Digestibilidad in vitro de ingredientes proteínicos en la mojarra castarrica Cichlasoma urophthalmus

In vitro PH-STAT digestibility of protein ingredients in the mayan cichlid Cichlasoma urophthalmus

Carlos Alberto Cuenca Soria¹, Carlos Alfonso Álvarez González^2*, José Luis Ortiz-Galindo¹, Rocío Guerrero-Zárate², Martha Alicia Perera-García², Raúl Enrique Hernández-Gómez², Héctor Nolasco-Soria³

¹ Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas, Av. Instituto Politécnico Nacional s/n, Col. Playa Palo de Santa Rita, Apdo. Postal 592, La Paz, BCS, 23096, México.

³ Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, SC. Mar Bermejo No 195, Col. Playa Palo de Santa Rita, Apdo. Postal 128, La Paz, BCS, 23090, México.

Artículo recibido: 17 de agosto de 2013,
Aceptado: 28 de noviembre de 2013

RESUMEN

El cultivo de Cichlasoma urophthalmus ha observado un lento desarrollo, ya que actualmente no dispone de un alimento balanceado que contenga los ingredientes apropiados para su crecimiento. En este estudio se determinó el grado de hidrólisis (GH,%) de 29 ingredientes proteínicos animales y vegetales, mediante el sistema pH STAT, además de calcular la liberación de aminoácidos totales (ALT, µg ml^-1), utilizando extractos multienzimáticos de estómago e intestino de juveniles de C. urophthalmus. De todos los ingredientes probados, los valores GH ácido / alcalino óptimos fueron los de la carne y vísceras de pollo (9.6 ± 1.8 / 22.7 ± 4.3), carne de cerdo (22.0 ± 0.52 / 31.6 ± 2.2) y pasta de coco (10.4 ± 1.5 / 21.6 ± 5.2), siendo significativamente mayores (p < 0.05) con respecto a los GH ácido/alcalino de ingredientes de referencia, hemoglobina/caseína (6.9 ± 1.8 / 2.2 ± 0.5). Paralelamente, los valores ALT ácido/alcalino de estos mismos ingredientes fueron estadísticamente iguales (p > 0.05) (793.9 ± 21.1/1587.8 ± 13.0, 310.5 ± 33.0/1013.2 ± 20.3, 591.9 ± 4.1 / 574.6 ± 11.9 respectivamente) a los de los ingredientes ácido / alcalino de referencia (hemoglobina 1293.1 ± 24.1 y caseína 943.3 ± 14.7). Se concluye que los ingredientes de prueba mencionados pueden ser fuentes potenciales de proteína, como base de una fórmula estándar en el cultivo de C. urophthalmus.

Palabras clave: Acuicultura, cíclido nativo, harinas, nutrición.

The commercial culture of Cichlasoma urophthalmus has not been developed, because there is not any commercial balanced food available with the ingredients required for the species. This study determined the degree of hydrolysis (GH,%) of 29 animal and plant protein ingredients using the pH STAT system, and calculated the total free amino acid content (ALT, µg ml^-1) using multienzymatic extracts obtained from the stomach and intestine of C. urophthalmus juveniles. Of all the tested ingredients, the optimum acid/alkaline GH values were those of the poultry-by products and meat (9.6 ± 1.8 / 22.7 ± 4.3), pork meal (22.0 ± 0.52/31.6 ± 2.2) and coconut paste (10.4 ± 1.5/21.6 ± 5.2), and they were significantly greater (p < 0.05) than the acid/alkaline GH values of the reference ingredients hemoglobin/casein (6.9 ± 1.8 / 2.2 ± 0.5). Concurrently, the acid/alkaline ALT values for these same ingredients were statistically equal (p > 0.05) (793.9 ± 21.1/1587.8 ±13.0, 310.5 ±33.0/1013.2 ± 20.3, 591.9 ± 4.1/574.6 ± 11.9 respectively) to those of the acid/alkaline reference ingredients (hemoglobin 1293.1 ± 24.1 and ± casein 943.3 ± 14.7). It is concluded that the test ingredients may constitute strong sources of proteins, as the base of a standard formula for C. urophthalmus culture.

