Efecto del estrés en la respuesta ecofisiológica de la galleta de mar Dendraster excentricus en el noroeste de México

Effect of stress on the ecophysiological response of the sand dollar Dendraster excentricus from northwestern Mexico

Tatiana Olivares-Bañuelos, Salvador Figueroa-Flores, Eugenio Carpizo-Ituarte*

Instituto de Investigaciones Oceanológicas, Universidad Autónoma de Baja California, Carretera Transpeninsular Ensenada-Tijuana No. 3917, Fraccionamiento Playitas, Ensenada CP 22860, Baja California, México.

* Corresponding author.
E-mail: ecarpizo@uabc.edu.mx, ecarpizo@gmail.com

Received November 2013
Accepted May 2014.

RESUMEN

En el Pacífico mexicano, Dendraster excentricus es un equinodermo común en estuarios y está sujeto a variaciones ambientales por el flujo de marea. Poco se conoce de su respuesta ecofisiológica cuando es expuesta a cambios de temperatura y oxígeno. Este estudio evalúa su respuesta al estrés térmico en condiciones normales y de oxígeno reducido, utilizando como indicadores el índice de ARN/ADN y la expresión del gen hsp70. Se expusieron las galletas de mar a diferentes temperaturas y niveles de oxígeno. Tres de las temperaturas experimentales fueron comunes a las que los organismos experimentan durante un ciclo anual y dos de ellas se consideran extremas. Se consideraron condiciones de oxígeno reducido en niveles por debajo de 4 mg L^-1. Para estimar las variaciones inducidas por estrés en el índice de ARN/ADN, determinamos su valor en machos y hembras durante un ciclo diario. Además, analizamos la expresión del gen hsp70. En condiciones de estrés, se observó un decremento significativo en los índices de ARN/ADN. Los valores más bajos se detectaron después de 6 h en condiciones normales de oxígeno y las temperaturas altas parecieron inducir un mayor efecto en los índices durante la primera hora de estrés. El análisis de la expresión de hsp70 mostró diferencias significativas. Según nuestros resultados, el estrés térmico y por oxígeno induce una reducción general del metabolismo de los organismos. Estos cambios metabólicos se observaron en el decremento de los índices de ARN/ADN y en los niveles de la expresión de hsp70 (a altas temperaturas). Se concluye que los índices de ARN/ADN son una herramienta útil para entender la respuesta ecofisiológica en D. excentricus y parecen más sensibles a los niveles de oxígeno que al estrés térmico, en contraste con la expresión de hsp70 que resultó más sensible a las temperaturas extremas.

Palabras clave: estrés, oxígeno reducido, marcadores moleculares, ARN/ADN, gen hsp70.

ABSTRACT

In the Mexican Pacific, Dendraster excentricus, a common estuarine echinoderm, is subject to daily environmental variations in tidal fluxes. Little is known about its ecophysiological response when individuals are exposed to temperature and oxygen changes. This study evaluates their thermal stress response under normal and reduced oxygen conditions using the RNA/DNA ratio and hsp70 gene expression. We exposed sand dollars to different temperature and oxygen conditions. Three experimental temperatures were similar to the ones that organisms experience during one annual cycle and two were considered extreme. Reduced oxygen conditions were considered when levels dropped below 4 mg L^-1. To estimate variations in the stress-induced RNA/DNA ratio, we determined the value for males and females during a daily cycle. We also analyzed the hsp70 expression. Under stress conditions, a significant decrease was observed in the RNA/DNA ratios. The lowest values were detected after 6 h under normoxic conditions and high temperatures seemed to induce a major effect on the RNA/DNA ratios during the first hour of stress. Analysis of the hsp70 expression showed significant differences. According to our results, thermal and reduced oxygen stress induces a reduction in the general metabolism of the organisms. These metabolic changes were observed by the decrease in the RNA/DNA ratios and expression levels of hsp70 (at high temperatures). We conclude that RNA/DNA ratios are a useful ecophysiological tool to evaluate the effect of particular stressors on the physiology of D. excentricus, and seem to be more sensitive to oxygen levels than to thermal stress, in contrast to the hsp70 expression, which was more sensitive to extreme temperatures.

Key words: stress, reduced oxygen, molecular markers, RNA/DNA, hsp70 gene.

INTRODUCCIÓN

Los organismos estuarinos están constantemente expuestos a cambios de salinidad, pH, temperatura y oxígeno disuelto durante un ciclo mareal. Para sobrevivir en estas condiciones, las plantas y los animales deben ser capaces de responder rápidamente a estos cambios drásticos en los factores ambientales. La temperatura y el oxígeno disuelto son dos factores importantes que definen la adaptación de las especies a estas condiciones ambientales únicas. Es probable que los esteros resulten afectados por varios aspectos del cambio climático (Boesch et al. 2000), y la cantidad de oxígeno disuelto en un estero es uno de los principales factores que determina el tipo y la abundancia de organismos que pueden vivir ahí. La fluctuación de temperatura, por otro lado, es uno de los principales factores que determina la distribución de especies (Bianchi y Allison 2009). Varios estudios indican que la tolerancia térmica difiere entre especies según el intervalo de temperatura en sus hábitats, y Peck y Conway (2000) mencionan que la ventana de tolerancia es mayor en las especies tropicales y templadas que en los organismos estenotermos polares.

