Control poscosecha de Geotrichum citri-aurantii en el limón mexicano (Citrus aurantifolia [Christm.] Swingle) mediante levaduras marinas y epífitas

Postharvest control of Geotrichum citri-aurantii on Mexican lemon (Citrus aurantifolia [Christm.] Swingle) with marine and epiphytic yeasts

LG Hernández–Montiel^1*, J Holguín–Peña¹, MG López–Aburto¹, E Troyo–Diéguez¹

¹ Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste. Mar Bermejo 195, Col. Playa Palo de Santa Rita. La Paz, Baja California Sur, 23090. (LGHM) (JHP) (MGLP) (ETD) *Correo electrónico: lhernandez@cibnor.mx

Artículo recibido: 04 de diciembre de 2009,
Aceptado: 17 de agosto de 2011

RESUMEN

Se evaluó el potencial antagónico de cuatro cepas de levaduras Debaryomyces hansenii, dos cepas de origen marino (DhhBCS05 y DhhBCS06) y dos epífitas (LL1 y LL2), contra Geotrichum citri-aurantii en frutos de limón mexicano. De acuerdo a la identificación y a las pruebas de patogenicidad, se determinó que G. citri-aurantii es el agente causal de la enfermedad de la pudrición ácida. Las cepas epífitas LL1 y LL2 redujeron significativamente la incidencia de la enfermedad y el área de lesión en los frutos inoculados con el patógeno. Todas las levaduras D. hansenii colonizaron las heridas de limón. Los resultados indican que las levaduras epífitas de D. hansenii son eficientes para el control de G. citri-aurantii sobre frutos de limón mexicano.

Palabras clave: Control biológico, hongo fitopatógeno, Debaryomyces hansenii.

ABSTRACT

The antagonistic potential of yeast Debaryomyces hansenii (two strains from marine source DhhBCS05, DhhBCS06 and two epiphytic LL1, LL2) against Geotrichum citri-aurantii on Mexican lemon fruits was evaluated. According to the identification and pathogenicity test, G. citri-aurantii was found to be the causal agent of sour rot disease. LL1 and LL2 epiphytic strains significantly reduced the disease incidence and the area of lesion on inoculated fruits with pathogenic fungi. All yeasts D. hansenii colonized lemon wounds. Results suggest that epiphytic yeasts D. hansenii were highly effective for controlling G. citri-aurantii on Mexican lemon fruits.

INTRODUCCIÓN 

América Latina es considerada como la principal región productora de cítricos con una aportación del 32% del total de la producción mundial. En el caso particular del limón mexicano (Citrus aurantifolia [Christm.] Swingle), México es el principal país productor en el mundo, exportando principalmente a los Estados Unidos un promedio anual de 30 mil toneladas de fruta, con un valor aproximado de 11.3 millones de dólares (ASERCA 2006). A pesar de la derrama económica que se obtiene con este cítrico, existen problemas en la conservación de la fruta en poscosecha, debido a las pudriciones causadas principalmente por hongos (Sharma et al. 2009; Hao et al. 2010). Una de las enfermedades comunes de los cítricos es la denominada pudrición ácida causada por el hongo Geotrichum citri-aurantii (Ferraris) R. Cif. & F. Cif. (Sinónimo Geotrichum candidum Link). Las infecciones por este patógeno se originan principalmente a través de las heridas en la superficie de los frutos durante la recolección o posteriormente en el manejo poscosecha (Liu et al. 2010; Mercier & Smilanick 2005). El tratamiento tradicional de control es a base de fungicidas sintéticos, sin embargo, se ha documentado ampliamente sobre la aparición de cepas resistentes a varios ingredientes activos, principalmente al tiabendazol e imazalil (Liu et al. 2009; Eckert & Eaks 1989), por lo que la búsqueda de alternativas ha llevado a experimentar con el uso de agentes desinfectantes (Cerioni et al. 2009; Smilanick et al. 2002), aceites orgánicos (Yahyazadeh et al. 2009) y microorganismos como agentes de control biológico (Abraham et al. 2010). Por otra parte, la demanda del consumidor por adquirir alimentos libres de residuos tóxicos ha llevado a la restricción en el uso de una gran diversidad de agroquímicos. Además, en materia de fitosanidad e inocuidad alimentaria se han establecido lineamientos generales para la búsqueda de alternativas de control que incluyan ser inocuas y ecológicamente sustentables. En los últimos años, el control biológico de enfermedades poscosecha ha contemplado el uso de microorganismos antagónicos, destacando diversos tipos de levaduras, las cuales tienen la capacidad de colonizar y sobrevivir en la superficie de las frutas por largos periodos de tiempo (Lahlali et al. 2011). Dentro de sus mecanismos antagónicos destacan: la producción de toxinas killer, competencia de espacio y nutrientes, lisis enzimática e inducción de resistencia (Chi et al. 2010; Droby et al. 2002). La actividad de estos mecanismos está relacionada con el tipo y origen del antagonista, patógeno, hospedero y condiciones ambientales (Tian et al. 2002; Spotts et al. 1998). Diversos estudios con la levadura Debaryomyces hansenii han demostrado que es un antagonista eficaz contra patógenos de cítricos como Penicillium italicum y P. digitatum (Taqarort et al. 2008; Chalutz & Wilson 1990). Sin embargo, a la fecha no se ha explorado el potencial de esta levadura antagonista contra G. citri-aurantii. En esta investigación, se estudia el potencial de cepas marinas y epífitas de D. hansenii para disminuir la pudrición ácida ocasionada por G. citri-aurantii sobre frutos de limón mexicano.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento e identificación del hongo