Key words: Aquaculture, native cichlid, meal, nutrition.

INTRODUCCIÓN

La alta mortandad durante el cultivo de peces se debe en parte al desconocimiento de la capacidad digestiva de los organismos para hidrolizar los diversos nutrientes presentes en la dieta. En este contexto, las proteínas son el principal determinante del peso vivo (biomasa) ganado por los peces (Dumas et al. 2007), cuyo contenido de aminoácidos esenciales juega un papel importante como combustible metabólico en los peces (Kaushik & Seiliez 2010). Recientemente, se han desarrollado diferentes métodos para determinar la digestibilidad de la proteína en diversos ingredientes, utilizando varias técnicas, como es la digestibilidad aparente (in vivo), con marcadores como la zeolita y el óxido crómico; las cuales resultan complicadas y costosas debido al lento crecimiento de los peces, la dificultad de recolectar las heces en el medio acuático y la influencia de los niveles de inclusión de los nutrientes y el aprovechamiento de algunos combustibles (March et al. 1985; Shiau & Liang 1995). Actualmente, se realizan estudios de digestibilidad in vitro, utilizando el sistema pH STAT, donde se evalúa el grado de ruptura (porcentaje de enlaces peptídicos hidrolizados) de los enlaces peptídicos por acción de las diferentes proteasas (Alarcón et al. 2002). A este respecto, Ezquerra et al. (1997) y Nolasco et al. (2006) estudiaron la digestibilidad in vitro de proteínas en camarón blanco del Pacífico Litopenaeus vannamei. Asimismo, Álvarez-González (2003) probó harinas de langostilla, sardina, sangre de res e hidrolizado de pescado como fuentes proteínicas en juveniles de cabrilla arenera Paralabrax maculatofasciatus, para medir su digestibilidad in vitro, con fines de diseño de dietas inertes, siendo la harina de sangre de res la que obtuvo el mejor grado de hidrólisis (GH). Fenerci & Sener (2005) exploraron la digestibilidad in vitro e in vivo de cuatro alimentos comerciales, en función de sus procesos de fabricación, para trucha arco iris Oncorhynchus mykiss, resultando con mayor GH los alimentos extruidos, que los presurizados. Frías-Quintana et al. (2010) exploraron la digestibilidad in vitro de ingredientes proteínicos animales y vegetales con extractos multienzimáticos de Atractosteus tropicus, con fines de diseño de dietas de larvicultivo de la especie mencionada. A pesar de los estudios anteriores, existe un marcado vacío de información, respecto a la digestibilidad de ingredientes considerando la fisiología digestiva de la especie con el fin de considerárseles en la formulación de una dieta que sea acorde con la capacidad digestiva. En este aspecto, se han realizado diversos estudios con miras a su cultivo como los relacionados al requerimiento de proteína de C. urophthalmus los cuales fueron estudiados por Martínez-Palacios et al. (2006); así mismo, se han determinado los cambios de la actividad de enzimas digestivas y el desarrollo del sistema digestivo durante la ontogenia inicial, mediante la caracterización de proteasas digestivas en juveniles (López-Ramírez et al. 2011; Cuenca et al. 2013a, b). El objeto de la presente investigación fue evaluar la digestibilidad in vitro de un grupo de ingredientes de origen animal y vegetal, con fines de diseño de alimentos inertes para la etapa juvenil de C. urophthalmus. Se pretende que los alimentos formulados con base a la capacidad digestiva de esta especie nativa, contribuya a sentar las bases para su cultivo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Reproducción, larvicultivo y obtención de juveniles

