Heavy metals and related biomarkers in Perna viridis (Bivalvia: Mytilidae) collected on the coast of Sucre State, Venezuela

E Zapata-Vívenes¹*, L Rojas de Astudillo², G Sánchez³, M Barreto³

¹ Departamento de Biología, Escuela de Ciencias, Núcleo de Sucre, Universidad de Oriente, Cerro Colorado, Cumaná, Venezuela. *Corresponding author. E-mail: edzapata2002@yahoo.com

² Departamento de Química, Escuela de Ciencias, Núcleo de Sucre, Universidad de Oriente, Venezuela.

³ Postgrado en Biología Aplicada, Escuela de Ciencias, Núcleo de Sucre, Universidad de Oriente, Venezuela.

Received August 2011,
Received in revisedform April 2012,
Accepted June 2012.

RESUMEN

El mejillón verde Perna viridis ha sido usado como organismo biosensor de la salud de ecosistemas marino-costeros. Por tal motivo se procedió a evaluar el grado de contaminación de tres localidades costeras del estado Sucre (Venezuela) determinando biomarcadores a nivel molecular, celular e inmunológico en P. viridis. Los ejemplares fueron recolectados en las localidades de Chacopata-Guayacán (CG, península de Araya), Río Caribe (RC, península de Paria) y San Antonio del Golfo (SAG, región sur del golfo de Cariaco). Se determinó la carga de metales pesados en el tejido blando de cada individuo. Además, se valoró el número total, la viabilidad, la fagocitosis y la estabilidad de las membranas lisosomales en los hemocitos. El daño oxidativo de lípidos (TBARS), los niveles de grupos sulfhídrilos, las proteínas totales y la actividad de la lisozima fueron cuantificados en la glándula digestiva. Los resultados evidencian altas concentraciones de Zn, Cr y Cd en organismos provenientes de CG. El número de células totales en hemolinfa fue menor en los organismos de RC y CG. En estas últimas zonas los mejillones presentaron un ligero incremento en número de fagocitos con respecto a SAG. El mayor porcentaje de hemocitos con membranas lisosomales desestabilizadas fue encontrado en los organismos de CG, seguido de RC, evidenciándose una débil asociación con el contenido de lípidos peroxidados (TBARS); estos valores podrían tener correspondencia con la acumulación corporal de metales pesados. Los resultados revelan que los mejillones de CG muestran ligeros indicios de contaminación por metales pesados, originados presumiblemente por actividades antropogénicas. Esta investigación sugiere la utilidad de marcadores biológicos destinados a estimar el impacto de metales pesados en organismos centinelas.

Palabras clave: defensas antioxidantes, hemocitos, lisozimas, metales pesados, Perna viridis.

ABSTRACT

Key words: antioxidant defenses, hemocytes, lysozymes, heavy metals, Perna viridis.

INTRODUCCIÓN

Los niveles de metales pesados en algunas zonas costeras del estado Sucre (Venezuela) han incrementado recientemente a causa antropogénica (Martínez 2002). Las posibles fuentes son los efluentes urbanos e industriales, inclusive las descargas límnicas que transportan dichos metales desde sitios de intensa actividad industrial y minera hasta los sedimentos de ecosistemas locales. Para evaluar el estado de salud de estas zonas, se ha seleccionado al mejillón verde Perna viridis como especie biosensora para estimar el nivel de contaminación. Este mitílido posee marcadores biológicos sensibles que son modulados bajo exposición subletal a metales pesados (Zapata-Vívenes y Nusetti 2007, Nusetti et al. 2010).

Las respuestas inmunológicas, moleculares y celulares en bivalvos constituyen biomarcadores importantes en las evaluaciones de efectos inducidos por la exposición a contaminantes químicos. El ingreso y posterior metabolismo de tales xenobióticos puede alterar las funciones y el balance del sistema inmune, resultando en efectos perjudiciales, que incluyen inmunosupresión, proliferación anormal celular y alteración de los mecanismos de defensa del hospedero contra patógenos (Cheng 1988, Cheung et al. 2001). El sistema de defensa inmunológico en bivalvos está constituido por hemocitos, moléculas bacteriolíticas y degradación a nivel lisosomal (Sminia 1980).

