Antagonismo in vitro de cepas de Aspergillus y Trichoderma hacia hongos filamentosos que afectan al cultivo del ajo
In vitro antagonism of Aspergillus and Trichoderma strains against garlic–pathogenic filamentous fungi
Vivian Francisca Quiroz–Sarmiento1, Ronald Ferrera–Cerrato1,*, Alejandro Alarcón1, María Encarnación Lara Hernández1
1 Área de Microbiología, Colegio de Postgraduados Campus Montecillo. Carretera México–Texcoco km 36.5. Montecillo, Edo. de México. CP 56230, Montecillo, Estado de México
* Autor para correspondencia: ronaldfc@colpos.mx
]]>Recibido 17 de enero 2008
Aceptado 20 de junio 2008
Resumen
El presente trabajo evaluó la capacidad antagónica de 22 cepas de hongos filamentosos hacia Penicillium sp. y Fusarium spp. que afectan al cultivo del ajo, mediante enfrentamientos in vitro. Tanto las cepas patógenas como las antagonistas fueron aisladas de la rizósfera y/o material vegetativo de plantas maduras de ajo recolectadas de Celaya, Guanajuato. De las 22 cepas probadas, ocho contribuyeron en la inhibición del crecimiento de los patógenos, seis de las cuales correspondieron a Aspergillus nidulans, A. ochraceus (2 cepas), A. wentii (2 cepas) y A. niger, y las dos cepas restantes correspondieron al género Trichoderma sp. Los principales mecanismos de acción identificados en la inhibición del crecimiento de las colonias de los hongos patógenos fueron el micoparasitismo, la antibiosis y la competencia. Los daños causados a las estructuras de los patógenos por los hongos antagónicos variaron según la cepa del antagonista. En general, los antagonistas causaron agrupamiento, deformación y lisis de conidios, así como deformación, lisis y enrollamiento de micelio de los patógenos.
Palabras claves: Penicillium, Fusarium, biocontrol, microcultivo, micoparasitismo, competencia, antibiosis.
Abstract
This research focused on studying the antagonistic capability of 22 strains of filamentous fungi to Penicillium sp. and Fusarium spp. garlic pathogens, via in vitro confrontation. Either pathogen or antagonist strains were isolated from the rhizosphere or vegetative organs of garlic mature plants collected from Celaya, Guanajuato. Eight out of 22 fungal strains inhibited the growth of the pathogens; six of them belonged to Aspergillus species: A. nidulans, A. ochraceus (2 strains), A. wentii (2 strains), and A. niger, and the remaining two strains belonged to the genus Trichoderma spp. Mycoparasitism, antibiosis, and competition were the main mechanisms by which the fungal strains inhibit the growth of Penicillium and Fusarium. There were variations among antagonists to attack the pathogens and their fungal structures. In general, antagonists caused grouping, deformation, and lysis on conidia, as well deformation, lysis, and winding on mycelia of the pathogens.
]]> Key words: Penicillium, Fusarium, biocontrol, microcultures, mycoparasitism, competition, antibiosis.
Introducción
Dentro de los múltiples factores que afectan la producción de cultivos hortícolas se encuentra la proliferación de hongos filamentosos causantes de enfermedades para las plantas (Sánchez, 1998). Como ejemplo, Sclerotium cepivorum Berk. es el principal agente patógeno que causa la pudrición blanca en ajo; sin embargo, otros hongos filamentosos que inciden y afectan a este cultivo son Fusarium oxysporum (Schl.) enmend. Snyder & Hansen, agente causal de la pudrición basal que ataca al ajo desde su estado de plántula, y Penicillium hirsutum Diercks el cual produce un micelio verde–azul en los bulbos y ocasiona la pérdida de vigor de las plantas en las primeras etapas de crecimiento y reduce significativamente la calidad de la semilla de ajo (Heredia y Delgadillo, 2000).
