Extracto metanólico de Datura stramonium para el control in vitro e in vivo de Ramularia cercosporelloides, agente causal de la falsa cenicilla del cártamo (Carthamus tinctorius)

Methanolic extract of Datura stramonium for control in vitro and in vivo of Ramularia cercosporelloides, causal agent of false powdery mildew of safflower (Carthamus tinctorius)

Eber Addí Quintana–Obregón¹, Maribel Plascencia–Jatomea¹, Armando Burgos–Hernández¹, José Cosme Guerrero–Ruiz², Norma Violeta Parra–Vergara¹, Mario Onofre Cortez–Rocha¹*

¹ Departamento de Investigación y Posgrado en Alimentos (DIPA), Universidad de Sonora, Rosales y Luis Encinas s/n. Hermosillo, Sonora, México. C.P. 83000.

² Departamento de Agricultura y Ganadería. Universidad de Sonora, Rosales y Luis Encinas s/n. Hermosillo, Sonora, México. C.P. 83000.

* Autor para correspondencia:
Mario Onofre Cortez–Rocha mcortez@guayacan.uson.mx

Recibido 14 de agosto 2009.
Aceptado 13 de marzo 2010.

Abstract

The safflower production in the Mexican state of Sonora has been significantly affected by a new fungal disease caused by Ramularia cercosporelloides. Producers have been applied several fungicide treatments which implies high economic investment and high risk for environment pollution. The aim of this study was to evaluate the potential antifungal activity of the methanolic extract of Datura stramonium as an alternative to control this fungus. The effect of the methanolic extract on the radial growth kinetic, biomass production and the concentration required to delay 50% (CR₅₀) of radial growth were determined. An in vivo test was done to evaluate the effect of the methanolic extract on the safflower seed germination. The methanolic extract 10%, v/v caused 75.0% inhibition on the fungal growth at 96 h of incubation in media v8. When the CR₅₀ (3.0%, v/v) was applied the radial inhibition was 32.0%. The methanolic extract did not affect the biomass production. The safflower seed germination was not affected by the methanolic extract because most of the s normally developed.

Key words: Inhibition growth, extract plant, safflower.

Resumen

La producción de cártamo en Sonora se ha visto significativamente afectada por el desarrollo de una enfermedad causada por el hongo Ramularia cercosporelloides. Productores locales han aplicado severos tratamientos con fungicidas incrementando los riesgos para el medio ambiente. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el uso del extracto metanólico de Datura stramonium como una alternativa para el control de R. cercosporelloides. Se evaluó el efecto del extracto metanólico sobre la cinética de crecimiento radial del hongo, determinando la concentración requerida para retardar la extensión radial en un 50% (CR₅₀) y se cuantificó la producción de biomasa. Además, se evalúo la germinación de semilla de cártamo tratada con el extracto metanólico de Datura stramonium. El extracto metanólico al 10% (v/v) inhibió en 75.0% el crecimiento radial de Ramularia a las 96 h de incubación en medio v8, y 32.0% al utilizar la CR₅₀ (3.0% v/v). El extracto metanólico no afectó la producción de biomasa con respecto al control metanólico. En germinación de semilla, se observó que la aplicación con el extracto metanólico no protegió contra la invasión de Ramularia. Sin embargo, las semillas germinaron y la plántula se desarrolló normalmente.

Palabras clave: Inhibición de crecimiento, extracto de plantas, cártamo.