La galleta de mar Dendraster excentricus (Eschscholtz 1831) habita la zona submareal somera y la zona intermareal de lagunas costeras a lo largo de la costa occidental de los Estados Unidos y la península de Baja California (México). En el estero de Punta Banda, esta especie es abundante y se encuentran individuos maduros durante todo el año (Olivares-Bañuelos et al. 2012). Esta especie ectotérmica se adapta a y depende de que se mantenga el intervalo de temperatura característico de su ambiente natural (Pörtner 2002), y ha podido adaptar su comportamiento para tolerar aguas salobres. Aunque las galletas de mar están sujetas a un intercambio de agua continuo en su hábitat, durante gran parte del tiempo (inclusive durante la marea baja) se encuentran parcialmente enterradas y sus espinas no pueden ondear continuamente para obtener cantidades regulares de oxígeno disuelto (Lane y Lawrence 1979). Además, se ha mostrado que, en algunas especies de galleta de mar, la inanición y falta de oxígeno provocan modificaciones en su metabolismo debido a las condiciones físicas y al estado fisiológico del organismo (Lane y Lawrence 1979).

A pesar de que ha sido bien documentado que la temperatura y la hipoxia actúan como estresores metabólicos en muchos hábitats y varias especies, poco se sabe de los efectos de estos estresores en las galletas de mar que habitan en la costa del Pacífico del norte de México. El objetivo de este trabajo fue determinar la respuesta de D. excentricus a un intervalo de temperaturas y niveles bajos de oxígeno usando el índice de ARN/ADN y la expresión del gen hsp70 como marcadores moleculares de su respuesta ecofisiológica. El gen hsp70 codifica una proteína inducible por estrés que funciona como chaperón molecular de la actividad de las proteínas reguladoras clave, la proliferación celular, resistencia al estrés y apoptosis (Palotai et al. 2008, Gupta et al. 2010). La proteína hsp70 se encuentra en niveles bajos en muchas células y es altamente inducible por estrés, independientemente de la fase del ciclo celular (Hang y Fox 1996).

La detección de ácidos nucleicos en organismos marinos ha atraído particular interés debido a la relación entre el índice de ARN/ADN y la tasa de crecimiento de varios organismos marinos, incluyendo fitoplancton, bacterias, invertebrados y peces (Dell'Anno et al. 1998). La cantidad de ARN en una célula varía en función de la síntesis de proteínas, mientras que las concentraciones de ADN permanecen relativamente constantes, incluso durante la inanición. Así, la relación ARN/ADN es un indicador del potencial de una célula de sintetizar las proteínas (Henshaw et al. 1971). El índice de ARN/ADN fue propuesto hace 38 años como un indicador bioquímico del estado fisiológico y nutricional. Se ha usado para investigar la respuesta del estrés en diferentes taxones y se ha aplicado con éxito como un indicador del estado nutricional y el crecimiento de organismos marinos (Chícharo y Chícharo 2008). Este parámetro metabólico ha sido utilizado para estudiar los efectos tóxicos de productos farmacéuticos (Li et al. 2010), insecticidas piretroides (Kumar et al. 2008) y la minería de metales (Driedger et al. 2009) en el crecimiento de peces expuestos. La relación ARN/ADN también ha sido analizada para evaluar los efectos biológicos de la contaminación ambiental en áreas que han sido impactadas antropogénicamente (Revankar y Shyama 2009, Tsangaris et al. 2010).

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo y mantenimiento de los organismos

Se recolectaron organismos adultos de D. excentricus en el estero de Punta Banda en Baja California, México. El estero se ubica en el margen sudoriental de la bahía de Todos Santos (31°42'-31°47' N, 116°37'-116°39' W). Los organismos fueron recolectados durante la marea baja y transportados en cubetas con agua de mar al laboratorio. En el sitio de muestreo, se registraron el oxígeno disuelto y la temperatura del aire y del agua. Las galletas de mar se colocaron en acuarios y se mantuvieron a una temperatura de ~20 °C, con aireación y flujo constante de agua de mar. En el fondo de los acuarios se colocó una capa de 5 cm de arena del estero. Los organismos fueron expuestos a un fotoperiodo de 12/12 h (luz/oscuridad) y permanecieron en los acuarios durante 48 h, hasta ser usados en los experimentos. El peso fresco promedio de las 150 galletas de mar utilizadas fue 22.30 ± 0.61 g y su tamaño promedio fue 6.50 ± 0.06 cm (P = 0.6612). No se observaron diferencias significativas en el tamaño de los organismos experimentales empleados en los distintos experimentos o tratamientos.

Procedimiento experimental

Al principio de cada experimento, los organismos fueron pesados y medidos por su parte más ancha con un calibrador vernier. Se realizó un primer experimento para establecer el valor basal del índice de ARN/ADN de las galletas de mar adultas y determinar la variación de este índice. Veinte organismos fueron seleccionados al azar y etiquetados, y se colocaron en contenedores de plástico (cuatro por contenedor) con aireación y 3 cm de arena del estero. Los contenedores se llenaron con 1.5 L de agua de mar tratada con UV y filtrada a 20 °C. Los organismos permanecieron ahí durante 48 h (iniciando entre 9:00 y 10:00 AM). Se tomaron muestras de tejido de las espinas aborales al principio del experimento (tiempo cero). Extracciones anteriores de las espinas de la región aboral de galletas de mar resultaron ser adecuadas para obtener ácidos nucleicos de alta calidad con el reactivo TRIzol. Después del tiempo cero, se tomaron muestras consecutivas de tejido a las 6, 12, 24, 30 y 48 h. Todas las muestras fueron procesadas con el reactivo TRIzol como se describe más adelante. Al final del experimento, se determinó el sexo de los organismos y se registraron 10 machos y 10 hembras. El sexo se determinó a partir de los gametos liberados después de inducir al desove mediante la inyección de 0.5 mL de una solución de KC1 0.53 M a través de la membrana peristomial (ver Hinegardner 1969, Carpizo-Ituarte et al. 2002). Después de obtener los gametos, los organismos fueron regresados a los acuarios para permitirles recuperar del estrés.