Para este estudio los juveniles de C. urophthalmus (5.73 ± 1.43 g peso húmedo, n = 53) fueron obtenidos a partir del larvicultivo de un total de 4 500 larvas que se colectaron por medio de sifonéo de los tanques circulares de reproducción (2 000 L) dentro de las instalaciones del Laboratorio de Acuicultura Tropical de la División Académica de Ciencias Biológicas (DACBIOL-UJAT) en la Universidad Juárez Autónoma de Tabasco, Tabasco, México. Las larvas fueron alimentadas por un periodo de 15 días utilizando nauplio de Artemia y otros 15 días con alimento balanceado para trucha (Silver Cup, 45% de proteína y 16% de lípidos), suplementado con la hormona 17 α metiltestosterona (60 mg L de agua marina"¹ o kg de alimento^-1 respectivamente) para obtener una población monosexo. Terminado este periodo, los juveniles fueron mantenidos en un sistema de recirculación de agua en tanques de 1.7 m³ durante un periodo de dos semanas adicionales antes de su procesamiento. Los parámetros de la calidad del agua fueron medidos diariamente, se mantuvieron en 28.3 ± 0.8°C de temperatura, 5.89 ± 0.48 mg L^_1 de oxígeno disuelto (TSI 55, California, USA) y 7.35 ± o.11 de pH (Denver Instrument UB-10, Denver, Colorado, USA) durante el confinamiento de juveniles. 

La totalidad de los juveniles de C. urophthalmus fueron disectados en frío, a fin de aislar estómagos e intestinos de la masa visceral, para lo cual se obtuvo el peso húmedo por individuo y de cada órgano con una balanza analítica (Denver Instrument APX-200, resolución 0.1 mg). Los tejidos fueron homogenizados en un macerador eléctrico (Ultra Turrax® Ika T18 Basic), a razón de 1:5 (tejido/agua destilada, p/v). Las mezclas fueron centrifugadas a 14 000 rpm y a 4 °C por 30 min en una centrífuga (Eppendorf 5810-R, con rotor F45-3011). Se recuperaron los sobrenadantes y se almacenaron a -20 °C, hasta su análisis posterior. 

Materias primas

Las materias primas y sus respectivos contenidos de proteína y humedad se muestran en la Tabla 1. Las harinas de grano de maíz, maíz amarillo, trigo, sorgo, carne de pollo y pasta de soya fueron obtenidas de la empresa GALMEX S.A. en Vi lia hermosa, Tabasco, México. Las harinas de carne de res, sangre porcina, carne de cerdo, soya, gluten de maíz, pulido de arroz, plasma porcino, salvado de trigo, sangre de res y pasta de canola fueron obtenidas de la planta de alimentos Consorcio Súper en Guadalajara, Jalisco, México. La harina de pescado y el hidrolizado de pescado fueron obtenidos de Alimentos Pedregal S.A. de C.V. y CCP Noruega, respectivamente; la harina de carne de cerdo y de pollo se obtuvieron del National Renderers Association; mientras que las harinas de pescado marca Aqua; jaiba, camarón, calamar, carne y sangre de res se obtuvieron de Proteínas Marinas y Agropecuarias S.A. de C.V., Guadalajara, Jalisco, México; el gluten de trigo de Glútenes de México S.A. de C.V. Estado de México, México; la pasta de coco fue obtenida de la Unión de Copreros de Tabasco S.A. de C.V. en Villahermosa, Tabasco, México; y la harina de canavalia fue obtenida de un productor privado en Teapa, Tabasco, México. La sangre de res se obtuvo del rastro de Texcoco, Estado de México, México. 

Determinación de la actividad específica de enzimas estomacales e intestinales

Con el fin de conocer la cantidad de unidades de enzimas en extracto de estómago, se hizo uso del método de Anson (1938), con las modificaciones que siguen. Se formó la mezcla de reacción con 1 mi de hemoglobina (al 1% en tampón glicina-HCI 100 mM, pH 2) y 20 µl de extracto multienzimático de estómago de C. urophthalmus. La mezcla fue incubada a 25 °C por 30 min. La reacción se detuvo con 500 µl de ácido tricloroacético (TCA) al 20% y se dejó en reposo a 4 °C por 15 min. Las muestras por triplicado fueron centrifugadas a 12 000 rpm (Eppendorf 5810-R, con rotor F45-3011). Los sobrenadantes fueron recuperados y diluidos con agua destilada (1:10) para la lectura de la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro (Jenway 6405 UV/Visible), utilizando celdas de cuarzo de 1 cm de paso de luz, definiéndose una unidad de actividad como la cantidad de enzima que cataliza la liberación de 1 µg de equivalentes de tirosina por minuto.