Introducción

Carthamus tinctorius L. es una planta miembro de la familia Compositae. En México la producción de cártamo ha sido afectada en los últimos años por una enfermedad denominada "falsa cenicilla del cártamo". El agente causal de esta fue recientemente identificado como el hongo Ramularia cercosporelloides U. Braun & Crous (Huerta–Espino et al., 2006). La aparición de dicha enfermedad generó grandes pérdidas económicas en el ciclo agrícola 2000/2001, al disminuir el rendimiento promedio de producción de 2.2 Ton/ha a 1.4 Ton/ha agravándose el problema durante el ciclo 2004/2005 (CESAVE Sonora, 2008). Con base a lo anterior, se desarrollaron campañas de prevención y control de R. cercosporelloides mediante la aplicación de agentes fungicidas de uso agropecuario. Sin embargo, esta acción ha originado mayor gasto para el productor, debido a que se han requerido de hasta tres dosis adicionales por hectárea. Aunado a ello, los efectos adversos provocados por las excesivas cantidades de fungicidas (recalcitrancia, daños a la salud y contaminación ambiental, entre otros); lo cual ha obligado a la búsqueda de compuestos alternativos para controlar el crecimiento del hongo y así prevenir el desarrollo de la enfermedad. En este contexto, el uso de extractos de plantas silvestres o sus aislados, ha sido considerado como una alternativa viable para el control de bacterias y hongos (Draughon, 2004).

En Sonora se ha reportado el uso de plantas silvestres para el control de hongos fitopatógenos. Suárez–Jiménez et al., (2007) y Tequida–Meneses et al., (2002) reportaron la actividad fungistática de extractos metánolicos de plantas como Ambrosia confertiflora DC. (estafiate), Azadirachta indica A. Juss (neem), Baccharis glutinosa Pers. (batamote), y Larrea tridentata DC. (gobernadora o hediondilla). Sin embargo, existen muchas otras de las que se ha estudiado poco sobre sus propiedades antifúngicas o no hay reportes sobre su utilización, siendo el toloache (Datura stramonium L.) una de ellas. Ésta es una planta del orden de las Solanaceas, hierba–arbusto de 30 cm a 1 m de alto, con fruto en forma de cápsula erecta armada con espinas largas y agudas (Heike, 2005). Además es una planta con resistencia y persistencia a plagas de insectos y hongos en la región. Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto antifúngico in vitro del extracto metanólico de D. stramonium sobre el agente causal de la falsa cenicilla del cártamo y su efecto sobre la germinación de la semilla de cártamo.

Materiales y Métodos

Microorganismo

Se utilizó una cepa de Ramularia cercosporelloides aislada de cultivos comerciales de cártamo de la región del Valle del Yaqui, Sonora (Huerta–Espino et al., 2006). La cepa refrigerada (5–7 °C) se traspasó a medio de cultivo agar papa dextrosa, PDA (Bioxon, USA) e incubándose a 25°C durante 7 días en oscuridad (Zhao et al., 2002). Posteriormente se obtuvo un subcultivo en medio PDA a 25°C durante 7 días con fotoperiodos de 12 h luz–oscuridad (PRECISION Low Temperature Illuminated Incubator 818, LabMechanics, USA). El subcultivo se inoculó en 20 mL de medio agar jugo de vegetales v8 (medio v8), preparado como sigue: 200 mL de jugo v8, 3 g de CaCO₃, 15 g de agar base, y agua destilada hasta un volumen final de un litro (ATCC, 2008). Se incubó a 25°C durante 7 días, con fotoperiodos de 12 h luz–oscuridad. Posteriormente, las esporas y el micelio fueron resuspendidos en 20 mL de solución estéril de Tween 20 (0.1%), mediante agitación magnética por 10 minutos. El inóculo se estuvo renovando cada 7 días después de preparado.

Extracto metanólico de Datura stramonium

Se colectaron muestras de D. stramonium en el área rural a 19 km al Este de Hermosillo, Sonora. Las plantas estaban alejadas de 3 a 4 km de la carretera principal. Se tomaron únicamente partes aéreas de la planta, tallos y hojas. Se secaron a temperatura ambiente a la sombra por 15 días. Se molió por separado tallos y hojas en un molino de martillos (Wiley laboratory mill modelo 4) hasta un tamaño de partícula de 0.5–1.0 mm. Se depositó cada fracción molida en bolsas Ziplock^®, se cubrieron con papel de estrasa y se guardaron en refrigeración a –4°C hasta su uso.