De igual forma, los efectos de los metales pesados a nivel celular pueden ser detectados por alteraciones de la estabilidad de membranas lisosomales (Lowe 1995). La determinación de la integridad de la membrana lisosomal indica posibles condiciones deletéreas ante cambios drásticos e irreversibles que ocurren en el ambiente y puede ser una alternativa en la toma de decisiones preventivas. Este parámetro de daño celular puede estimarse mediante la capacidad de retención de colorantes, tal como el rojo neutro, lo cual puede indicar una relación proporcional entre la reducción del tiempo de retención del colorante en células de organismos que habitan zonas impactadas por xenobióticos (Fang et al. 2008).

Las moléculas antioxidantes y los daños oxidativos a nivel de lípidos de membrana han sido utilizados frecuentemente como biomarcadores moleculares de estrés químico, especialmente por agentes pro-oxidantes como algunos metales pesados. El uso de respuestas a diferentes niveles de organización biológica, desde el nivel molecular hasta el celular, origina información relevante sobre las condiciones del organismo en estudio y provee los datos necesarios para el entendimiento del modo de acción, intoxicación y depuración de xenobióticos.

El mejillón verde P. viridis es una especie abundante en las costas del estado Sucre, la cual habita en bancos naturales, particularmente en las zonas de Chacopata-Guayacán y Río Caribe. Adicionalmente, un sector interesado en el cultivo suspendido de la especie ha iniciado pequeños sembrados experimentales en la franja costera sur del golfo de Cariaco, especialmente en la localidad de San Antonio del Golfo. En tal motivo, en esta investigación se contrastan diversos biomarcadores, que incluyen respuestas inmunológicas, bioquímicas y celulares, en P. viridis recolectado en las costas del estado Sucre con el fin de establecer la salud de los organismos y su relación con la carga corporal de metales pesados.

Área de estudio

Los ejemplares del mejillón verde P. viridis fueron recolectados en tres localidades costeras del estado Sucre, situadas al noreste de Venezuela (fig. 1): Chacopata-Guayacán (CG, 10°43'25" N, 64°52'6" O), en la región norte de la península de Araya; Río Caribe (RC, 10°42'34" N, 63°06'54" O), al noreste de la península de Paria; y San Antonio del Golfo (SAG, 10°27'5" N, 63°46'23" O), en el sureste del Golfo de Cariaco. Las zonas CG y RC constituyen bancos naturales extensamente explotables de la especie, y SAG es un área de cultivo de mejillones de baja escala.

La recolección de los bivalvos se realizó manualmente mediante buceo a profundidades de 1 a 2 m. En cada estación de muestreo, se seleccionaron entre 60 y 80 organismos sexualmente maduros (en estadio II, no desovados) (Sreenivasan et al. 1989), sin distinción de sexo y con tallas entre 7.5 y 9.2 cm. Los animales fueron recolectados entre febrero y marzo en condiciones ambientales homogéneas: temperatura, 26.50-27.01 °C; salinidad, 36.0-37.0; y pH, 7.55-8.10. Antes de los análisis, los ejemplares fueron trasportados al laboratorio y mantenidos durante tres días en acuarios bajo condiciones controladas (temperatura, 25 ± 2°C; salinidad, 36 ± 0.1; pH, 7.7 ± 0.2; oxigenación, 90-95%) y alimentados ad libitum con la microalga Chaetoceros gracilis.

Determinación de metales pesados

La determinación de metales pesados se realizó con un espectrofotómetro de emisión óptica con fuente de plasma de inducción (ICP-OES, por sus siglas en inglés), marca Perkin Elmer modelo 5300. Las muestras de tejido blando fueron deshidratadas a 60 °C durante 3 días, pesadas y predigeridas en 10 mL de ácido nítrico concentrado a temperatura ambiente durante 24 h. Seguidamente, las muestras fueron digeridas a 60 °C por 4 h y luego a 80 °C por 2 h. Se dejaron enfriar y se adicionaron 10 mL de agua desionizada; la solución se filtró a través de papel Whatman No. 42 y se completó con agua desionizada hasta un volumen final de 25 mL.

