Descripción de cultivos miceliares de Boletales neotropicales y europeos (Boletus grupo edulis, Boletellus y Suillus) y formación de primordios de B. edulis en cultivo puro
Description of mycelial cultures of Boletales (Boletus of the edulis group, Boletellus and Suillus) from Guatemala and primordium formation of B. edulis in pure culture
Gisela Díaz1 * , Roberto Flores2, Mario Honrubia3
1 Departamento Biologia Aplicada, Área Botánica. Universidad Miguel Hernández de Elche. Avda. Universidad s/n 03202 Elche, España.
2 Departamento Microbiología. Facultad Ciencias Químicas y Farmacia. Universidad de San Carlos de Guatemala. Guatemala.
]]> 3 Departamento Biología Vegetal Facultad Biología. Campus Espinardo. Universidad Murcia. 30100 Murcia, España.
*Autor para correspondencia:
Gisela Díaz gdiaz@umh.es
Recibido 10 de octubre 2008
Aceptado 17 de julio 2009
Abstract
The morphological features of 7 mycelial culture fungal strains belonging to Boletales from Guatemala (2 of Boletus edulis, 1 of B. pinophilus, 1 of B. luteoloincrustatus, 1 of Boletellus russelii, 1 of Suillus tomentosus, 1 of S. bovinus) and 3 fungal strains from Spain (2 of Boletus edulis, 1 of B. pinophilus) are described. They were grown in MNM, Moser B, Gamborg and Pachlewski culture media. The maximal growth was obtained with MNM and Moser medium. Boletus mycelia of the edulis group were similar among them. B. luteoloincrustatus mycelia were darker in colour than B. edulis and B. pinophilus. Suillus tomentosus have a faster growth than the other strains tested in MNM medium. Primordia of B. edulis SO 18 with rudimentary stipe and pileus were obtained in bottles with peat–vermiculite and MNM medium but not in tubes with PDA, at different pH levels.
]]> Key words: mycelial growth, edible fungi, mycorrhizas, wild strains.
Resumen
Se describen las características morfológicas de cultivos miceliares de 7 cepas de Boletales procedentes de Guatemala (2 de Boletus edulis, 1 de B. pinophilus, 1 de B. luteoloincrustatus, 1 de Boletellus russelii, 1 de Suillus tomentosus, 1 de S. bovinus) y 3 cepas procedentes de España (2 de Boletus edulis, 1 de B. pinophilus) cultivadas en los medios de cultivo MNM, Moser B, Gamborg y Pachlewski. En general, los mayores crecimientos de micelios se obtuvieron con los medios MNM y Moser. Los micelios de las cepas de Boletus grupo edulis fueron similares entre sí. B. luteoloincrustatus produjo micelios de color beige más oscuro que B. edulis y B. pinophilus. Suillus tomentosus presentó mayor velocidad de crecimiento que el resto de las cepas en los medios MNM y Moser. Se obtuvo la formación de primordios diferenciados en píleos y estípites rudimentarios en la cepa B. edulis SO 18 en frasco con turba–vermiculita y medio MNM, pero no en tubos con PDA a diferentes valores de pH.
Palabras clave: crecimiento micelial, hongos comestibles, micorrizas, cepas silvestres.
Introducción
En el norte del Neotrópico (México y Centroamérica) se desarrollan la mayor parte de los géneros y especies de Boletales que se conocen del Hemisferio Norte (Singer et al, 1983; Sommerkamp y Guzmán, 1990; Gómez, 1996; Flores et al, 2000). La mayoría de las especies han sido identificadas con los nombres de especies europeas. Sin embargo, la determinación taxonómica de especímenes neotropicales es complicada debido a diferencias morfológicas, moleculares y de cultivo con las especies europeas, que es necesario conocer. Así, aunque muchas especies crecen en ambas regiones, existen también especies de distribución restringida, como B. guatemalensis Flores & Simonini y B. luteoloincrustatus Flores & Simonini en Guatemala (Flores y Simonini, 2000) y B. flavoniger Halling, B. neoregius Halling & G.M. Muell. y B. quercophillus Halling & G.M. Muell. en Costa Rica (Halling y Mueller, 1999).