En un segundo experimento, se investigó la respuesta térmica de 75 organismos en condiciones normóxicas. Se usaron 15 organismos en cinco tratamientos térmicos y cada tratamiento se replicó cinco veces. La oxigenación del agua se realizó mediante aireación constante. Los niveles de oxígeno disuelto variaron entre 8.68 y 4.99 mg L^-1, dependiendo de la temperatura experimental de cada tratamiento.

En un tercer experimento, se sometieron 75 galletas de mar a estrés térmico y niveles reducidos de oxígeno; cada tratamiento se replicó cinco veces. En este experimento no se proporcionó aireación. El efecto de oxígeno reducido se consideró cuando los niveles fueron inferiores a 4 mg L^-1 (oxígeno disuelto de 3.65 a 2.03 mg L^-1) como consecuencia de dejar los organismos experimentales sin flujo de aire.

Extracción de ácidos nucleicos

Se extrajeron ARN y ADN total con el reactivo TRIzol siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). La homogenización del tejido se realizó sobre hielo con la ayuda de una varilla de teflón. Después de las extracciones, se midió la absorbancia a 260 y 280 nm con un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Biolab, Mulgrave, VIC, Australia) para determinar la calidad y cantidad de los ácidos nucleicos; con los valores obtenidos se estimaron los índices de ARN/ADN. Para verificar que no se perdió ADN con el método de TRIzol, se precipitó el posible ADN restante con NaOAc 3M y etanol de los subproductos de la extracción de ARN, y posteriormente se cuantificaron las muestras precipitadas con el espectrofotómetro NanoDrop. Según los resultados, se extrajo 98.45 ± 0.228% del ADN con el reactivo TRIzol, lo que indica que se perdió sólo 1.55 ± 0.228% del ADN total con este método de extracción. Dada la ventaja de obtener ácidos nucleicos (ADN y ARN) de la misma muestra de tejido, consideramos que el método de TRIzol es una excelente opción para extraer una cantidad suficiente de ácidos nucleicos de buena calidad para calcular los índices de ARN/ADN.

Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa (RT-PCR por sus siglas en inglés)

Se extrajo ARN de las galletas de mar adultas con el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) como se describe arriba, y se usó para sintetizar el primer filamento complementario de ADN mediante la transcriptasa reversa SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA) y el cebador oligo-dT (Amersham, Piscataway, NJ) siguiendo los protocolos proporcionados por los fabricantes. Brevemente, en un volumen de reacción total de 20 μL, se añadió 0.8 μL de ARN total a 250 nM de oligo(dT)₂₀ y 10 mM de cada dNTP; la mezcla se calentó durante 5 min a 65 °C y se incubó durante 5 min sobre hielo. Subsecuentemente, se adicionaron First-Strand Buffer (1x), 10 U del inhibidor de la RNasa, 50 mM de DTT y 200 U de la transcriptasa reversa SuperScript III. La reacción se incubó a 50 °C durante 60 min y luego a 70 °C durante 15 min para inactivar la enzima. Se amplificó el ADN complementario (ADNc) mediante PCR con cebadores oligonucleótidos para el gen hsp70; la secuencia del cebador fue amablemente proporcionada por la Dra. Gretchen Hofmann (Marine Science Institute, Universidad de California, Santa Barbara) para amplificar un fragmento de 89 pb: hacia adelante, 5'-AAGATATGAGGTCCAACCCAAGAT-3'; hacia atrás, 5'-TGTCAAGCAGTGCTTCAGCA-3'.

La mezcla de PCR consistió de agua destilada estéril, 0.1 μL de ADNc, tampón de PCR, 2.5 mM de MgSO₄, 0.5 mM de dNTP, 1.0 U de Tfi ADN polimerasa, y cebadores sentido y antisentido (2.0 y 0.8 μM, respectivamente). Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador (Swift MiniPro Thermal Cycler, Esco Global, Esco Technologies, PA). Las condiciones de amplificación fueron 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 20 s, hibridación a 55 °C durante 20 s y extensión a 72 °C durante 20 s. En cada corrida experimental se usaron controles negativos (sin ADNc). Se añadió 2 μL de tampón de carga a cada tubo con producto de la PCR. Los productos y la escalera de ADN se cargaron en un gel de agarosa (2.0%) colocado en un tanque de electroforesis con tampón Tris-acetato-EDTA (TAE). La electroforesis se realizó a 75 V durante 45 min y las bandas se detectaron mediante un transiluminador (Benchtop UV Transilluminator, UVP, CA).

Cuantificación densitométrica de las bandas

Métodos estadísticos

Todos los datos fueron analizados con la prueba de normalidad de D'Agostino-Pearson (omnibus K2). Después de cada experimento, se analizaron los índices de ARN/ADN y los datos de hsp70 con la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis y la prueba de comparaciones múltiples de Dunn (intervalos de confianza de 95%). Los análisis se realizaron con el programa GraphPad Prism v5.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA). En la figura 1, los datos se expresan como valores medios (± error estándar de la media) de 10 individuos. En las demás figuras, los datos se expresan como valores medios de cinco tratamientos replicados (n = 5).