Para la determinación de los metales con el ICP-OES, las siguientes condiciones fueron utilizadas: flujo de gas exterior de argón de 15 L min^-1, flujo de gas al nebulizador de 0.5 L min^-1, flujo de gas auxiliar de 0.2 L min^-1, radio frecuencia de 1300 W y flujo de la bomba peristáltica de 1.5 L min^-1. Cada metal se midió a una longitud de onda característica y sus límites de detección se determinaron por medio de una curva de calibración (Meier y Zünd 1993). Para cada metal, la longitud de onda (nm) y el límite de detección (μg g^-1) fueron, respectivamente, 206,200 y 0.10 para Zn; 327,393 y 0.05 para Cu; 228,802 y 0.04 para Cd; 267,716 y 0.05 para Cr; 238,204 y 0.08 para Fe; y 220,353 y 0.01 para Pb.

Extracción de la hemolinfa

Viabilidad celular y número total de hemocitos

Estos parámetros fueron determinados por tinción diferencial con eosina amarilla (0.1%) en agua de mar filtrada y estéril. Se tomaron 100 μL de la suspensión final de hemocitos y se mezclaron con un volumen igual del colorante; se resuspendió la mezcla y luego se tomó una alícuota de 10 μL para hacer el conteo celular en un hemocitómetro por microscopía de luz (magnificación de 400 x) (Goven et al. 1996).

Fagocitosis

El número total de hemocitos se ajustó a ∼2 x 10⁶ células mL^-1. Se empleó la levadura Saccharomyces cerevisiae, inactivada por calor (5 mg mL^-1 en agua de mar estéril), como antígeno (Zapata-Vívenes et al. 2005). Se tomaron 200 μL de las levaduras y se diluyeron en 3 mL de agua de mar filtrada. Se mezclaron suavemente 100 μL de la suspensión de hemocitos con un volumen igual de la suspensión final de levaduras y luego se centrifugaron a 1000 g por 5 min. Las muestras centrifugadas se incubaron por un periodo de 24 h a 8 °C. Al precipitado celular se le añadieron 100 μL de azul de tripano (0.4% m/v). Una alícuota de 10 μL se colocó en un hemocitómetro para conteo en microscopio de luz (400 x de magnificación).

Lisozimas

El protocolo empleado para evaluar la actividad de la lisozima en la glándula digestiva de P. viridis fue basado en la lisis de la pared celular de Micrococcus lysodeikticus, empleando lisoplacas de agarosa (Goven et al. 1994). El gel se preparó con 67 mmol L^-1 de una solución amortiguadora de fosfato de potasio (KH₂PO₄, pH 6.0), agarosa (tipo II) al 1%, cloruro de sodio (NaCl) al 0.1% y 0.4 mg mL^-1 de M. lysodeikticus. Se extrajeron las glándulas digestivas de 12 bivalvos de cada localidad y, seguidamente, se homogeneizaron en 100 mmol L^-1 de una solución amortiguadora de KH₂PO₄ (pH 6.24) a 4 °C (20% m/v). El homogeneizado resultante se centrifugó a 2000 g por 10 min, y el sobrenadante obtenido se empleó como fuente de lisozima. Un volumen equivalente a 40 μL del extracto se sembró, bajo condiciones estériles, en cada orificio de la lisoplaca. Las lisoplacas fueron incubadas a 37 °C en una estufa durante 48 h. Los diámetros de los halos de inhibición fueron medidos y contrastados con lisozima de clara de huevo (HEL) estándar.

Estabilidad lisosomal

La hemolinfa recolectada se transfirió a un tubo siliconizado y se conservó por un máximo de 3-5 min. Se transfirieron 40 μL del contenido del tubo a la lámina y se mezclaron con 40 μL de rojo neutro disuelto en dimetil sulfóxido en la lámina por 15 min en cámara húmeda y oscura (Lowe et al. 1992). Las observaciones se realizaron con un microscopio de luz (magnificación de 400 x) durante 15, 30, 45, 60, 90 y 120 min, y se cuantificó el porcentaje de células dañadas.