El patógeno fue obtenido de frutos de limón mexicano con síntomas de pudrición ácida provenientes de huertas localizadas en Tecomán, Estado de Colima con un grado de madurez fisiológica o punto sazón mínimo determinado mediante la norma mexicana NMX-FF-012-1982. Para el aislamiento, se realizó un raspado superficial sobre los limones, depositando las muestras en placas con medio Agar de Papa-Dextrosa (PDA, Difco) adicionado con 100 ppm de cloranfenicol y 50 ppm de ampicilina, incubándolas a 25 ^oC durante 72 h. Las colonias fueron trasferidas a nuevas placas con PDA hasta su purificación. Se realizaron los postulados de Koch para verificar la patogenicidad del hongo, el cual, fue identificado a nivel de género en base a sus características morfológicas con las claves taxonómicas propuestas por De-Hoog et al. (1986) y Gente et al. (2006). La determinación de la especie se llevó a cabo por la técnica molecular de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando los iniciadores ITS1 e ITS4 de la región ITS1-5.8s-ITS2 del DNA ribosomal (rDNA) (White et al. 1990). La amplificación se realizó en un termociclador (System 9700 GeneAmp) utilizando el protocolo descrito por Ochoa et al. (2007). El producto obtenido fue secuenciado por la compañía MACROGEN (Seúl, Korea) y analizado en base a las secuencias de hongos depositadas en el banco de datos del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Levaduras antagónicas

Se utilizaron cuatro cepas de la levadura D. hansenii catalogadas como: DhhBCS05, DhhBCS06 (aisladas de ambiente marino), LL1 y LL2 (epífitas de limón mexicano). Como tratamiento control se utilizó una levadura de Saccharomyces cerevisiae. Todos los microorganismos pertenecen a la colección de levaduras (Cepario No. Reg. CLT20) del Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR).

El hongo se cultivó en medio líquido de papa-dextrosa y se incubó por 8 d a 25 ^oC y 80 rpm. Posteriormente, se cosecharon las artrosporas suspendiéndolas en agua destilada estéril conteniendo 0.01% (p/v) de Tween 80. Se utilizó un hematocitómetro para ajustar la concentración a 10⁴ artrosporas mL^-1. Por su parte, las levaduras se crecieron en medio líquido (YPD) conteniendo: extracto de levadura 1%, peptona 2% y dextrosa 2%. Se incubaron por 24 h a 25 ^oC y 80 rpm. Con un hematocitómetro la concentración de cada levadura se ajusto a 10⁶ células mL^-1.

Inoculación experimental

Los frutos de limón mexicano se desinfectaron con 2 mg L^-1 de dióxido de cloro por 2 min. Para la infección experimental, se utilizó un sacabocados estéril para realizarle a los frutos dos heridas equidistantes de 3 mm de diámetro por 2 mm de profundidad. Los frutos se sumergieron en cada solución de levadura durante 5 min y se dejaron secar a temperatura ambiente. Trascurrido el tiempo, se inoculó cada herida con 20 μl de la solución con G. citri-aurantii. Los frutos se almacenaron durante 21 días a 20 ± 1 ^oC y 85 ± 5% de humedad relativa (HR). Se calculó la incidencia de la enfermedad mediante la fórmula: iT = (Fi[100])/T, donde: Fi = número de frutos infectados; T = total de frutos inoculados a los 7, 14 y 21 d después de la inoculación (DDI) y, al final del experimento, se midió el diámetro de lesión (cm) ocasionado por el hongo sobre las heridas de los limones. Se utilizaron doce frutos por tratamiento. Todo el experimento se realizó por duplicado.