Para determinar la actividad de extracto multienzimático de intestino, se utilizó el método de Kunitz (1947), modificado por Walter (1984). Se utilizó 1 mi de caseína de Hammarstein (ICN Biomedicals No. 101289, Aurora OH USA) al 1% en solución tampón Tris-HCI (100 mM, pH 7.5) como sustrato de 5 µl de extracto multienzimático de intestino de C. urophthalmus. La mezcla se incubó de 25 °C por 30 min. La reacción fue determinada con 500 µl de TCA al 20%. Para el centrifugado (Eppendorf 5810-R, con rotor F45-3011, 25 °C por 10 min) y lectura de absorbancias de muestras a 280 nm, para de igual manera obtener la cantidad de equivalentes de tirosina liberada por reacción hidrolítica. Para los métodos de actividad proteolítica ácida y alcalina, se utilizó un ensayo testigo, donde se añadió el extracto multienzimático, hasta después de parar la reacción con TCA al 20%. Ambos valores de actividad específica se tomaron como base para el cálculo del volumen de extractos multienzimáticos, tanto para la hidrólisis ácida como alcalina, de ingredientes proteínicos.

Determinación de proteína soluble

Para el cálculo de concentración de proteína en extractos, se utilizó el método de Bradford (1976), con una curva estándar de albúmina bovina. Todas las reacciones se realizaron por triplicado. 

Digestibilidad in vitro ácida y alcalina en el pH Stat

Al inicio y término de 900 y 2 700 s de digestión ácida y alcalina de ingredientes proteínicos se tomaron muestras de mezcla hidrolizada respectivamente. La unidad de tiempo previa a la adición de extracto multienzimático, fue definida como el tiempo cero. Las muestras fueron conservadas a -20 °C, para la determinación posterior de aminoácidos libres totales. A partir del gasto de HCl (Fase ácida) y de NaOH (Fase alcalina) se determinó el grado de hidrólisis (GH), el cual se expresa como el porcentaje del número de enlaces peptídicos hidrolizados (h) con respecto al total de la proteína (htot). Donde el valor de (h) = [consumo de base en mi (Vb)] × [normalidad de la base (Nb)] × [1 × (constante de disociación de los grupos α-NH2 y α-COOH respectivamente)^-1] × [1 × (masa de proteína en la mezcla de reacción)^-1]. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. 

Determinación de aminoácidos libres totales (ALT) en condiciones ácidas y alcalinas

Las muestras parcial y totalmente hidrolizadas fueron puestas a reaccionar con reactivo o-phtaldialdehido (OPA), de acuerdo con Church et al. (1983), que consiste en la unión de los grupos amino de los aminoácidos con el OPA. Para realizar lo anterior, 20 µl de mezcla hidrolizada fueron fijados con TCA al 12% para los ensayos con reacción química con OPA (80 mg de OPA en 1 ml de metanol, 0.2 mi de β-mercaptoetanol, 50 ml de tetraborato de sodio al 0.1 M y 5 ml de SDS al 20%, y disueltos en 100 ml de solución con agua destilada). Se obtuvo lectura de la absorbancia a 340 nm. La ALT de la mezcla de reacción en µg ml^-1 se evaluó según una curva patrón con l-leucina (0.5 mg ml^-1) con concentraciones crecientes de 0 a 20 µg ml^-1. Los ensayos fueron llevados a cabo por triplicado. 

Análisis estadístico

Los datos que cumplieron los supuestos de normalidad y homocedasticidad (GH y ALT alcalinos), fueron analizados con pruebas ANOVA paramétricas de una vía y de Duncan, para establecer diferencias significativas entre grupos de prueba y de referencia. Por otro lado, con la finalidad de aproximar su distribución a la normalidad y reducir la heterogeneidad de varianzas entre grupos, los valores GH ácidos fueron sometidos a la transformación X' = [raíz cuadrada (X + 1) + 0.375] / [raíz cuadrada (X) + 15], donde X' es el valor GH-ésimo transformado y X es el valor GH-ésimo en crudo. Para los valores ALT ácidos que no cumplieron los supuestos básicos (aún con transformaciones), las diferencias significativas se establecieron con una prueba de comparaciones múltiples no paramétrica de Kruskal-Walis y las diferencias entre los tratamientos fueron detectadas con la prueba a posteriori de Nemenyi (Zar 2010). Para el cómputo de todas las pruebas estadísticas se empleó el programa StatisticaTM v8, usando un valor de significancia de 0.05.