El extracto metanólico se preparó de acuerdo a la técnica de Tequida–Meneses et al. (2002). Se elaboró el extracto al 10% (p/v) en metanol al 70%, usando para ello 5% de tallo y 5% de hoja (p/p). Se agitó por 15 minutos seguido de un reposo de 48 h a 25°C en la oscuridad. Se filtró en papel Whatman No. 4 y se descartaron los sólidos. El sobrenadante se redujo de 50 mL hasta 20 mL a 40°C y 45 rpm (0.09 g) en un rotavapor con vacío (LABCONCO ROTARY EVAPORATOR, LABCONCO CO., USA). Esta solución es el extracto metanólico de D. stramonium al que se hace referencia en los ensayos. Esta evaporación también se realizó al metanol al 70%, que se utilizó en los medios de control metanólico (solución de metanol evaporada).

Crecimiento radial

Diferentes porciones de extracto metanólico de D. stramonium fueron mezcladas con el medio de cultivo agar v8 estéril; posteriormente se vaciaron en placas Petri de 5 cm de diámetro. La concentración del extracto metanólico en los medios de cultivo fue de 1.25, 2.5, 5.0, y 10.0% (v/v). Como control se utilizó medio agar v8 adicionado con solución de metanol evaporada (v/v) (control metanólico), utilizando además un control de medio agar v8 sin metanol (control sin disolvente) (Tequida–Meneses et al., 2002).

La evaluación del crecimiento de extensión radial se realizó con la técnica descrita por Plascencia–Jatomea et al., (2003) modificada como sigue: en el centro de cada placa Petri previamente preparada con el medio de cultivo se realizó una perforación de 0.6 cm con una pipeta Pasteur formando un pozo. Se inoculó en el pozo de cada caja de Petri 25 [il del inóculo de esporas, debido que no se logró determinar la concentración de esporas, como se explica en el apartado de discusiones y se incubó a 25°C con fotoperiodos de 12 h luz–oscuridad. Se midió el diámetro de la colonia de R. cercosporelloides cada 12 h para determinar la cinética de crecimiento radial y se comparó el valor con respecto al control metanólico. Se calculó el porcentaje de inhibición de crecimiento radial con la ecuación descrita por Plascencia– Jatomea et al, (2003) y Holmes y Eckert (1999):

Inhibición radial (%) = [(X_c – X_i)/X_c] x 100

Se determinó la dosis requerida para controlar el crecimiento radial en un 50% (CR₅₀) con respecto al control metanólico, para lo cual se utilizó análisis Probit con un intervalo de confianza de 95% en el programa estadístico NCSS 2000 (NCSS Inc., USA) (Infante y Calderón, 1994; Finney, 1952).

Biomasa

Con el valor de CR₅₀ obtenido a partir de los datos de la cinética de crecimiento radial, se procedió a preparar medios para cuantificar la producción de biomasa. Para ello se utilizó medio agar v8 esterilizado a 121°C por 15 min, se dejo enfriar hasta cerca de 45°C y se mezcló con el extracto metanólico de D. stramonium para obtener una solución final al 3% (v/v). Se prepararon también controles (control metanólico y control sin disolvente) que también se vaciaron en placas Petri de 5 cm de diámetro.

Cada una de las placas de Petri preparadas se inoculó con 25[ ldelasuspensión de esporas y micelio colocados en el centro. Se distribuyeron en toda la superficie del medio con ayuda de una varilla de vidrio estéril (Paul et al., 1993) y se incubaron a 25°C con fotoperiodos de 12 h luz–oscuridad. Cada 12 h se tomaron al azar de cada tratamiento 3 placas para cuantificar el peso seco de las colonias desarrolladas. Para ello, el medio de cultivo con el micelio fue separado de la placa y traspasado a un vaso de precipitado con 50 ml de agua destilada. Se calentaron en la autoclave hasta alcanzar 15 lb de presión e inmediatamente se desconectó la fuente de calor. De la solución obtenida se separó el micelio por filtración en papel Whatman # 2 previamente llevado a peso constante. El papel filtro con el micelio se secó en estufa de convección de aire a 105°C por 2 h y se enfriaron en un desecador. El peso seco de la colonia se expresó en mg/cm² de placa (Larralde et al., 1997; López et al., 1997).