El control biológico, representa una estrategia innovadora para el manejo de enfermedades de plantas de importancia agrícola (Heredia y Delgadillo, 2000), que se basa en la capacidad de un organismo para inhibir el crecimiento o destruir a un fitopatógeno (Whipps y Lumsden, 2001). En el suelo existen diversos microorganismos con capacidad antagónica hacia microorganismos fitopatógenos, pero el más estudiado es Trichoderma, debido a su fácil y rápido crecimiento además de sus características de micoparasitar a otros hongos (Howell y Stipanovic, 1995). Sin embargo, existen otras especies fúngicas que potencialmente pueden inhibir o limitar el crecimiento de los patógenos (Paul, 1999a; 1999b), como es el caso de algunas especies de Aspergillus (Alfonso et al., 1992; Lourenço et al., 2006; Suárez–Estrella et al., 2007).
El presente trabajo evaluó el grado de antagonismo de diferentes cepas de hongos del género Aspergillus y Trichoderma sobre dos cepas de Fusarium spp. y una de Penicillum sp. en condiciones in vitro, aislados de la zona productora de ajo en Guanajuato, así como identificar el daño que causan los antagonistas en las estructuras de los patógenos.
Materiales y métodos
El experimento se llevó a cabo en condiciones de laboratorio. Se utilizaron 22 cepas de hongos filamentosos (cuatro del género Trichoderma y 18 del género Aspergillus) para probar su efecto antagónico hacia dos cepas de Fusarium spp. (SP–P4 y CH–A3), Penicillium sp. (CH–A3). Estas cepas de Fusarium y Penicillium fueron aisladas a partir de plantas de ajo con sintomatología de enfermedad en condiciones de campo (datos no presentados). Todas las cepas de Aspergillus y de Trichoderma fueron aisladas de rizósfera, rizoplano y material vegetativo (raíz y/o bulbo) de plantas de ajo establecidas en plantaciones con fines de exportación de la región de El Bajío, Guanajuato.
Pruebas de Antagonismo in vitro
]]> Cada uno de los hongos antagonistas fue colocado por duplicado en un extremo de la caja de Petri, con un disco de 5 mm de PDA con crecimiento fúngico activo. Después de un periodo de incubación a temperatura ambiente (22°C) y con base en la velocidad de crecimiento de los hongos, en el extremo opuesto de la caja de Petri, se colocó otro disco de agar de 5 mm con el hongo patógeno a confrontar. La inoculación de las cepas de los patógenos, previo a la confrontación con las cepas de Aspergillus o de Trichoderma, fue de dos días para Penicillium, y de tres días para Fusarium. El crecimiento de los organismos en cada uno de los enfrentamientos fúngicos, fue evaluado cada 24 h. Se consideraron cinco repeticiones para cada enfrentamiento y para el tratamiento testigo. La evaluación final fue considerada a los 10 días, cuando el patógeno cubrió totalmente la caja de Petri en el tratamiento testigo (sin hongo antagonista). Para medir el efecto inhibitorio, de los hongos antagónicos hacia los patógenos, se midió el crecimiento de estos últimos. El porcentaje de inhibición se estimó con base en la diferencia obtenida entre el crecimiento obtenido de patógeno confrontado con la cepa antagónica y el crecimiento de la cepa del respectivo patógeno sin antagonista.A partir de este análisis de inhibición, se seleccionaron únicamente ocho cepas para proceder a la evaluación de la interacción microscópica entre las hifas de los antagonistas con aquellas de los patógenos por separado, como se describe a continuación.
Técnica de Ridell
Para conocer los efectos directos que causaban las ocho cepas de hongos con mayor potencial antagónico, seis del género de Aspergillus (SN–7, SN–9, SN–10, SP–11, SP–21, SP–22, RP–12b y ST–2) y dos del género de Trichoderma (RP–12b y ST–2), hacia los hongos patógenos, se empleó la técnica de microcultivos de Ridell descrita por Paul (1999a). Esta técnica consiste en colocar dentro de una caja de Petri una varilla de vidrio en forma de "V" y sobre ella, un portaobjetos estéril sobre el cual se dispuso un disco de PDA de 10 mm de diámetro por 20 mm de espesor.