Peroxidación de lípidos

La lipoperoxidación se determinó por el revelado de sustancias que reaccionan al ácido tiobarbitúrico (TBARS) (Ohkawa et al. 1979). Las glándulas digestivas fueron homogeneizadas en 50 mmol L^-1 de imidazol-HCl a 15 °C y centrifugadas a 1000 g durante 20 min. El homogeneizado se incubó durante 10 min a 37 °C con agitación constante, y posteriormente se le adicionó ácido tricloroacético al 12.5%, 0.8 mol L^-1 de HCl y ácido tiobarbitúrico al 1% en un baño de agua a 90 °C con agitación constante durante 30 min. Cada muestra fue colocada en baño de hielo durante 10 min y luego centrifugada a 1500 g durante 10 min a 4 °C. La absorbancia de las muestras se midió a 535 nm. La concentración de TBARS se calculó con 1,1,3,3-tetraetoxipropano como estándar. Los valores se expresaron en nanomoles de TBARS por miligramos de proteínas.

Grupos sulfihidrilos

Para la determinación de los grupos tioles (-SH), se aplicó el método desarrollado por Ellman (1958), fundamentado en la cuantificación de tioles libres o asociados a proteínas mediante la reacción del ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB), hasta formar el anión 2-nitro-5-benzoato. Para ello, se preparó una solución amortiguadora compuesta por Tris HCl-EDTA 30 mmol L^-1 y se ajustó el pH a 8.2. A cada tubo de ensayo se le adicionaron 50 μL de extracto, 150 μL de la solución amortiguadora, 800 μL de metanol y 50 μL de DTNB, luego se mezcló y se dejó reposar por 5 min a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo se centrifugaron las muestras a 1000 g durante 5 min. Finalmente, se tomó el sobrenadante para medir la absorbancia a 412 nm. La concentración de -SH se calculó por medio de una curva de calibración preparada con glutationa reducida (GSH) como estándar.

La cuantificación de proteínas totales se realizó siguiendo la metodología propuesta por Lowry et al. (1951), usando como estándar albúmina de suero bovino.

Análisis estadísticos

Se empleó un análisis de varianza sencillo con réplica, cumpliéndose todos los supuestos. Se aplicó una prueba de contraste múltiple de Tukey (Sokal y Rohlf 1981). En adición, se estimó la asociación entre los parámetros moleculares y celulares y el contenido corporal de metales pesados mediante un análisis de correlación de Pearson.

RESULTADOS

Los niveles de los metales esenciales presentaron variaciones entre los organismos recolectados. Los mayores niveles promedio de Cu y Fe se observaron en los ejemplares provenientes de las balsas de cultivos de SAG, mientras que los niveles de Zn y Cr se incrementaron en los mejillones de CG. Del mismo modo, las concentraciones de los metales no esenciales como Cd y Pb fueron superiores en los ejemplares recolectados en las costas de CG (tabla 1).

La viabilidad celular en hemocitos no presentó variación estadística entre los organismos recolectados entre localidades (tabla 2), con un intervalo de 70% a 100% y promedios que oscilaron entre 78.50% y 89.40%. Con respecto al número total de hemocitos los menores registros se observaron en los mejillones de CG y RC en comparación con los de SAG (2.02 x 10⁵ células mL^-1). El porcentaje de fagocitos fue significativamente mayor en los organismos provenientes de CG y RC con respecto a la estación referencial (SAG). Adicionalmente, una ligera elevación en la actividad de la lisozima en la glándula digestiva fue observada en los organismos de RC, pero sin ninguna significanción estadística.

Los biomarcadores moleculares examinados muestran concentraciones elevadas de proteínas totales y grupos -SH en los mejillones cultivados en SAG, lo que demuestra su estado nutricional y sus niveles de antioxidantes (tioles). Contrariamente, se observó que los niveles de sustancias que reaccionan con el TBARS (un marcador de daño oxidativo) se incrementaron en los mejillones de CG y RC (tabla 3).