RESULTADOS

Actividad específica de extractos multienzimáticos de estómago e intestino

En la Tabla 2 se muestran los resultados de actividad específica de proteasas de extractos multienzimáticos de estómago e intestino de juveniles del cíclido maya C. urophthalmus. Las proteasas ácidas mostraron un valor de actividad específica de 2.7 ± 0.5 U mg proteína^-1 y las proteasas alcalinas alcanzaron un valor de 10.6 ± 0.5 U mg proteína^-1; predominando las proteasas intestinales, con relación a las proteasas estomacales. Ambos valores de actividad específica se tomaron como base para el cálculo del volumen de extractos multienzimáticos, tanto en la hidrólisis de ingredientes proteínicos ácida, como alcalina.

Digestibilidad in vitro ácida de ingredientes proteínicos

Los grados de hidrólisis ácida de los 29 ingredientes proteínicos de prueba y de hemoglobina, ingrediente de referencia, se pueden apreciar en la Tabla 3. La hemoglobina mostró un GH de 2.2 ± 0.5. El mayor GH encontrado fue el de la harina de camarón, con un valor de 30.9 ± 9.7. Es posible visualizar que la mayoría de ingredientes proteínicos de prueba observan un GH mayor al de la hemoglobina, salvo las harinas de plasma porcino y gluten de maíz cuyos GH son 2.1 ± 0.5 y 0.6 ± 0.3, de manera respectiva, siendo éste último el menor GH encontrado de todos los ingredientes de prueba. Se encontraron diferencias significativas entre casi todos los ingredientes de prueba, con relación al de referencia (p < 0.05), excepto con pulido de arroz, harina de soya, harina de canavalia, harina de sorgo, gluten de trigo, harina de plasma porcino y gluten de maíz (p > 0.05). Todos GH de los ingredientes de prueba que resultaron ser significativos, se encontraron por arriba del GH del ingrediente de prueba.

Digestibilidad in vitro alcalina de ingredientes proteínicos

En la Tabla 4 se indican los valores GH para los 29 ingredientes proteínicos y el de referencia (caseína Hammersten). La caseína observó un GH de 6.9 ± 1.8. El GH de la harina de carne de cerdo resultó ser el más alto, con 31.6 ± 2.2; mientras que el GH de la harina de jaiba fue la más baja, con 2.2 ± 0.7. Por otro lado, se hallaron diferencias significativas entre la caseína y los ingredientes de prueba: harinas de carne de cerdo, de sangre de res (Texcoco), de carne y visceras de pollo, de pollo Nacional, de pasta de coco, de pescado (Pedregal), de pescado (Acua), de sangre de res, de sangre de res (Prieto), de carne de res, de pescado, de soya y de canola (p < 0.5); cuyos valores GH se situaron por arriba del GH ingrediente de prueba.

Determinación de la ALT en condiciones ácidas

La Tabla 5 muestra los valores ALT ácidas de los 29 ingredientes de prueba y su referente, la hemoglobina. De ésta última, se obtuvo un valor ALT de 1293.1 ± 24. 1 µg ml^-1, valor que se situó por encima de todos los ingredientes de prueba. El valor ALT que le siguió fue el correspondiente a harina de sangre de cerdo, con 1018 ± 53.5 µg ml^-1. El valor ALT menor obtenido fue para la harina de sangre de res (Prieto), con 204.4 ± 2.7 µg ml^-1. Los valores ALT que fueron significativos, con relación al ingrediente de prueba, fueron el gluten de trigo y la harina de sangre de res (Prieto) (p > 0.05).