Germinación de semilla de cártamo e infección fúngica

Se preparó una solución de extracto metanólico de D. stramonium al 3 % (v/v) disuelto con agua estéril. Además un control que consistió en metanol (70%) llevado al 3% (v/v) con agua estéril y se evaporó reduciendo el volumen de 50 mL a 20 mL en el rotavapor a 40 °C y 45 rmp.

La germinación de semilla de cártamo se realizó de acuerdo a Cruz et al. (2005) con las siguientes modificaciones: las semillas se desinfectaron superficialmente por remojo en solución de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1% por 2 minutos. Se lavaron dos veces con agua destilada estéril y se dejaron secar sobre papel estéril. Se hicieron al azar dos lotes, cada uno con 50 semillas desinfectadas, los cuales se remojaron por separado durante 15 y 60 min. Después de cada tiempo de remojo se tomaron 10 semillas que se dejaron secar durante 3 horas en condiciones asépticas. Posteriormente, cada semilla se sumergió individualmente en 20 mL de suspensión de micelio y esporas por 5–10 s para infección artificial por inmersión. Estas semillas se colocaron en placas de Petri de 8 cm de diámetro con papel de estrasa en la base y sobre este una capa de algodón previamente mojados con agua estéril. Se incubaron a 25°C con fotoperiodos de 12 h luz–oscuridad y se contó el número de semillas germinadas e infectadas a las 72 horas.

Ensayo in vivo

Para el ensayo in vivo se tomaron 10 semillas remojadas por 60 minutos de cada tratamiento (extracto de D. stramonium y los controles) como se describió previamente y se contaminaron artificialmente por inmersión en la suspensión de inóculo por 30 s. Cada semilla se colocó en un vaso con tierra de invernadero estéril y se incubó a 25°C con fotoperiodos de 12 h luz–oscuridad. A las 96 horas se midió la altura de la plántula de manera manual con una regla y el ancho de la plántula con un caliper digital (Truper®).

Los ensayos de crecimiento radial se realizaron por cuadruplicado, la producción de biomasa por triplicado, germinación de semilla por cuadruplicado y de semilla in vivo por decena. Se realizó un análisis estadístico de varianza (ANOVA) para determinar diferencia estadística entre los tratamientos de cada ensayo. Además se determinó la CR₅₀ mediante análisis Probit con el programa NCSS (2000). Asimismo, se compararon los tratamientos con la prueba de rangos múltiples de Tukey (P<0.05) y pruebas de contraste con el programa estadístico JMP versión 5.0.

Resultados

El crecimiento radial de R. cercosporelloides en el medio agar v8 y el medio agar v8 adicionado con solución de metanol al 70% evaporado (control metanólico) no presentaron diferencia significativa entre sí (P<0.05). Se observó que el extracto metanólico de D. stramonium a diferentes concentraciones inhibió significativamente (P<0.05) el crecimiento radial del hongo a las 48 h (Figura 1).

Se observó que el porcentaje de inhibición del radio de la colonia se incrementó al aumentar la concentración de extracto metanólico en el medio, encontrando porcentajes de inhibición radial de 33.70 ±2.36, 46.41±2.11, 56.35±2.28 y 75.69±2.7 para las concentraciones de extracto 1.25, 2.50, 5.0, y 10% (v/v), respectivamente a las 96 h. Además mostraron diferencia significativa (P<0.05) con respecto al control metanólico y control sin solvente. Se estimó mediante análisis Probit que la cantidad de extracto metanólico de D. stramonium requerida para retardar el crecimiento radial de la colonia en un 50% (CR₅₀) a las 96 h es de 3.0% (v/v). Al utilizar la CR₅₀ se observó que el crecimiento radial de R. cercosporelloides presentó diferencia significativa (P<0.05) con respecto al control sin disolvente y al control metanólico (Tabla 1) (Figura 2).