El orden Boletales incluye géneros que han sido muy estudiados y utilizados en la producción de planta forestal micorrizada, tales como Rhizopogon, Suillus, Pisolithus o Scleroderma (Marx, 1977; Cairney y Chambers, 1999). También incluye otros géneros micorrícicos, como Boletus grupo edulis, con especies de gran interés para la producción de cuerpos fructíferos comestibles. Por ello, algunas especies de este grupo se han utilizado para intentar inducir la formación de basidiomas en cultivo puro (Pantidou y Watling, 1973; Giltrap, 1981; Yamanaka et al., 2000), existiendo solo una cita previa de formación de primordios con B. edulis (Karpinski, 1967). Sin embargo, los resultados positivos de micorrización controlada en condiciones experimentales son muy escasos, en ocasiones confusos o con poca difusión, y siempre utilizando cepas europeas (Zuccherelli, 1988; Cerutti et al., 1985–86; Cerutti et al., 1987–88; Rodríguez et al., 1992; Meotto et al., 1994; Águeda et al., 2008). En todo caso, el estudio del comportamiento de estos hongos en cultivo puro y sus requerimientos constituye la base de la producción de inóculo, etapa necesaria para la síntesis micorríca en plantas de importancia forestal y posterior producción de carpóforos.
El objetivo de este trabajo fue describir las características morfológicas de cultivos miceliales de algunos Boletales que crecen en Guatemala, y su comparación con cepas europeas, con el fin de identificar las características de cultivo que pudieran ser consideradas como base, tanto para estudios taxonómicos que permitan aumentar el conocimiento sobre la identidad de nuevas cepas neotropicales, como para estudios aplicados orientados a la síntesis micorrícica con hongos comestibles. Este trabajo forma parte de un estudio más amplio que tiene como finalidad la caracterización de hongos comestibles de Guatemala, su simbiosis micorrícica y su comparación con cepas europeas (Díaz et al., 2007; Flores et al., 2005, 2008a y b).
]]>Materiales y métodos
Material fúngico
Los basidiomas de Boletus edulis Bull.: Fr., B. pinophilus Pilát & Dermek B. luteoloincrustatus, Boletellus russelli (Frost) Gilbert, Suillus bovinus. (L.) Kuntze y S. tomentosus (Kauff.) Sing. fueron recolectados en distintos lugares, fechas y bajo diferentes especies vegetales, tal como se muestra en la Tabla 1. Las cepas fueron aisladas y subcultivadas cada tres meses en medio MNM y mantenidas en tubos a 4°C hasta su utilización. Además, para tener un patrón de referencia para B. edulis y B. pinophilus, se utilizaron varias cepas aisladas de basidiomas procedentes de Almazán (Soria), España. Estas cepas se habían utilizado previamente en otros estudios de producción de inóculo y síntesis micorrícica con diferentes especies de pino (datos no publicados). Los especimenes colectados están depositados en el Herbario Rubén Mayorga Peralta de la Universidad de San Carlos de Guatemala (USAC) y en el Herbario del Laboratorio de Micología–Micorrizas de la Universidad de Murcia, España (HUM).