Para el establecimiento de los hongos involucrados (antagónicos y patógenos) se tomó en cuenta su velocidad de crecimiento. Las cepas de Aspergillus antagónicas con crecimiento lento se colocaron un día antes que las cepas de Fusarium, mientras que para el caso de Penicillium, éstas fueron colocadas un día después. Lo anterior debido a que el crecimiento de las antagonistas fue más lento que Fusarium, pero más rápido que Penicillium.
Por su parte, las dos cepas antagónicas de Trichoderma spp. seleccionadas presentaron un crecimiento más rápido que los patógenos por lo que se colocaron dos y cinco días después que las cepas de Fusarium y la cepa de Penicillium, respectivamente. La disposición de cada hongo se realizó en dos puntos cardinales (norte patógeno y sur antagonista). Después de colocar el micelio del hongo con menor velocidad de crecimiento en un extremo del disco de PDA con ayuda de una asa bacteriológica, se colocó un cubreobjeto estéril. Con la finalidad de mantener la humedad en la caja de Petri se adicionaron 10 mL de glicerol al 10%. Cuando se observó crecimiento del hongo con menor velocidad de crecimiento, se procedió a inocular el micelio del hongo de mayor velocidad de crecimiento en el extremo opuesto.
Cuando el disco de agar fue cubierto con el crecimiento de ambos organismos (siete días aproximadamente), el glicerol fue sustituido por formaldehído al 10% durante dos horas para fijar las estructuras fúngicas. Posteriormente, el portaobjetos fue retirado de la caja de Petri, para preparar los frotis. El cubreobjetos fue colocado en otro portaobjetos limpio y provisto de una gota de azul de algodón en lactofenol. El siguiente paso consistió en retirar el disco de agar del portaobjetos original y después de colocar una gota del colorante y un nuevo cubreobjetos. Una vez eliminado el exceso de colorante, las preparaciones fueron selladas y evaluadas microscópicamente. Se utilizó un microscopio modelo III Carl Zeiss con cámara digital integrada.
La evaluación microscópica consistió en identificar agrupamientos y deformaciones de conidios, así como la deformación, el enrollamiento, el estrangulamiento o la fragmentación del micelio de los patógenos, causados por las cepas antagónicas.
Resultados
]]> De las 22 cepas probadas para su antagonismo hacia los patógenos, solo ocho presentaron algún mecanismo de antagonismo hacia la cepa de Penicillium y hacia las dos cepas de Fusarium (Tabla 1). Seis de estas ocho cepas correspondieron a las especies de Aspergillus nidulans (SN–7), A. ocraceus (SN–9 y SN–10), A. wentü (SH–W y SP–22) y A. niger (SP–21), mientras que las dos restantes pertenecieron a Trichoderma spp. (ST–2 y RP–12b), las cuales están en proceso de identificación.La inhibición del crecimiento de los tres patógenos probados fue dependiente de su combinación con la cepa antagonista (Figura 1). En el caso de Aspergillus, las cepas SN9, SN–10 y SP–22, inhibieron a los tres patógenos probados en un rango de 40 al 83%, mientras que la cepa SP–11 inhibió en un 24% el crecimiento de las dos cepas de Fusarium y en un 56% a la cepa de Penicillium (Figura 1). La cepa de Aspergillus SN–7 únicamente produjo inhibición del 3 8% a la cepa de Fusarium sp. 1 y a la cepa de Penicillium; en contraste, la cepa SP–21 sólo causó inhibición del 50% a la cepa de Penicillium (Figura 1). El mayor efecto inhibitorio del crecimiento de los tres patógenos fue obtenido cuando se confrontaron las dos cepas de Trichoderma, cuya inhibición osciló del 70 al 100%. La cepa de Trichoderma RP–12b causó el 100% de inhibición del crecimiento de los tres patógenos (Figura 1).
Las especies de Aspergillus mostraron mecanismos de competencia y antibiosis, hacia los patógenos, en tanto que las cepas de Trichoderma ST–2 y RP–12b mostraron la tendencia hacia el micoparasitismo (Tabla 1), el cual es una de las principales características de este género fúngico para inhibir o restringir el crecimiento de los patógenos. En el caso de las cepas de Aspergillus, los mecanismos que se presentaron fueron la competencia por espacio y la producción de sustancias antibióticas denotadas por el cambio en la coloración del medio de cultivo (datos no presentados).