Colonización en heridas de limón

Con un bisturí estéril se cortó 1 cm² de la superficie del limón abarcando la zona de la herida, depositándolo en tubos falcón conteniendo 10 ml de buffer de fosfatos y 0.06% (v/v) de Tween 20. Las muestras se agitaron durante 20 min a 200 rpm (agitador rotativo Tecnal TE-421). Posteriormente, se realizaron diluciones (1:10, 1:100, 1:1000) utilizando una solución salina al 0.85%. Se sembró 1 mL de cada dilución, para el caso de las levaduras, en medio YPD adicionado con agar microbiológico 2%, 100 ppm de cloranfenicol, 50 ppm de ampicilina y 2 ppm de fluconazol. En el caso del hongo, se utilizó PDA adicionado con 100 ppm de cloranfenicol y 50 ppm de ampicilina. El cloranfenicol y la ampicilina fueron incluidos para inhibir el crecimiento bacteriano y el fluconazol se utilizó para inhibir el crecimiento de hongos filamentosos (Bendow & Sugar 1999). Las placas se incubaron durante 48 h a 25 ^oC. La cuantificación de la población de levadura y el hongo se realizó a los 7, 14 y 21 DDI de los frutos, expresándola en unidades formadoras de colonias (ufc cm^-2). Se realizaron tres repeticiones por tratamiento. Todo el experimento se realizó por duplicado.

Observaciones al microscopio electrónico de barrido

Para la observación de la colonización sobre los limones de G. citri-aurantii y las levaduras D. hansenii, se tomaron muestras de las heridas de los frutos para ser fijadas por inmersión con 2.5% de glutaraldehído en buffer de fosfatos a pH 7 durante 24 h. Posteriormente fueron procesadas de acuerdo a la metodología descrita por Usall et al. (2001) y observadas al microscopio electrónico de barrido (Hitachi S-3000N).

Análisis estadístico

Los datos fueron procesados en un análisis de varianza (ANOVA) de una vía. Se utilizó el paquete estadístico STADISTICA (Versión 6.0, StatSoft, Tulsa, OK). Para la separación de medias se realizó la prueba de Fisher de diferencia mínima significativa (LSD) con un nivel de significancia del 5% (p < 0.05).

RESULTADOS

Identificación del hongo patógeno

De acuerdo a las características morfológicas observadas de micelio septado e hialino, crecimiento prolífico y presencia de artrosporas, se identificó al hongo como Geotrichum spp. (Gente et al. 2006; De-Hoog et al. 1986). El análisis del fragmento amplificado de 374 pb por PCR obtuvo una similitud del 99% con la secuencia de la especie G. citri-aurantii (Número de acceso AF411060). De acuerdo a los Postulados de Koch se determinó al hongo como el agente causal de la pudrición ácida del limón mexicano. Los síntomas observados sobre los frutos fueron pudrición blanda con cambios iniciales en la coloración del flavedo de verde a café claro y lesiones con olor fermentado.

Incidencia de la enfermedad y tamaño de lesión en frutos de limón inoculados con levaduras

No se observó pudrición ácida a los 7 DDI de los limones con G. citri-aurantii y las levaduras epífitas de D. hansenii LL1 y LL2, en comparación con las levaduras marinas (DhhBCS05 y DhhBCS06) donde se presentaron pudriciones sobre los frutos de limón. A los 14 DDI y 21 DDI, las levaduras epífitas mantuvieron niveles bajos de incidencia de la enfermedad en comparación con las levaduras marinas (Tabla 1). Los frutos inoculados con Saccha-romyces cerevisiae al final del experimento (21 DDI) presentaron el mismo porcentaje de incidencia que el tratamiento con G. citri-aurantii.

El diámetro de lesión al final del experimento fue estadísticamente (p < 0.05) diferente entre los tratamientos de G. citri-aurantii y levaduras. Los frutos con las D. hansenii DhhBCS06, LL1 y LL2, presentaron lesiones menores (0.77, 0.65 y 0.63 cm, respectivamente) comparados con el tratamiento solo con hongo patógeno (2.83 cm). Los limones inoculados con S. cerevisiae presentaron un tamaño de lesión (2.82 cm) similar a la causada por el hongo (Figura 1).