Caracterización micelial
Se emplearon los medios de cultivo Moser–B (Moser, 1960), Melin y Norkrans modificado–MNM (Marx, 1969), Pachlewski (Pachlewski y Pachlewski, 1974) y Gamborg (Gamborg et al., 1968). Las cepas se sembraron en todos los medios de cultivo utilizados, preparándose tres repeticiones en cajas de Petri de 9 cm de Ø, por cada condición. Las cajas se inocularon con un fragmento de cultivo de 0,8 cm de Ø tomado con un sacabocados del margen del cultivo reactivado. Las placas se incubaron a 23°C, en oscuridad durante 5 semanas. Cada semana se midió el Ø del micelio, marcando la parte inferior de las placas y se calculó restando el Ø inicial del fragmento inoculado. Los datos para cada cepa fúngica se sometieron a un análisis estadístico de comparación de medias mediante la prueba de Duncan con un nivel de significancia de α <0.05. Los colores de los micelios se compararon con la tabla de colores para hongos del Royal Botanic Garden Edimburg (Hendersen et al., 1969). Los micelios se observaron con una lupa binocular marca Olympus SZH y las características morfológicas (textura, margen y tipo de crecimiento) se describieron usando la terminología de Hutchinson (1991).
Cultivos para la obtención de primordios
Las placas de B. edulis que presentaron mejor crecimiento micelial fueron seleccionadas para preparar inóculo de la cepa en medio MNM semilíquido (1.5 g agar/L), dejándose en incubación a 23°C y con agitación manual cada 4 días. Además y de acuerdo a resultados de experimentos previos (datos no publicados) de la formación de primordios de la especie in vitro se prepararon tubos de ensaye con medio de cultivo de papa dextrosa agar (PDA) a tres valores de pH (4.5, 5.5 y 7.0), para determinar si este medio y el grado de acidez favorecían la inducción de primordios en B. edulis. También se prepararon frascos de 500 ml con 400 ml de turba–vermiculita humedecida con medio MNM, Gamborg o extracto de malta líquido (pH 5.5). Tanto los tubos como los frascos se inocularon con las cepas de B. edulis previamente crecidas en cultivos sólidos y semilíquidos. Todas las pruebas se colocaron en cámara oscura a 23°C durante cinco meses.
Resultados y discusión
]]> Las características macroscópicas de los micelios obtenidas en los diferentes medios de cultivo utilizados se presentan en la Tabla 2.En general, las cepas ensayadas alcanzaron los mayores diámetros miceliales en los medios MNM y Moser B. Para el caso de las cepas Boletellus russelii y B. edulis SO 18, los diámetros miceliales fueron mayores en MNM y comparables con los otros tres medios de cultivo utilizados. El crecimiento de B. edulis Ix154.00 fue similar en medio MNM y Pachlewski. Por tanto, sugerimos que los medios MNM y Moser son los más apropiados en el proceso de producción de inóculo, para su posterior uso en la síntesis micorrícica.
El crecimiento de los micelios de Boletus fue lento, sin llegar a ocupar la totalidad de la caja de Petri, en ningún caso, a los 35 días de inicio del cultivo. El crecimiento promedio de las cepas guatemaltecas en medio MNM fue desde 0.46 a 0.57 mm/día. Las cepas guatemaltecas de B. edulis produjeron micelios más pequeños que la cepa española B. edulis SO 18 (que fue previamente seleccionada, junto con la cepa SO 19, entre más de 10 aislamientos de distintos basidioma jóvenes procedentes de Soria). Boletellus ruselli en cambio, produjo micelios mayores (de 24 a 34 mm) que las cepas guatemaltecas de B. edulis. Suillus tomentosus presentó mayor crecimiento promedio (1.43 mm/día) que el resto de las cepas en los medios MNM y Moser, con micelios promedio de 50 mm a los 35 días de cultivo. Esta cepa incrementó su crecimiento a partir de la tercera semana de incubación, logrando cubrir el diámetro total de las cajas de Petri a las 7–8 semanas de iniciado el cultivo (datos no presentados), lo cual no ocurrió con el resto de los hongos utilizados. Los diámetros miceliales alcanzandos en este estudio son mayores a los reportados previamente por Vázquez–García et al., (2002) para cepas de S. tomentosus procedentes de Mexico, cultivadas a diferentes condiciones de pH (25.9–34.2 mm de diámetro a pH 5 y 6, en cultivos de 30 d de incubación).