RESULTADOS

La variación diaria de los índices de ARN/ADN entre machos y hembras adultas de D. excentricus no mostró diferencias estadísticas (prueba de comparaciones múltiples de Dunn, α = 0.05) durante un periodo de dos días (fig. 1); sin embargo, en el índice de las hembras, se observó una disminución de los valores en las primeras 24 h. El índice medio de ARN/ADN (± error estándar de la media) al principio del experimento (hora cero) fue 1.603 ± 0.183 para las hembras y 1.353 ± 0.068 para los machos. En los análisis subsecuentes de los ácidos nucleicos de las galletas de mar no se observaron variaciones significativas en los índices después de 6 h (hembras = 1.667 ± 0.295; machos = 1.447 ± 0.213), 12 h (hembras = 1.221 ± 0.173; machos = 1.451 ± 0.221), 24 h (hembras = 1.011 ± 0.126; machos = 1.403 ± 0.091), 30 h (hembras = 1.345 ± 0.175; machos = 1.063 ± 0.027), y 48 h (hembras = 1.605 ± 0.306; machos = 1.563 ± 0.202).

Una vez conocida la variación diaria de los índices de ARN/ADN en condiciones de laboratorio, se investigó la respuesta al estrés térmico de D. excentricus en condiciones ya sea normóxicas o de oxígeno reducido. Los valores medios de los índices de ARN/ADN obtenidos en estos tratamientos fueron menores comparados con los obtenidos durante el ciclo diario (fig. 2). Después de 1 h de estrés térmico en condiciones normóxicas, se observaron diferencias significativas entre el tratamiento a 26 °C y el tratamiento control a 20 °C (P < 0.01) (fig. 2a). En condiciones de oxígeno reducido, también se observaron diferencias significativas entre el tratamiento a 4 °C y el tratamiento control a 20 °C (P < 0.01) (fig. 2b).

Después de 6 h, se observaron diferencias significativas entre los índices de ARN/ADN de los organismos expuestos a distintas condiciones de estrés térmico. En condiciones normóxicas, se observaron diferencias entre el tratamiento control a 20 °C y los tratamientos a 26 y 29 °C (P < 0.05 para ambos) (fig. 2e). En condiciones de oxígeno reducido, no se observaron diferencias entre los organismos expuestos a condiciones de estrés térmico y el grupo control, pero se observó un incremento considerable en el índice de ARN/ADN de los organismos expuestos a 13 y 26 °C en comparación con el grupo control.

Las variaciones en estos índices de ARN/ADN indican que D. excentricus respondió a las condiciones de estrés al que fue expuesta. Para corroborar esta observación, se analizó la expresión relativa del gen hsp70, un gen bien estudiado involucrado en la respuesta celular primaria al estrés. Los niveles de ARNm hsp70 en los extractos de las espinas aborales obtenidas de los organismos estresados fueron determinados mediante PCR semicuantitativa. El error estándar y la desviación estándar fueron consistentemente bajos, lo que indica que la transcriptasa reversa y los componentes de la PCR fueron altamente reproducibles. Después de 1 h de estrés en condiciones normóxicas, el tratamiento a 4 °C mostró una disminución de 25 ± 3.7% (P > 0.100) en los niveles de ARNm hsp70 en comparación con el tratamiento control a 20 °C (fig. 3a). Al contrario, después de 1 h de estrés en condiciones de oxígeno reducido, en el tratamiento a 29 °C (la mayor temperatura probada) se observó un aumento de 27 ± 5.09% (P = 0.013) en los niveles de ARNm hsp70 en comparación con el tratamiento control (fig. 3b). Después de 3 h de estrés en condiciones normóxicas (fig. 3c), en los tratamientos a 4 °C (la temperatura más baja) y 26 °C los niveles de ARNm hsp70 incrementaron 12 ± 2.371% (P >0.100) y 35 ± 12.98% (P > 0.100), respectivamente, en comparación con el tratamiento control. En condiciones de oxígeno reducido, no se observaron diferencias significativas después de 3 h de tratamiento. Después de 6 h, sin embargo, en condiciones de oxígeno reducido, se observó sólo una disminución significativa de 15 ± 3.63% (P > 0.100) en los niveles de ARNm hsp70 en el tratamiento a 29 °C (fig. 3f).

DISCUSIÓN

Nuestros resultados muestran cambios específicos relacionados con la temperatura, los niveles de oxígeno y el tiempo de exposición a condiciones de estrés en ambos marcadores moleculares evaluados (índice de ARN/ADN y nivel de ARNm hsp70).

En el ciclo diario de los índices de ARN/ADN, los valores variaron de 1.011 a 1.667 (fig. 1). Estos valores son similares a los documentados para varias especies de organismos marinos, incluyendo los equinodermos (ver tabla 1).

El primer experimento mostró que, durante las primeras 48 h, los índices de ARN/ADN no se relacionan ni con el género ni con la hora del ciclo diario; sin embargo, aparentemente las hembras son más sensibles. Estos resultados indican que es posible usar indistintamente machos o hembras de D. excentricus cuando se usa el índice de ARN/ADN como biomarcador de una respuesta al estrés. En nuestro primer experimento con el índice de ARN/ADN, los organismos expuestos a estrés térmico presentaron menores índices de ARN/ADN que los índices característicos de organismos adultos que no fueron sometidos a estrés durante un ciclo diario.