En la Tabla 6 es posible observar los valores ALT alcalinas de los 29 ingredientes de prueba y la caseína Hammarsten, empleada como referente, la cual mostró un valor ALT de 943.3 ±14.7 µg ml^-1. El valor ALT mayor fue el de la harina de carne y vísceras de pollo, con 1587.8 ± 13.0 µg ml^-1, mientras que el ALT menor correspondió al gluten de trigo, con 449.6 ±8.3 µg ml^-1. Las diferencias significativas fueron evidentes entre el ingrediente de referencia con respecto a los de prueba: harina de carne y visceras de pollo, harina de trigo, harina de camarón, harina de jaiba, harina de pescado (Pedregal), pulido de arroz, hidrolizado de pescado, harina de sangre porcina, harina de carne de cerdo, harina de pollo, harina de canola y harina de sorgo (p > 0.05). Tales ingredientes observaron valores ALT por encima del de referencia.

DISCUSIÓN

Los métodos de digestibilidad in vitro para evaluar GH en peces marinos y más recientemente en peces dulceacuícolas, permiten complementar técnicas convencionales de digestibilidad in vivo, por lo que cobran importancia capital cada vez mayor en el estudio de la capacidad digestiva de los peces cultivados. Los métodos in vitro para evaluar digestibilidad de proteínas son necesarios, debido a que suelen ser más rápidos y baratos que los métodos in vivo, y permiten una evaluación más precisa del porcentaje de enlaces peptídicos totales hidrolizados de fuentes de proteína, utilizando cantidades mínimas de materiales crudos (Grabner 1985). En condiciones ácidas los ingredientes proteínicos de prueba de origen animal, como la harina de camarón, de jaiba, de carne de cerdo, de carne de res, de sangre de res, de carne y visceras de pollo y de pescado (Acua), observaron valores GH muy por arriba del ingrediente de referencia (hemoglobina), en presencia de extracto multienzimático de estómago de C. urophthalmus. No obstante que la especie objeto de estudio es un pez omnívoro, en otros trabajos se ha observado que estos ingredientes resultaron tener valores GH significativamente mayores que la hemoglobina en presencia de extractos estomacales de pejelagarto A. tropicus (Frías-Quintana et al. 2010), el cual es pez de agua dulce del sureste de México. En este aspecto, la fisiología digestiva de C. urophthalmus en el estudio de caracterización de proteasas indica que la actividad de proteasas ácidas está presente, lo que demuestra que es un pez con alta capacidad de hidrolizar ingredientes en el estómago (Cuenca et al. 2013a). Sobresale el hecho de que entre estos ingredientes de prueba, figuren subproductos de la industria avícola y ganadera del Sureste de México (sangre de res y visceras de pollo), que frecuentemente son eliminados en cuerpos de agua de la región, lo que los hace meritorios de más estudios. Son notorios también los valores GH de ingredientes proteínicos de origen vegetal, como la harina de maíz amarillo y la pasta de coco, obtenidos en condiciones ácidas. Está documentado el empleo de harina de maíz en el diseño de dietas artificiales de otras especies omnívoras, como el pacú Piaractus mesopotamicus, el pejerrey Odontesthes bonariensis y el pez rohu Labeo rohita; aunque su inclusión a altos niveles en la dieta, puede llevar a una sobreacumulación de glicógeno en hígado (Pérez et al. 2003; Debnath et al. 2007), por lo que es necesario elaborar más estudios acerca de la harina de maíz, y más tratándose de un insumo abundante y de menor costo, con respecto de las fuentes de proteína animal.

