interacción de AIA y KIN mostró efectos sobre la concentración, tanto de macro como de microelementos.

- El mayor número de brotes se observó en los tratamientos que incluyeron 0.5 mg L^-1 AIA. Al aumentar la concentración de AIA, por arriba de 0.5 mg L^-1, el número de brotes (NB) emitidos disminuyó, mientras que el tamaño de brote (TB) tendió a ser mayor. KIN no tuvo efectos significativos sobre ninguna de las variables de crecimiento evaluadas. La interacción AIA x KIN mostró que la combinación que incrementa significativamente la variable NB es 0.0 mg L^-1 AIA, con 1.5 mg L^-1 KIN (57.2 brotes), seguida de la combinación 0.5 mg L^-1 AIA, con 0.5 mg L^-1 KIN (53.2 brotes). Para el caso del tamaño de brotes se observó una respuesta opuesta a la mostrada en el número de brotes, pues a concentraciones bajas de ambos reguladores de crecimiento o en ausencia de AIA se obtuvo un mayor número de brotes, pero su tamaño fue pequeño y, por el contrario, con las concentraciones más elevadas de estos mismos reguladores del crecimiento, el tamaño de los brotes aumentó, pero se obtuvo un menor número de ellos. La interacción no fue significativa para TB.

LITERATURA CITADA

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