Se observaron los valores más bajos de la relación ARN/ ADN en los experimentos donde D. excentricus fue expuesto a estrés térmico en condiciones normóxicas, independientemente del tiempo de exposición. En condiciones de oxígeno reducido, se observó una disminución significativa entre los tratamientos experimentales a bajas temperaturas y el tratamiento control después de 1 h (disminución de 46% a 4 °C) y 3 h (disminución de 24% a 13 °C) de exposición. Se han obtenido resultados similares para otros invertebrados marinos de verano a invierno, cuando baja la temperatura (Marsh et al. 2001, Fraser et al. 2002). En particular, en el erizo de mar Sterechinus neumayeri (Marsh et al. 2001) y la lapa Nacella concinna (Fraser et al. 2002), las tasas de síntesis de proteínas disminuyeron un 52%, las concentraciones de ARN disminuyeron un 55% y los valores de ARN/proteína disminuyeron un 68%, mientras que las eficiencias de traducción de ARN fueron bajas y muy variables.

Es interesante notar que en condiciones normóxicas, después de sólo 6 h de estrés, los índices de ARN/ADN incrementaron significativamente en los tratamientos a 26 °C (incremento de 80%) y 29 °C (incremento de 155%) en relación con el tratamiento control. Aparentemente, los índices de ARN/ADN son más sensibles a condiciones de oxígeno que a estrés térmico.

Además del efecto del estrés en la depresión metabólica, se ha documentado la sobreexpresión de ciertos genes y proteínas, relacionada con la respuesta primaria al estrés a nivel celular. Se ha observado un aumento de chaperones específicos de estrés de ARNm en erizos de mar (Matranga et al. 2002), ostiones (Farcy et al. 2009), anfioxos (Liu et al. 2009), bivalvos (Kim et al. 2009) y langostas (Spees et al. 2002). Todas las células responden al calor y otros agentes de estrés fisiológico mediante la producción de proteínas de choque térmico (Hsps) que actúan como chaperonas moleculares, uniéndose a y asistiendo en el plegamiento de otras proteínas (Browne et al. 2007). Nuestros resultados de la medición de la expresión relativa de ARNm hsp70 mediante RT-PCR después de 1, 3 y 6 h de estrés continuo, corroboran que los niveles de las Hsps de 70 kDa (Hsp70) cambian con el estrés fisiológico, como lo mencionan Lancaster y Febbraio (2005). Se observó una disminución significativa en los niveles de hsp70 después de 1 h de estrés a 4 °C en condiciones normóxicas, así como después de 1 h a 4 °C y después de 6 h a 29 °C en condiciones de oxígeno reducido. Se han obtenido resultados similares para pepinos de mar, observándose una regulación decreciente de las Hsp70 durante la recuperación después de un choque térmico subletal (Dong et al. 2010). Además, se observaron aumentos significativos de este gen después de 1 y 3 h en condiciones normóxicas y de oxígeno reducido. Varios trabajos han documentado la presencia de tanto la forma constitutiva como la forma inducible de Hsp70 en equinodermos (Giudice et al. 1999), aunque la segunda no está presente en condiciones normales y sólo aparece después de estrés metabólico (Geraci et al. 2004). En Drosophila, un tratamiento térmico corto resultó en una fuerte inducción de Hsps y una fuerte disminución de la síntesis de proteínas normales (DiDomenico et al. 1982). Asimismo, se ha observado un aumento de las enzimas antioxidantes como superóxido dismutasa en el coral Pocillopora verrucosa (Rodríguez-Troncoso et al. 2013) y en la langostilla Pleuroncodes planipes (Martínez-Canto et al. 2013). Este patrón puede mantenerse durante los primeros 90 min de recuperación del estrés sufrido, pero en condiciones de estrés continuo, gradualmente incrementa la síntesis de proteínas normales y disminuye la síntesis de Hsps (DiDomenico et al. 1982). También se ha documentado que la vida media de las Hsp70 del pepino de mar es bastante corta (<3 días) (Dong et al. 2010), y que en pollos, la estabilidad de ARNm hsp70 depende de la temperatura y el estado celular (Theodorakis et al. 1988). Los choques térmicos tienen un fuerte efecto en la estabilidad de ARNm hsp70, y la vida media de ARNm aumenta al menos 10 veces con el estrés generado por los choques térmicos (Dong et al. 2010).

Los organismos expuestos a estrés necesitan responder rápidamente a los cambios en las condiciones ambientales, especialmente en ambientes estuarinos. Para hacer esto, disminuyen la síntesis de varias moléculas celulares para enfocarse en la producción de proteínas chaperonas. Es posible que las galletas de mar, en temperaturas extremas, canalizan su energía a la producción de moléculas chaperonas para enfrentar las condiciones estresantes; sin embargo, la reducción de su metabolismo general es mayor que la síntesis de las chaperonas y, consecuentemente, se observó un valor más bajo en el índice de ARN/ADN. Es importante mencionar que todas las galletas de mar expuestas a estrés durante los experimentos sobrevivieron hasta el final del periodo experimental, lo que demuestra la plasticidad fenotípica de estos organismos a resistir cambios de temperatura durante periodos cortos de tiempo.