Las interacciones entre antagonista y patógeno observadas microscópicamente en las estructuras de los hongos patógenos, dependieron según la cepa antagónica (Tabla 2). Los daños más drásticos se presentaron principalmente en conidios (Figura 2) y micelio (Figura 3) de las dos cepas de Fusarium, en los que se presentaron procesos de deformación, enrollamiento, estrangulamiento, ruptura, fragmentación y lisis. Además, se observó la deformación de las fiálides de Penicillium por efecto de las cepas de Trichoderma (Figura 4).
Las cepas antagónicas del género de Trichoderma, presentaron una tendencia por agrupar a los conidios de Fusarium, causándoles deformación, septos muy marcados y posteriormente la lisis (Figura 2). La cepa de Aspergillus SN–9 causó la lisis y deformación del micelio patogénico, presentando en ciertas partes enrollamiento y engrosamiento de micelio e incluso estrangulamiento del mismo (Figura 3).
Discusión
La capacidad antagónica de algunas cepas de hongos hacia hongos fitopatógenos se puede definir con base en la destrucción total o parcial de las poblaciones de patógenos (Cook, 2000). Esta capacidad es el resultado de la agresividad del antagonista y de la susceptibilidad del patógeno (Paul, 1999a; Sempere y Santamarina, 2008). Lo anterior se hace evidente por la variación observada con respecto a la selectividad de algunas cepas de Aspergillus para inhibir el crecimiento de los hongos patógenos, en comparación con las cepas de Trichoderma cuyo rango de hospedantes es al parecer, menos específico (Figura 1).
Las contribuciones que se han hecho en el último siglo sobre control biológico en plantas han sido de gran importancia ya que han abierto el camino a varias investigaciones como el uso de cepas microbianas para controlar los daños causados por fitopatógenos (Cook, 2000; Whipps, 2001).
Como mecanismos implicados en el antagonismo microbiano están la antibiosis, la competencia, la resistencia sistémica, el parasitismo o el hiperparasitismo y la secreción de enzimas, todos ellos influenciados por factores bióticos y abióticos (Howell y Stipanovic, 1995; Benhamou y Brodeur, 2000; Benítez et al., 2004). De manera particular, los hongos pueden poseer mecanismos relacionados con la competencia, antibiosis y de manera particular el micoparasitismo y el hiperparasitismo (Poinar y Buckley, 2007). Lo cual fue denotado con la diversidad de interacciones hifales entre los antagonistas y los patógenos (Tabla 2).
]]> La capacidad antagónica obtenida por las cepas de Trichoderma, constata los múltiples reportes en la literatura relacionados con su efectividad para inhibir y micoparasitar diferentes hongos filamentosos patógenos de plantas, a través de su actividad fisiológica y bioquímica (Baker, 1987; Chet e Ibar, 1994; Howell y Stipanovic, 1995; Handelsman y Stabb 1996; Harman et al., 2004; Vinale et al., 2006). En nuestro estudio, las dos cepas de Trichoderma ensayadas presentaron mayor efecto antagónico hacia los tres patógenos probados en comparación con las cepas de Aspergillus (Figura 1). Las cepas de Trichoderma, tuvieron la habilidad de contribuir en la deformación los conidios de Fusarium (Figura 2), así como provocar la lisis y destrucción de conidióforos y esporas de Penicillium (Figura 4). Estos efectos sobre las estructuras de los patógenos, pueden estar relacionados con la producción de enzimas tales como quitinasa, β–glucanasa, celulasa y proteasa por parte de las cepas de Trichoderma, y que son un componente importante en el proceso del micoparasitismo (De la Cruz et al., 1992; Goldman et al., 1994; Harman, 2006).Estos cambios morfológicos en las estructuras de los hongos patógenos causados por la acción del antagonista han sido observados en otros estudios que han considerado diferentes especies de hongos tanto antagonistas como patógenos. Por ejemplo, Benhamou et al. (1999) reportaron algunos eventos del micoparasitismo entre Phythium oligrandrum y varios oomycetos fitopatógenos (Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Phytophthora megasperma, Pythium ultimum). Los daños ocasionados en las diferentes estructuras fúngicas de los patógenos se relacionaron con la presencia de enrrollamientos de hifas, aumento de tamaño de las células producto de la desorganización del citoplasma, retracción y ruptura de la membrana plasmática, alteración y distorsión de la pared celular en los sitios de penetración de hifas del antagonista, desencadenando con todo ello, la colonización masiva en el hospedante y su posterior lisis celular.