Los porcentajes de inhibición radial para una concentración de 3.0% de extracto metanólico de D. stramonium fueron de 48.8±2.94, 36.9±1.90 y 32.7±1.11% a las 48, 72 y 96 h, respectivamente. La velocidad de crecimiento radial de la colonia fue de 0.091 mm/h (R²>0.9) y en el control metanólico de 0.115 mm/h (R²>0.9), lo cual indica que el extracto metanólico presenta efecto fungistático al retardar la velocidad de extensión radial del hongo.

El extracto metanólico de D. stramonium causó un efecto moderado en la producción de biomasa del hongo, encontrando valores estadísticamente similares (P<0.05) con respecto al control. La tasa específica de crecimiento del hongo fue de 0.040 y 0.037 mg/h por cm² para el control metanólico y el extracto metanólico de D. stramonium, respectivamente; en ambos casos los coeficientes R² fueron superiores a 0.90.

Germinación de semilla de cártamo e infección fúngica

En germinación de semilla de cártamo no se encontró diferencia significativa (P<0.05) entre el control metanólico, control sin disolvente, y extracto metanólico de D. stramonium ni entre los tiempos de remojo (datos no presentados). En lo referente al porcentaje de infección en semilla de cártamo, en los dos tiempos de remojo (15 y 60 min), se presentó infección cercana al 100% sobre la superficie a las 72 h, y no se encontró diferencia significativa (P<0.05) entre los dos tratamientos (datos no presentados).

Las plántulas resultantes de las semillas sembradas en vasos y sometidas a 60 min de remojo, no mostraron evidencia física de infección a las 96 h posteriores a su siembra en vasos. Asimismo, no se observó diferencia significativa (P≥ 0.05) entre la altura de las plántulas ni en el grosor de la parte media de los tallos. La altura de las plántulas fue de 0.96±0.30, 1.12±0.41 y 1.12±0.42 cm para las del control sin solvente, control metanólico, y extracto de D. stramonium, respectivamente. Por otra parte, el grosor de la parte media de las plántulas fue de 1.55±0.42, 1.62±0.44, y 1.51±0.42 mm para el control sin solvente, control metanólico, y extracto de D. stramonium, respectivamente.

Discusión

Existe escasa información y reportes sobre la especie Ramularia cercosporelloides. Kirschner (2009), reporta que es difícil trabajar con esta especie en laboratorio, ya que según las condiciones de crecimiento puede presentar estructuras reproductoras correspondientes al género Ramularia, en otras al género Cercosporella, y cambios en la estructura las esporas.

Al observar las características de la morfología de las estructuras reproductoras del hongo durante la preparación de los inóculos, se observó la presencia de esporas de ambos géneros, Ramularia y Cercosporella. La cantidad de las mismas variaba aún entre muestras observadas de un mismo cultivo, por lo que se estandarizó las condiciones de cultivo y la suspensión de esporas y de micelio. Por ello, es necesario establecer condiciones de crecimiento de este hongo en laboratorio que favorezcan el desarrollo de una sola forma reproductora (conidio).

En este estudio, al no encontrar diferencia significativa entre el control sin disolvente y el control metanólico en crecimiento radial y producción de biomasa, se demuestra que la técnica de extracción y obtención del extracto de D. stramonium es adecuada, y por lo tanto, el efecto inhibidor encontrado en los ensayos se puede atribuir únicamente a los compuestos extraídos de la planta.

No se ha encontrado en la literatura estudios de extractos de plantas para el control de este hongo en particular, sin embargo, existen reportes en otros organismos como hongos fitopatógenos y bacterias. Efectos en la inhibición de crecimiento como el producido por el extracto metanólico de D. stramonium en R. cercosporelloides han sido reportados en bacterias Gram–positivas por Pérez et al. (1993), ya que en su estudio señalan inhibición por extractos acuosos y metanólicos (al 2.8%) de Sechefflera octophylla EndI. Así mismo, Tequida–Meneses et al. (2002) reportan inhibición en seis especies de hongos por extracto metanólico y etanólico de Larrea tridentata en un rango del 41% hasta el 100%, con extracto metanólico de Bacharis glutinosa del 66% y 53% para Fusarium poae (Peck.) y Fusarium moniliforme (Sheldon), respectivamente. Lo cual indica que el metanol por su polaridad es un solvente adecuado para extraer compuestos con propiedades antifúngicas.