Cuando las galletas de mar fueron expuestas a temperaturas extremas (4 y 29 °C) durante el periodo experimental más largo (6 h) de nuestros tratamientos, se observaron diferencias en los índices de ARN/ADN entre las condiciones normóxicas y de oxígeno reducido. También se detectaron variaciones significativas después de este tiempo de exposición entre los tratamientos con condiciones normales y de oxígeno reducido. Consideramos que este resultado se debe al largo tiempo de exposición (6 h) en combinación con los niveles bajos de oxígeno. Cabe mencionar que no se detectaron diferencias en la concentración de oxígeno entre los tratamientos control y experimentales durante los experimentos. Después de 6 h en condiciones de oxígeno reducido, la concentración media de oxígeno fue 2.87 mg L^-1, por debajo de los niveles mínimos sugeridos (~3 mg L^-1). Por lo tanto, el aumento en los índices de ARN/ADN en los tratamientos a 13 y 26 °C después de 6 h podría ser producto del efecto sinérgico de tres factores de estrés: temperatura, tiempo de exposición y niveles bajos de oxígeno. Asimismo, esta ventana térmica podría representar la menor y mayor capacidad de respuesta de D. excentricus en las condiciones experimentales probadas. Se ha observado el efecto sinérgico de varios factores de estrés en los ostiones; por ejemplo, elevadas temperaturas y concentraciones de cadmio modifican su metabolismo energético (Lannig et al. 2006). En el presente trabajo, consideramos que la concentración de oxígeno después de 6 h podría tener un efecto sinérgico al generar el estrés térmico de los organismos. Además, la relación cercana entre hsp70 y la tolerancia al estrés indica que estos factores de estrés podrían haber aumentado los niveles de Hsp70, lo que consecuentemente aumentó la tolerancia de las galletas de mar al estrés subsecuente, al igual que se documentó para los pepinos de mar expuestos a estrés (Dong et al. 2010).

Nuestros resultados indican que el índice de ARN/ADN puede ser usado como un biomarcador de estrés para D. excentricus, especialmente cuando se evalúa el estrés asociado con condiciones de oxígeno, en contraste con la expresión de hsp70 que fue más sensible a las temperaturas extremas probadas. Este trabajo contribuye a la literatura molecular que muestra el uso exitoso de los índices de ARN/ ADN como indicadores ecofisiológicos en organismos marinos. Nuestro estudio constituye un primer esfuerzo por entender los efectos de los cambios de temperatura y oxígeno en organismos adultos de D. excentricus. Se requieren mayores estudios detallados de la expresión de genes; la batería de genes involucrados en la condición fisiológica generada por temperaturas ambientales inusuales determina el grado de adaptación de las galletas de mar del noroeste de México a las futuras condiciones de su hábitat en el escenario de cambio climático.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue apoyado por la Universidad Autónoma de Baja California (UABC, proyecto interno No. 533 a ECI) y por la Secretaría de Educación Pública (Programa Integral de Fortalecimiento Institucional). Agradecemos la ayuda proporcionada por todos los miembros del Laboratorio de Ecología y Biología del Desarrollo (IIO-UABC) y en especial a Roberto Escobar-Fernández su ayuda en el mantenimiento de los organismos.

REFERENCIAS

Bianchi TS, Allison MA. 2009. Large-river delta-front estuaries as natural "recorders" of global environmental change. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 8005-8092. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0812878106.         [ Links ]

Boesch DF, Field JC, Scavia D (editors). 2000. The Potential Consequences of Climate Variability and Change on Coastal Areas and Marine Resources: Report of the Coastal Areas and Marine Resources Sector Team, US National Assessment of the Potential Consequences of Climate Variability and Change, US Global Change Research Program. NOAA Coastal Ocean Program Decision Analysis Series No. 21, Silver Spring, MD, 163 pp.         [ Links ]

Browne CL, Swan JB, Rankin EE, Calvert H, Griffiths S, Tylell M. 2007. Extracellular heat shock protein 70 has novel functional effects on sea urchin eggs and coelomocytes. J. Exp. Biol. 210: 1275-1287. http://dx.doi.org/10.1242/jeb.02743.         [ Links ]

Buckley LJ, Turner SI, Halavik TA, Smigielski AS, Drew SM, Laurence GC. 1984. Effects of temperature and food availability on growth, survival, and RNA-DNA ratio of larval sand lance (Ammodytes americanus). Mar. Ecol. Prog. Ser. 15: 91-97.         [ Links ]

Caldarone EM. 2005. Estimating growth in haddock larvae Melanogrammus aeglefinus from RNA:DNA ratios and water temperature. Mar. Ecol. Prog. Ser. 293: 241-252. http://dx.doi.org/10.3354/meps293241.         [ Links ]

Carpizo-Ituarte E, Salas-Garza A, Parés-Sierra G. 2002. Induction to metamorphosis of three species of sea urchins (Strongylocentrotus spp.) with KCl and its application in the production ofjuveniles. Cienc. Mar. 28: 157-166.         [ Links ]

Chícharo LM, Chícharo MA. 1995. The RNA/DNA ratio as a useful indicator of the nutritional condition in juveniles of Ruditapes decussatus. Sci. Mar. 59 (Supl. 1): 95-101.         [ Links ]

Chícharo MA, Chícharo L. 2008. RNA:DNA ratio and other nucleic acid derived indices in marine ecology. Int. J. Mol. Sci. 9: 1453-1471. http://dx.doi.org/10.3390/ijms9081453.         [ Links ]

Clemmesen C. 1993. Improvements in the fluorimetric determination of the RNA and DNA content of individual marine fish larvae. Mar. Ecol. Prog. Ser. 100: 177-183.         [ Links ]

Dahlhoff EP. 2004. Biochemical indicators of stress and metabolism: Applications for marine ecological studies. Annu. Rev. Physiol. 66: 183-207. http://dx.doi.org/10.1146/annurev.physiol.66.032102.114509.         [ Links ]

Dell'Anno A, Fabiano M, Duineveld GCA, Kok A, Danovaro R. 1998. Nucleic acid (DNA, RNA) quantification and RNA/DNA ratio determination in marine sediments: Comparison of spectrophotometric, fluorometric, and high-performance liquid chromatography methods and estimation of detrial DNA. Appl. Environ. Microbiol. 64: 3238-3245.         [ Links ]