Colonización de heridas

Todas las levaduras D. hansenii presentaron una dinámica poblacional más alta que G. citri-aurantii en los frutos de limón, tendencia que se cuantificó durante todo el experimento en los tres períodos evaluados (Figura 2). La población de todas las D. hansenii se mantuvo a través del tiempo (7 DDI) con valores superiores a 2x10⁸ ufc cm^-2, alcanzando la máxima concentración de 3.7 x10⁸ ufc cm^-2 a los 21 DDI con las levaduras DhhBCS05 y LL1. La población de S. cerevisiae sobre los frutos fue menor que las demás levaduras, manteniéndose también por debajo de la dinámica del hongo. La eficiencia en la colonización por D. hansenii se puede observar en la micrografía electrónica de la Figura 3, donde se visualiza un ejemplo de la proliferación de la levadura LL1 en comparación con G. citri-aurantii sobre frutos de limón.

DISCUSIÓN

Geotrichum citri-aurantii es un patógeno referido como uno de los principales hongos que ocasionan pérdidas económicas en poscosecha de cítricos, especialmente en limón (cv. Eureka), mandarina y naranja (cv. Valencia y Navel) (Smilanick et al. 2008; Mercier & Smilanick 2005; Tournas & Katsoudas 2005). La pruebas de patogenicidad con G. citri-aurantii muestran que este hongo es el agente causal de la pudrición ácida del limón mexicano en Tecomán, Estado de Colima. De acuerdo a los resultados de este estudio, la aplicación de levaduras epífitas de Debaryomyces hansenii es una alternativa para el control de G. citri-aurantii. Las levaduras de este género han mostrado ser una alternativa viable para el control biológico de hongos en poscosecha en cultivos como la toronja y limón (Hernández-Montiel et al. 2010; Droby et al. 1989). En limón mexicano, existió una rápida colonización de las levaduras epífitas sobre las heridas, las cuales limitaron al hongo en su población, debido principalmente a la competencia por espacio y nutrientes. Este mecanismo es una ventaja que las levaduras presentan en comparación con los hongos que tienen una tasa de crecimiento lenta (Zhao et al. 2008). La eficiencia de las distintas cepas de D. hansenii en la disminución de la enfermedad, puede estar relacionada con la capacidad adaptativa de cada levadura hacia el hospedero, principalmente, en su habilidad para asimilar los carbohidratos presentes en las heridas del limón (Fazio et al. 2008; Plaza et al. 2004). Este mecanismo de competencia por nutrientes es uno de los más importantes ejercidos por levaduras hacia el antagonismo de hongos (Zhang et al. 2010; Bencheqroun et al. 2007). Aunque los resultados encontrados con S. cerevisiae, sugieren que no cualquier levadura tiene la capacidad de inhibir a otro organismo aún en la competencia por espacio y/o nutrientes. A pesar que en este estudio no se evaluó la capacidad de las levaduras para producir toxinas killer y enzimas hidrolíticas, estos compuestos extracelulares tienen un papel importante en el antagonismo de hongos causantes de enfermedades en poscosecha (Hernández-Montiel et al. 2009; Santos et al. 2009; Ganiger et al. 2008). Las diferencias en la colonización de los frutos entre las D. hansenii y S. cerevisiae comúnmente se encuentran relacionadas a la capacidad de adaptación y asimilación de diversos carbohidratos presentes en las heridas (Plaza et al. 2004). Estos compuestos, permiten a las levaduras establecerse y adaptarse al sustrato del hospedero, colonizando de manera eficiente las heridas (Smilanick et al. 2008; Tournas & Katsoudas 2005). Al respecto, Macarisin et al. (2010) y Nunes et al. (2001) mencionan que existen otros mecanismos que influyen en estos procesos que van desde la disponibilidad de espacio y nutrientes hasta la restricción de sitios de infección. La aplicación de la levadura D. hansenii, como agente de control biológico, puede ser una alternativa para sustituir o disminuir el uso de agroquímicos y otros desinfectantes sintéticos utilizados para el control poscosecha de G. citri-aurantii, agente causal de la pudrición ácida en frutos de limón mexicano. Además, que esta levadura no representa un riesgo para la salud humana ni para el medio ambiente, al ser un componente natural del agroecosistema terrestre y marino (Ochoa & Vázquez-Juárez 2004).

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