En lo que concierne a los GH de ingredientes proteínicos de prueba en condiciones alcalinas, sobresalieron las harinas de carne de cerdo, de sangre de res (Texcoco), de carne y visceras de pollo, de sangre de res (Prieto), de pollo (Nacional), de pescado (Purina), de pescado (Acua), de carne de res, y el hidrolizado de pescado, para el caso de los ingredientes de origen animal que fueron significativamente mayores al ingrediente de referencia (caseína). Sin embargo, Frías-Quintana et al. (2010) obtuvieron valores GH más ínfimos en estos ingredientes, salvo para la harina de carne y visceras de pollo, en presencia de extractos de estómago e intestino de A. tropicus. Es posible que esto pueda ser explicado por las divergencias de hábitos alimenticios en una y otra especie, y por consiguiente su maquinaria enzimática durante la hidrólisis alcalina desde larva e incrementando su actividad para la etapa juvenil, lo cual fue corroborado hisológica y bioquímicamente (López-Ramírez et al. 2011; Cuenca et al. 2013b). A este respecto, precisamente Frías-Quintana et al. (2010) revelaron que gran parte de la digestión de ingredientes proteínicos en A. tropicus, se lleva a cabo en el estómago (y no en intestino). En cuanto a los ingredientes proteínicos de origen vegetal, las harinas de soya, de canola y pasta de coco, observaron los GH más acentuados. La harina de soya junto con la harina de carne y visceras de pollo y las harinas e hidrolizados de pescado han mostrado aceptables valores GH en condiciones alcalinas en la dorada Sparus amata, el pez disco Symphysodon aequifasciatus, la cabrilla arenera Paralabrax maculatofasciatus, y el róbalo blanco Centropomus undecimalis (Alarcón et al. 2002; Chong et al. 2002; Álvarez-González 2003; Concha-Frías 2007), aunque habría que tomar en consideración que se trata de especies marinas y más de hábitos carnívoros, lo que puede implicar ciertas diferencias en la composición enzimática de los extractos crudos intestinales, respecto de la de C. urophthalmus. La harina de soya es un ingrediente ampliamente utilizado en dietas artificiales para peces tanto marinos como dulceacuícolas, en tanto que la harina de canola posee aproximadamente 36% de proteína cruda (Nackz et al. 1998), es rica en lisina y aminoácidos sulfurados (Uppstrom 1995). Sin embargo, es necesario considerar su inclusión en dietas artificiales en acuacultura, ya que la canola contiene taninos, glucosinolatos, ácido fítico y elevados niveles de fibra, que actúan como factores antinutrientes (Bell 1993). En cuanto a la harina de coco, puede ser una fuente de proteína y ácidos grasos insaturados a considerar, al menos para C. urophthalmus; más aún, mostró altos niveles GH en ambas fases de la hidrólisis, además de que es un insumo de mucho menor costo que las fuentes de proteína de origen animal, siendo además muy abundante en el sureste de México.

Por otro, lado las técnicas que se basan en la reacción del o-pthaldialdehído con los aminoácidos (Nielsen et al. 2001), son otra herramienta útil que permiten complementar los estudios de digestibilidad in vitro. Con lo que respecta a los valores ALT que resultaron de la hidrólisis ácida de ingredientes proteínicos, destacan las harinas de sangre porcina, de plasma porcino, de carne y visceras de pollo como ingredientes de origen animal, seguidos de la harina de sorgo, de canavalia, maíz grano, de canola y de pasta de coco. No obstante que los valores ALT de estos ingredientes no revelaron diferencias significativas respecto del ingrediente de referencia, es necesario poner énfasis que las harinas de carne y visceras de pollo, de sangre porcina, de maíz grano, de canola y de pasta de coco, observaron valores GH intermedios durante la fase ácida, lo que le puede hacer un objeto de más estudios como fuentes potenciales de proteína para C. urophthalmus. No así con las harinas de plasma porcino, de sorgo y de canavalia que obtuvieron GH ácidos ínfimos. En condiciones alcalinas los ALT más relevantes y que a su vez observaron valores GH alcalinos significativamente por arriba del ingrediente de referencia, correspondieron a las harinas de cerdo, de carne y visceras de pollo, de canola y el hidrolizado de pescado, que por consiguiente es posible considerarlos como fuentes potenciales de proteína para C. urophthalmus. Son menos meritorias de considerarse las harinas de trigo, de camarón, de jaiba, de sorgo y pulido de arroz, puesto que presentaron valores GH alcalinos bajos.