DiDomenico BJ, Bugaisky GE, Lindquist S. 1982. Heat shock and recovery are mediated by different translational mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6181-5.         [ Links ]

Dong Y-W, Ji T-T, Meng X-L, Dong S-L, Sun W-M. 2010. Difference in thermotolerance between green and red color variants of the Japanese sea cucumber, Apostichopus japonicus Selenka: Hsp70 and heat-hardening effect. Biol. Bull. 218: 87-94.         [ Links ]

Driedger K, Weber LP, Rickwood CJ, Dubé MG, Janz DM. 2009. Overwinter alterations in energy stores and growth in juvenile fishes inhabiting areas receiving metal mining and municipal wastewater effluents. Environ. Toxicol. Chem. 28: 296-304. http://dx.doi.org/10.1897/08-028.1.         [ Links ]

Farcy E, Voiseux C, Lebel J-M, Fiévet B. 2009. Transcriptional expression levels of cell stress marker genes in the Pacific oyster Crassostrea gigas exposed to acute thermal stress. Cell Stress Chaperones 14: 371-80. http://dx.doi.org/10.1007/s12192-008-0091-8.         [ Links ]

Folkvord A, Ystanes L, Johannessen A, Moksness E. 1996. RNA:DNA ratios and growth of herring (Clupea harengus) larvae reared in mesocosms. Mar Biol. 126: 591-602. http://dx.doi.org/10.1007/BF00351326.         [ Links ]

Fraser KPP, Clarke A, Peck LS. 2002. Low-temperature protein metabolism: Seasonal changes in protein synthesis and RNA dynamics in the Antarctic limpet Nacella concinna Strebel 1908. J. Exp. Biol. 205: 3077-86.         [ Links ]

Geraci F, Pinsino A, Turturici G, Savona R, Giudice G, Sconzo G. 2004. Nickel, lead, and cadmium induce differential cellular responses in sea urchin embryos by activating the synthesis of different HSP70s. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322: 873-877. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2004.08.005.         [ Links ]

Giudice G, Sconzo G, Roccheri MC. 1999. Studies on heat shock proteins in sea urchin development. Dev. Growth Differ. 41: 375-380. http://dx.doi.org/10.1046/j.1440-169x.1999.00450.x.         [ Links ]

Gupta SC, Sharma A, Mishra M, Mishra RK, Chowdhuri DK. 2010. Heat shock proteins in toxicology: How close and how far? Life Sci. 86: 377-384. http://dx.doi.org/10.1016Zj.lfs.2009.12.015.         [ Links ]

Hang H, Fox MH. 1996. Levels of 70-kDa heat shock protein through the cell cycle in several mammalian lines. Cytometry 25: 367-373. http://dx.doi.org/10.1002/(SICI)1097-0320(19961201)25:4<367::AID-CYTO8>3.0.CO;2-A.         [ Links ]

Henshaw E, Hirsch C, Morton B, Hiatt H. 1971. Control of protein synthesis in mammalian tissues through changes in ribosome activity. J. Biol. Chem. 246: 436-446.         [ Links ]

Hinegardner RT. 1969. Growth and development of the laboratory cultured sea urchin. Biol. Bull. 137: 465-475.         [ Links ]

Hovenkamp F, Witte JIJ. 1991. Growth, otolith growth and RNA/ DNA ratios of larval plaice Pleuronectes platessa in the North Sea 1987 to 1989. Mar. Ecol. Prog. Ser. 70: 105-116.         [ Links ]

Joyner-Matos J, Andrzejewski J, Briggs L, Baker SM, Downs CA, Julian D. 2009. Assessment of cellular and functional biomarkers in bivalves exposed to ecologically relevant abiotic stressors. J. Aquat. Anim. Health 21: 104-116. http://dx.doi.org/10.1577/H08-066.1.         [ Links ]

Kim M, Ahn I-Y, Kim H, Cheon J, Park H. 2009. Molecular characterization and induction of heat shock protein 90 in the Antarctic bivalve Laternula elliptica. Cell Stress Chaperones 14: 363-370. http://dx.doi.org/10.1007/s12192-008-0090-9.         [ Links ]

Kumar A, Sharma B, Pandey RS. 2008. Cypermethrin and lambdacyhalothrin induced alterations in nucleic acids and protein contents in a freshwater fish, Channa punctatus. Fish Physiol. Biochem. 34: 331-338. http://dx.doi.org/10.1007/s10695-007-9192-z.         [ Links ]

Lancaster GI, Febbraio MA. 2005. Mechanisms of stress-induced cellular HSP72 release: Implications for exercise-induced increases in extracellular HSP72. Exerc. Immunol. Rev. 11:46-52.         [ Links ]

Lane J, Lawrence J. 1979. Gonadal growth and gametogenesis in the sand dollar Mellita quinquiesperforata (Leske 1778). Biol. Bull. 157: 275-287.         [ Links ]

Lannig G, Flores JF, Sokolova IM. 2006. Temperature-dependent stress response in oysters, Crassostrea virginica: Pollution reduces temperature tolerance in oysters. Aquat. Toxicol. 79: 278-287. http://dx.doi.org/10.1016/j.aquatox.2006.06.017.         [ Links ]

Li Z-H, Zlabek V, Velisek J, Grabic R, Machova J, Randak T. 2010. Physiological condition status and muscle-based biomarkers in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), after long-term exposure to carbamazepine. J. Appl. Toxicol. 30: 197-203. http://dx.doi.org/10.1002/jat.1482        [ Links ]