Los siguientes coeficientes de correlación entre metales pesados y marcadores biológicos cuantificados presentaron asociaciones ligeramente débiles: Cu/viabilidad celular (-0.60), Zn/grupos tioles (+0.51), Cd/grupos tioles (-0.45), Cr/TBARS (+0.58) y Cd/desestabilización lisosomal (-0.40).

DISCUSIÓN

Los valores de Cu y Fe encontrados en P. viridis en SAG posiblemente se encuentran asociados a la disponibilidad del metal en el área de cultivo, aunado a los requerimientos metabólicos del organismo para mantener su tasa de crecimiento, reproducción y desove en siembras de suspensión. Concentraciones similares de Cu y Fe han sido señaladas para Perna perna, una especie afín cultivada en el golfo de Cariaco (Castillo et al. 2005). A pesar de que el Cu y Fe son elementos esenciales eficientemente regulados, existen evidencias experimentales que demuestran que un considerable número de especies de bivalvos presentan sensibilidad a bajas concentraciones (Sze y Lee 2000, Zapata-Vívenes y Nusetti 2007, Aanand et al. 2010), ya que permiten la formación de especies reactivas del oxígeno mediante la reacción de Fenton y Haber-Weiss (Fridovich 1998). Estos radicales libres son responsables de alteraciones moleculares y estructurales de macromoléculas de importancia biológica que incluyen la peroxidación de lípidos de membrana, degradación de proteínas y oxidación de bases nitrogenadas (Winston y Di Giülio 1991).

El aumento en las concentraciones de Zn, Cr y Cd en P. viridis de CG posiblemente se deben a las actividades humanas y no a causas naturales. La mayoría del Zn es adicionado durante actividades industriales como la minería, la combustión de carbón y residuos, y el procesado del acero. En algunas especies parece existir una relación entre los valores de Zn y el tamaño del animal, lo que puede significar requerimientos metabólicos diferentes entre individuos jóvenes y adultos (Kennish 1997).

Las concentraciones de Cd y Cr encontradas en el tejido blando de P. viridis en las localidades evaluadas sugieren que tales organismos poseen mecanismos eficaces para evitar toxicidad y letalidad. Se conoce que la toxicidad del Cr y Cd puede ser alcanzada a concentraciones relativamente bajas. En ensayos estáticos se ha determinado que la concentración letal media de Cr y Cd para P. viridis, en el agua, es de 2.27 μg L^-1 (1.94-2.70 μg L^-1) a las 96 h (Vijayavel et al. 2007) y 6.24 μg L^-1 a las 48 h (Meena y Balakrishnan 1993), respectivamente. Existen numerosas referencias que establecen una relación estrecha entre los niveles de metales y el estrés oxidativo, que conlleva a consecuencias moleculares graves como daños directos sobre el ADN y posterior perturbación de la expresión genética (Roling et al. 2006). De igual manera, se ha demostrado que niveles subletales de Cd pueden alterar las funciones de enzimas relacionadas con el metabolismo de carbohidratos, la respiración mitocondrial y la actividad antioxidante (Nusetti et al. 2010) y la tolerancia a la anoxia (Zapata-Vívenes y Nusetti 2007), así como causar cambios negativos en la tasa de respiración y crecimiento de P. viridis (Narváez et al. 2005), limitando su supervivencia en el ambiente.

Los menores registros en el número total de hemocitos fueron observados en los mejillones de CG y RC en comparación con los de SAG. A pesar de que no se han planteado intervalos referenciales para los parámetros que discriminen a organismos sanos de contaminados, se tiene información que una gran variedad de agentes contaminantes pueden modular las funciones normales del sistema inmunológico en moluscos bivalvos (Pipe et al. 1999, Livingstone et al. 2000, Nusetti et al. 2004). Se han observado algunos cambios en los parámetros inmunológicos en el mejillón Mytilus edulis trasplantado a una zona impactada por petróleo crudo (Dyrynda et al. 2000).