Rivera–Castañeda et al. (2001) estudiaron el extracto metanólico de D. stramonium, aunque no mencionan si éste presentó efecto inhibidor, reportan que no favorece el crecimiento del hongo Tilletia indica Mitra. Türküsay y Onogur (1998) reportaron inhibición fúngica por extractos de D. stramonium en medio PDA, mientras que Eftekhary et al. (2005) encontraron actividad antimicrobiana del extracto metanólico de D. stramonium con presencia de alcaloides en concentración de 2.5 g/L, sobre bacterias Gram–positivas. Asimismo, Hernández et al. (2007) observaron efecto antifúngico en Colletotrichum gloesporioides (Penz.) por el extracto crudo de Cestrum nocturnum (Jeps.), una solanaceae al igual que D. stramonium.

Al no detectar cambio en la producción de biomasa por R. cercosporelloides con el extracto metanólico de D. stramonium, nos indica que a pesar de existir un efecto inhibitorio en el crecimiento radial de la colonia, ésta puede estar desarrollando micelio aéreo. Roller y Covill (1999) reportan la formación de colonias fúngicas compactas con producción de micelio aéreo en medio de cultivo con compuestos naturales. Asimismo, Plascencia–Jatomea et al. (2003) reportan alta densidad de micelio durante el crecimiento de Aspergillus niger como respuesta a la presencia de compuestos antifúngicos naturales, formando colonias compactas y con micelio aéreo. Es posible que el extracto metanólico de D. stramonium en R. cercosporelloides este causando el mismo efecto que el observado por estos autores.

Al no encontrar diferencia significativa en el porcentaje de germinación de la semilla de cártamo entre los tratamientos, indican que la solución de disolvente evaporada y el extracto de la planta no afectan la germinación de la misma. En lo referente al porcentaje de infección en semilla de cártamo, el desarrollo del hongo sobre la plántula no presentó evidencia física de daños en la emergencia de la plántula ni en el desarrollo posterior. La falta de protección de la semilla a la falsa cenicilla del cártamo puede deberse entre otros factores, a la presencia no solo de alta contaminación superficial, sino también a la presencia de infección interna natural proveniente del campo. Lo anterior ya que aún cuando se realizó una desinfección con hipoclorito de sodio de manera superficial, la contaminación interior permaneció. Por lo tanto el extracto metanólico de D. stramonium (3.0%) no fue adecuado para controlar el crecimiento in vivo del hongo. Por lo anterior se debe probar con concentraciones más altas, como se reporta en estudios para otras semillas, o aislar y purificar el compuesto activo contenido en el extracto metanólico de D. stramonium para su estudio.

La evaluación del porcentaje de germinación de la semilla se hizo para determinar si los disolventes que contenía el extracto de D. stramonium influían en la germinación, demeritando un importante atributo para el agricultor al tratar de combatir la infección fúngica.

Aún cuando las plántulas obtenidas de semillas sembradas en los vasos de poliuretano no manifestaron daño físico aparente en ninguno de los tratamientos, no implicó que el hongo no haya estado presente en la planta, pues previamente las semillas habían sido infectadas artificialmente, lo que indica que el mecanismo de entrada a la planta ocurre de manera sistemática. Walters et al. (2008) reportan en cebada que desde la semilla hasta los primeros estadios de crecimiento no se presenta evidencia física o sintomatológica de infección por Ramularia collo–cygni, siendo ésta solo detectable por la técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR). Asimismo, la manifestación y sintomatología de la enfermedad se presenta cuando la planta pasa de un estado de crecimiento vegetativo al estado reproductor.

Agradecimientos

Estudio apoyado parcialmente con recursos del proyecto 58249 financiado por CONACYT: Evaluación de la actividad antifúngica in vitro de extractos vegetales y quitosano y de su impacto en la producción de micotoxinas por Fusarium verticillioides y Aspergillusflavus.

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