Liu Z, Sun Y, Liu N, Fan N, Zhang S. 2009. Characterization, expression, and response to stress of p8 gene in amphioxus. Fish Shellfish Immunol. 27: 407-413. http://dx.doi.org/10.1016/j.fsi.2009.06.011.         [ Links ]

López-Rasgado F, Herzka S. 2009. Assessment of habitat quality for juvenile California halibut (Paralichthys californicus) in a seasonally arid estuary. Fish Bull. 107: 343-358.         [ Links ]

Marsh AG, Maxson RE, Manahan DT. 2001. High macromolecular synthesis with low metabolic cost in Antarctic sea urchin embryos. Science 291: 1950-1952. http://dx.doi.org/10.1126/science.1056341.         [ Links ]

Martínez-Canto O, Olguín-Monroy NO, de Anda-Montañez JA, Zenteno-Savín T. 2013. Spatial and temporal variability of oxidative stress indicators in the red crab (Pleuroncodes planipes) from the west coast of the Baja California Peninsula, Mexico. Cienc. Mar. 39: 41-53. http://dx.doi.org/10.7773/cm.v39i1.2153.         [ Links ]

Matranga V, Bonaventura R, Di Bella G. 2002. Hsp70 as a stress marker of sea urchin coelomocytes in short term cultures. Cell Mol. Biol. (Noisy-le-grand) 48: 345-9.         [ Links ]

Meesters EH, Nieuwland G, Duineveld GCA, Kok A, Bak RPM. 2002. RNA/DNA ratios of scleractinian corals suggest acclimatisation/adaptation in relation to light gradients and turbidity regimes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 227: 233-239 (2002). http://dx.doi.org/10.3354/meps227233.         [ Links ]

Olivares-Bañuelos T, Figueroa-Flores S, Carpizo-Ituarte E. 2012. Gonad index and larval development of the sand dollar Dendraster excentricus (Echinodermata; Echinoidea) in Baja California, Mexico. Cienc. Mar. 38: 411-125.         [ Links ]

Palotai R, Szalay MS, Csermely P. 2008. Chaperones as integrators of cellular networks: Changes of cellular integrity in stress and diseases. IUBMB Life 60:10-18. http://dx.doi.org/10.1002/iub.8.         [ Links ]

Peck L, Conway L. 2000. The myth of metabolic cold adaptation: Oxygen consumption in stenothermal Antarctic bivalves. In: Harper E, Taylor J, Crame J (eds.), The Evolutionary Biology of the Bivalvia. Geological Society Special Publication, London, pp. 441-450.         [ Links ]

Pörtner H. 2002. Climate variations and the physiological basis of temperature dependent biogeography: Systemic to molecular hierarchy of thermal tolerance in animals. Comp. Biochem. Physiol. 132: 739-761.         [ Links ]

Revankar PR, Shyama SK. 2009. Genotoxic effects of monocrotophos, an organophosphorous pesticide, on an estuarine bivalve, Meretrix ovum. Food Chem. Toxicol. 47: 1618-1623. http://dx.doi.org/10.1016/j.fct.2009.04.010.         [ Links ]

Roark AM, Bjorndal KA, Bolten AB, Leeuwenburgh C. 2009. Biochemical indices as correlates of recent growth in juvenile green turtles (Cheloniamydas). Ecology 376: 59-67. http://dx.doi.org/10.1016/j.jembe.2009.06.004.         [ Links ]

Rodríguez-Troncoso AP, Carpizo-Ituarte E, Cupul-Magaña A. 2013. Oxidative damage associated with thermal stress in Pocillopora verrucosa from the Mexican Pacific. Cienc. Mar. 39: 113-118.         [ Links ]

Siikavuopio SI, Mortensen A, Christiansen JS. 2008. Effects of body weight and temperature on feed intake, gonad growth and oxygen consumption in green sea urchin, Strongylocentrotus droebachiensis. Aquaculture 281: 77-82. http://dx.doi.org/10.1016/j.aquaculture.2008.05.033.         [ Links ]

Spees JL, Chang SA, Snyder MJ, Chang ES. 2002. Thermal acclimation and stress in the American lobster, Homarus americanus: Equivalent temperature shifts elicit unique gene expression patterns for molecular chaperones and polyubiquitin. Cell Stress Chaperones 7: 97-106.         [ Links ]

Steinhart M, Eckmann R. 1992. Evaluating the nutritional condition of individual whitefish (Coregonus spp.) larvae by the RNA/DNA ratio. 40: 791-799. http://dx.doi.org/10.1111/j.1095-8649.1992.tb02625.x.         [ Links ]

Theodorakis NG, Banerji SS, Morimoto RI. 1988. HSP70 mRNA translation in chicken reticulocytes is regulated at the level of elongation. J. Biol. Chem. 263: 14579-85.         [ Links ]

Tsangaris C, Kormas K, Strogyloudi E, Hatzianestis I, Neofitou C, Andral B, Galgani F. 2010. Multiple biomarkers of pollution effects in caged mussels on the Greek coastline. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151: 369-378. http://dx.doi.org/10.1016/j.cbpc.2009.12.009.         [ Links ]

Wagner M, Durbin E, Buckley L. 1998. RNA:DNA ratios as indicators of nutritional condition in the copepod Calanus finmarchicus. Mar. Ecol. Prog. Ser. 162: 173-181. http://dx.doi.org/10.3354/meps162173.         [ Links ]

Traducido al español por Christine Harris.