Son escasos los estudios en lo que se refiere a la evaluación de ALT de ingredientes proteínicos que se probaron en el presente estudio. Es posible comparar el valor ALT de la harina de carne y visceras de pollo (631.2 ± 3.6 y 1830.8 ± 9.5 µg ml^-1, condiciones ácida y alcalina respectivamente), que encontraron Frías-Quintana et al. (2010) en A. tropicus, mientras que los ALT de C. urophthalmus que se obtenidos en la presente investigación fueron 793.9 ± 21.1 y 1587.8 ± 13.0 µg ml^-1, respectivamente; lo que refleja cierta similitud en los ALT de ambas especies. Aunque A. tropicus es de hábitos carnívoros, C. urophthalmus es una especie omnívora, con cierta tendencia a la carnivoría (Chávez-Lomelí et al. 1989). Por otro lado, cabe hacer hincapié el hecho de que en condiciones alcalinas, se observaron varios valores ALT por encima del referente (caseína), en contraste con el referente (hemoglobina) que obtuvo el mayor valor ALT en condiciones ácidas. Es posible notar también que fueron más valores ALT alcalinos que resultaron estar por encima de los 1000 µg ml^-1. Lo anterior puede ser un indicador de que gran parte del proceso digestivo de ingredientes proteínicos se efectúa en el intestino de C. urophthalmus, lo cual también pudiera ser confirmado por la mayor concentración de proteasas alcalinas, con relación a la concentración de proteasas ácidas encontradas en este estudio. Aunque los valores GH y ALT de ingredientes de prueba en harinas de sangre porcina, de calamar, de maíz amarillo y de grano de maíz no presentaron diferencias significativas, con lo que respecta a la caseína utilizada como referente en la hidrólisis alcalina; si resultaron ser significativos con relación a la hemoglobina (ingrediente control), referente de la hidrólisis ácida. Resulta relevante observar en condiciones ácidas el hecho de que la hemoglobina haya mostrado uno de los valores GH más moderados de los 29 ingredientes probados, en contraste con su valor ALT. Ello puede implicar la realización de más estudios para corroborar estos resultados.

En general de los 29 ingredientes de prueba que presentaron valores GH y ALT significativamente mayores a los ingredientes referentes (hemoglobina/caseína), al término de la hidrólisis ácida y alcalina, fueron la harina de carne y visceras de pollo, de carne de cerdo, de canola, pasta de coco y el hidrolizado de pescado. De entre éstos, vale la pena mencionar a la pasta de coco, por ser un ingrediente abundante la mayor parte del año en el sureste de México, además de ser menos costoso, que las harinas de pescado y otras fuentes de proteína de origen animal probadas en los ensayos. Cabe mencionar también que muchos de los ingredientes probados en el presente estudio obtuvieron valores GH (ácidos y alcalinos) aún por encima de los valores GH de las harinas de pescado (Pedregal) y de pescado (Acua). Es menester no pasar por alto que insumos como las carne y visceras de pollo, la sangre porcina y sangre de res (subproductos de desecho de la industria ganadera y avícola) cuyas harinas observaron valores altos ya sea GH o ALT, incluso algunos por arriba de los ingredientes referentes, puedan ser objeto de más estudios, con el fin de considerárseles como fuentes potenciales de proteína para el cultivo de C. urophthalmus, o aun cuando solo hayan observado altos valores GH (ácidos o alcalinos) y no en sus respectivos valores ALT, o viceversa. Considerando lo anterior, sobresale que la gran cantidad de ingredientes que pueden ser utilizados para la formulación de una dieta balanceada específica para esta especie, con lo que considerando su requerimiento de proteína (45%), permitirá incluirlos de tal manera que pueda disminuirse el uso de harina de pescado como la principal fuente de proteína (Martínez-Palacios 1987; Martínez-Palacios et al. 2006). En la presente investigación se encontraron valores GH y ALT de gran parte de ingredientes probados, que pueden suponer la realización de estudios posteriores de sustitución parcial de harina de pescado en dietas experimentales, como fuentes potenciales de proteína alternativos hacia el diseño de dietas inertes para C. urophthalmus.

AGRADECIMIENTOS

El autor agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por otorgar la beca para los estudios de doctorado. El autor agradece al proyecto "Identificación de ingredientes en alimentos balanceados y su digestibilidad en el cultivo experimental de peces nativos en Tabasco" Fondos Mixtos CONACyT.

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