No se observaron variaciones en la actividad de la lisozima en los mejillones entre las distintas localidades, lo que demuestra la efectividad de esta respuesta humoral a pesar de las concentraciones de metales acumulados. La actividad de la lisozima ha sido usada como biomarcador en inmunoensayos de biotoxicidad de xenobióticos. Su acción bacteriolítica ha sido ampliamente examinada en moluscos expuestos a concentraciones subletales de diversos compuestos xenobióticos, incluyendo metales pesados. Muchos autores han encontrado efectos tóxicos agudos de distintos metales (Cu, Zn, Hg) sobre la actividad de la enzima en mejillones (Pipe y Coles 1995, Pipe et al. 1999).

Los organismos de CG presentaron los mayores promedios de TBARS por miligramo de proteínas. Estos valores están relacionados con la formación de especies reactivas del oxígeno, tales como el anión superóxido y el radical hidroxilo, que pueden perturbar la eficiencia antioxidante y causar alteraciones oxidativas (peroxidación) de las membranas biológicas. Diversas investigaciones han demostrado el papel de estos radicales libres como intermediarios en la toxicidad de contaminantes orgánicos en bivalvos marinos: M. edulis (Livingstone et al. 2000), Mytilus galloprovincialis (Livingstone 2001) y P. viridis (Cheung et al. 2001, 2002). Las consecuencias citotóxicas pueden ser evidenciadas por inactivación enzimática, lipoperoxidación de membranas celulares, deterioro del ADN y muerte celular; tales respuestas pueden ser inducidas por metales pesados (Rand y Petrocelli 1985).

Las concentraciones de grupos sulfhidrilos (-SH) en organismos provenientes de CG y RC posiblemente correspondan a un desajuste de las respuestas moleculares en compensación antioxidante contra la producción de intermediarios reactivos, experimentada por el ingreso y la acumulación excesiva de metales pesados en los organismos que habitan dicha zona. La determinación -SH totales ha sido utilizada como un marcador de contaminación por metales pesados en distintos sistemas biológicos (Hernández 2006). Se han registrado incrementos en la concentración de GSH como respuesta antioxidante en P. viridis sometida a bifenilos policlorados, un fuerte inductor de daño oxidativo (Cheung et al. 2002).

El tiempo en el cual se observa daño en el 50% de las células circundantes no pudo ser alcanzado durante 120 min, lo que sugiere un buen estado de salud aparente, al menos en los mejillones recolectados en RC y SAG. El mayor porcentaje de células con lisosomas incapaces de retener el rojo neutro fue observado en los organismos recolectados en CG. Se ha demostrado que mejillones que habitan áreas potencialmente impactadas presentan frecuentes anormalidades y un menor tiempo de retención de rojo neutro en sus compartimientos lisosomales. En áreas con severa contaminación antropogénica, los lisosomas de los hemocitos evidencian daños de sus membranas después de 30 a 60 min de la acción del colorante (Lowe y Pipe 1994, Harding et al. 2004).

En estudios de campo, Talet et al. (2009) mostraron un decrecimiento en retención del rojo neutro en lisosomas de hemocitos en M. galloprovincialis trasplantados a zonas con altos niveles de polución orgánica. Esta misma respuesta ha sido correlacionada con altos niveles de exposición de hidrocarburos policíclicos en M. galloprovincialis y P. perna (Francione et al. 2007, Pereira et al. 2007), P. viridis (Nicholson y Szefer 2003), y ensayos estáticos con Cu (Nicholson 2003). El porcentaje de hemocitos con lisosomas dañados y su relación con organismos con elevados niveles de Cd, aunque es débil, permite inferir sobre la calidad ambiental en esta localidad costera y refleja una señal de alerta temprana de contaminación.

Esta investigación sugiere el uso de biomarcadores a nivel celular o bioquímico en organismos biomonitores para complementar los estudios ambientales y así revelar cambios inducidos por xenobióticos metálicos en la fisiología de los organismos que habitan ecosistemas marino-costeros. Las concentraciones de metales pesados (en especial Cd, Cr y Pb) acumuladas en los tejidos blandos de los mejillones de CG, junto con la reducida estabilidad lisosomal en hemocitos, permiten evidenciar la disponibilidad de tales elementos en las localidades de muestreo y sus efectos celulares.

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