Por otra parte, existe especial interés por aislar especies de hongos filamentosos alternativos a Trichoderma, por lo que se ha reportado la capacidad antagónica de especies saprotrofas no patogénicas de los géneros Fusarium, Rhizoctonia, Phialophora y Pythium, hacia patógenos de hábito radical (Whipps y Lumsden, 2001; Paul, 1999a, 1999b). En el caso particular de las especies del género de Aspergillus, los trabajos relacionados con su capacidad antagónica hacia otras especies fúngicas son escasos (Alfonso et al., 1992; Lourenço et al., 2006; Suárez–Estrella et al., 2007) y se les ha dado mayor enfoque de investigación a los aspectos dañinos que tiene este género fúngico al producir aflatoxinas que causan problemas de intoxicación a los humanos al ingerir alimentos con presencia de hongos de este género.
Pocas investigaciones han considerado a las especies del género Aspergillus como antagonista hacia Penicillium. No obstante, se tienen algunos reportes que describen el efecto antagónico de algunas especies de Aspergillus hacia patógenos como Phytophthora infestans, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 2, y Fusarium oxysporum f. sp. melonis, los cuales son causantes de enfermedades en cultivos como tomate y melón (Alfonso et al., 1992; Lourenço et al., 2006; Suárez–Estrella et al., 2007).
El presente trabajo es uno de los primeros reportes en México relacionados con la capacidad de especies de Aspergillus para inhibir el crecimiento de hongos patógenos que afectan al cultivo y calidad de la semilla del ajo. Recientemente se han hecho investigaciones utilizando cepas de Aspergillus no–productoras de aflatoxina (NPA) en maíz y cacahuate en África (Bandyopadhyay y Cardwell, 2003), en las que se mencionan que la cepa NPA mostró mayor competencia que Aspergillus flavus (productora de la toxina), reduciendo así los niveles de aflatoxinas en el maíz. Por otra parte, A. giganteus produce una proteína antifúngica que ha sido probada exitosamente para inhibir el crecimiento del micelio y la germinación de conidios de Botrytis cinerea (Moreno et al., 2003). Lo anterior, resalta la importancia del género Aspergillus en procesos biotecnológicos aplicados a la agricultura.
Cabe mencionar que, si bien el uso de Trichoderma como agente de biocontrol se encuentra ampliamente, el uso de Aspergillus con la misma finalidad y sobre todo en ajo, es prácticamente nulo. Lo anterior resalta la importancia de probar y utilizar hongos antagonistas autóctonos y alternos a Trichoderma, para controlar hongos causantes de enfermedades específicas de los cultivos, en sitios específicos. Lo anterior requiere de la integración del control biológico, con tratamientos químicos y culturales para tener mayor efectividad en el manejo de las enfermedades causadas por hongos fitopatógenos.
Los resultados de este trabajo indican que algunas cepas de Aspergillus tienen efectos antagónicos selectivos a hongos fitopatógenos; sin embargo, esto no implica su recomendación para su uso extensivo en campo. Para lo anterior, se sugiere realizar pruebas de patogenicidad de las cepas de Aspergillus, y evaluar su parte toxicológica, con el fin de determinar su posible producción de aflatoxinas y los parámetros relacionados con su concentración letal, parte de la planta en donde se almacenan, tiempo de vida media, etc.
Agradecimientos
Trabajo parcialmente financiado por el proyecto SEP–CONACyT 58594.
]]>Literatura citada
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