Las características de crecimiento de los cultivos obtenidos de Boletus grupo edulis de Guatemala fueron similares entre sí. Sin embargo, la cepa B. luteoloincrustatus presentó micelios de menor tamaño que B. edulis y B. pinophilus en los medios Gamborg y Pachlewski y con una coloración beige más oscura que éstos. El color, textura, forma y velocidad de crecimiento de estas cepas coinciden a mayoritariamente con lo reportado para las cepas de especies europeas (Torres y Honrubia, 1993). Las características de los cultivos de B. edulis, B. russelii y S. tomentosus coinciden también con lo citado por Hutchinson (1991) para cepas de Norteamérica, en los medios de PDA y MNM, aunque los diámetros fueron menores.
Las diferencias de crecimiento observadas entre cepas pueden tener su origen en la variedad genética de las mismas, tal como han señalado Dahlberg y Stenlid (1995), quienes consideraron que las variaciones pueden ocurrir entre poblaciones de hongos de una misma especie e incluso, en una misma localidad.
En todos los cultivos se observó un aparente cambio de color en el medio, lo que indica la posible presencia de metabolitos solubles producidos por los micelios, especialmente en los medios de cultivo de Moser–B, Pachlewski y en PDA. Esta característica de los micelios podría relacionarse con la inducción para la formación de carpóforos, y de modo particular con las dos especies de Suillus. La producción de metabolitos en cultivos de Boletales fue puesta de manifiesto anteriormente por Hutchinson (1991).
Con respecto a la textura de los micelios, las dos cepas de Suillus produjeron abundante micelio algodonoso–lanoso, de color desde beige a rosado, tal como cita Hutchinson (1991) para S. tomentosus.
En cuanto a la formación de primordios de B. edulis en los cultivos en tubo con PDA, las cepas presentaron micelio aéreo hirsuto y denso en los tres nivels de pH ensayados, muy distinto al observado en los otros medios y formando pequeños abultamientos en algunas áreas; sin embargo no se produjeron primordios bien diferenciados (Figura 1A). Los primordios se formaron solamente con la cepa SO 18 en los frascos con turba–vermiculita y medio MNM. Los primordios aparecieron agrupados en la superficie del substrato y midieron hasta 2 mm de largo, alcanzando a observarse las formas diferenciadas en píleo y estípite, aunque rudimentarias, como puede observarse en la Figura 1B.
En varios de los primeros aislamientos de B. edulis realizados en este estudio y en otros posteriores, se encontró la formación de pequeños acúmulos tomentosos alrededor del centro de el micelio, pero ninguno llegó a producir formas tan definidas como las precedentes.
En las pruebas en medio de PDA, el hongo produjo hifas aéreas hirsutas y gruesas en el centro, situación que no se produjo en ninguno de los otros medios. El pH del medio tampoco parece haber influido pues en todos los tubos los resultados fueron similares. En cuanto a los primordios en turba–vermiculita, éstos se formaron exclusivamente con la cepa SO 18, de reciente aislamiento y con pocos subcultivos. También se observaron acumulaciones miceliales pruinosas en algunas áreas de los frascos, las cuáles se originaron a partir de piezas de cultivos sólidos.
Pantidou y Watling (1973) y Giltrap (1981) sugirieron que la formación de primordios es un indicio de un posible cambio de forma micorrícica a saprofita de la cepa o de la especie durante su cultivo. Esto es discutible, pues el hecho de que hongos micorrícicos puedan desarrollarse en medios de cultivo es ya una indicación de que pueden crecer en forma saprobia. Mas bien, la capacidad de formación de primordios o basidiomas en cultivo puro depende de características nutricionales y ambientales tales como luz, temperatura y concentración de CO2, así como de la propia capacidad de las cepas de fructificar (Yamanaka et al., 2000). Por lo anterior, la selección de cepas fúngicas con una capacidad eficiente de formar primordios y la investigación de las características nutricionales y ambientales que favorecen la obtención de basidiomas, pueden constituir las bases de futuras investigaciones con estos hongos comestibles.
Literatura citada
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