Primeras secuencias de ADNr de Archaea en aguas costeras de Argentina: Inesperada caracterización por PCR con cebadores para eucariotas

First archaeal rDNA sequences from Argentine coastal waters: Unexpected PCR characterization using eukaryotic primers

F Covacevich¹*, RI Silva², AC Cumino¹, G Caló¹, RM Negri², GL Salerno¹

¹ Centro de Estudios de Biodiversidad y Biotecnología (CEBB), Centro de Investigaciones Biológicas (CIB), Fundación para las Investigaciones Biológicas Aplicadas (FIBA), Vieytes 3103, 7600 Mar del Plata, Argentina. * Corresponding author. E-mail: fcovacevich@fiba.org.ar

² Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo Pesquero (INIDEP), Mar del Plata, Argentina.

Received March 2011,
received in revised form January 2012,
accepted February 2012.

RESUMEN

Muchos miembros de Archaea, un grupo de microroganismos descritos hace aproximadamente 30 años, colonizan ambientes extremos. Sin embargo, las investigaciones más recientes han demostrado que las arqueas también son abundantes componentes del plankton marino, siendo algunos grupos de Archaea componentes fundamentales de los ecosistemas marinos debido a su rol clave en los ciclos biogeoquímicos. Aunque la ubiquidad de las arqueas ha sido bien documentada, hasta el momento no hay registros de la presencia de representantes de este grupo en el mar Argentino. En un estudio de biodiversidad orientado a determinar secuencias de picoplancton utilizando cebadores universales para eucariotas, se encontraron secuencias de ADNr de Archaea en muestras recolectadas durante la primavera en una estación fija de monitorización (EPEA) en el mar Argentino. A partir de ADN ambiental y mediante el uso de la metodología de PCR, se obtuvieron dos fragmentos de aproximadamente 1700 y 1460 pb, que fueron separados y visualizados después de electroforesis en geles de agarosa y, luego, purificados, clonados y secuenciados. El análisis de BLAST mostró que las secuencias de tamaño superior correspondían a organismos eucariotas y las secuencias de menor tamaño pertenecían a Archaea. El análisis filogenético mostró que las secuencias de Archaea se agrupan con Euryarchaeota marina grupo II, caracterizado como un linaje metanógeno. Éste es el primer reporte de la presencia de secuencias de Euryarchaeota grupo II en aguas del mar Argentino. El hecho de que las secuencias de Archaea hayan sido amplificadas con cebadores no específicos para este grupo podría sugerir una inesperada abundancia de estos organismos durante los inicios de primavera en el mar Argentino.

Palabras clave: Euryarchaeota, mar Argentino, ADNr ambiental, metodología de la PCR, diseño de cebadores.

ABSTRACT

Key words: Euryarchaeota, Argentine Sea, environmental rDNA, PCR methodology, primer design.

Introducción

La diversidad microbiana es claramente un tema de gran importancia e interés. En las últimas décadas, los descubrimientos más sorprendentes de la biodiversidad surgieron de estudios sobre la distribución de las comunidades microbianas marinas. Los ecosistemas marinos continuamente están sujetos a oscilaciones en las condiciones ambientales. Es ampliamente reconocido que el cambio climático y la biodiversidad están interconectados (Bowland 2006). Debido a que se espera que en los próximos siglos el calentamiento global tenga una influencia significativa en el ciclo hidrológico y, por lo tanto, en la composición de especies, es urgente realizar el análisis de la biodiversidad actual. Si bien en las últimas décadas el conocimiento y los reportes de esta temática han aumentado, la introducción de análisis moleculares y de metagenómica ha abierto nuevos caminos en la comprensión de la diversidad microbiana marina. Mediante el uso de estas herramientas, se ha establecido la ubicua presencia de nuevos linajes, sin representantes en cultivos, para los tres niveles de la vida: Bacteria (Giovannoni et al. 1990), Archaea (Delong 1992, Fuhrman et al. 1992) y, recientemente, Eukaryota (Díez et al. 2001, López-García etal. 2001a, Massana et al. 2002, Romari y Vaulot 2004, Groisillier et al. 2006, Lovejoy et al. 2006).

Las arqueas son organismos microscópicos unicelulares procariotas que constituyen un grupo monofilético independiente reconocido en 1977. Aunque en un principio se creía que se limitaban a los hábitats extremos anaerobios, hipertermales, y altamente salinos, también fueron encontradas tanto en ambientes marinos como de agua dulce (DeLong 1992; Fuhrman et al. 1992; Massana et al. 1997, 1998, 2000; Murray et al. 1999; Karner et al. 2001; Auguet y Casamayor 2008). De este modo, se reconoce que las poblaciones marinas de Archaea son diversas, complejas y ubicuas (Danovaro 2010). En la actualidad existe evidencia creciente de que las arqueas marinas realizan una importante contribución a los ciclos biogeoquímicos del nitrógeno y del carbono (Bartossek et al. 2010).

A partir de la filogenia basada en secuencias de ADN ribosomal (ADNr) 16S de organismos cultivados, las arqueas marinas están distribuidas filogenéticamente en cuatro grupos taxonómicos principales: el grupo Crenarchaeota; el grupo marino I; y tres grupos de Euryarchaeota, grupo II, III y IV (Galand et al. 2009). Los miembros del grupo marino I cumplen un papel fundamental en los ciclos biogeoquímicos, y son componentes fundamentales del ecosistema marino. Aunque el grupo Crenarchaeota consiste principalmente en especies termófilas, se han secuenciado completamente los genomas de dos cepas que no son termófilas: Cenarchaeum symbiosum y Nitrosopumilus maritimus (Preston et al. 1996, Kónneke etal. 2005, Bartossek et al. 2010). Aunque las arqueas del grupo II de los Euryarchaeota planctónicos tienen metabolismos más variados (de ahí el nombre "eury-", que significa variable), la mayoría de los estudios bioquímicos se han centrado en la producción de metano, una propiedad única de algunas arqueas (incluyendo las Halobacteriales, Thermoplasmales, Thermococcales, Sulfolobales, Pyrodictia-les, Archaeoglobus y Methanobacteriales). Si bien los representantes del grupo III se limitan a aguas profundas, también han sido encontrados debajo de la zona fótica acuática (Galand et al. 2009). El grupo IV fue descubierto por Rodríguez-Valera et al. (1979) y las secuencias de sus miembros fueron claramente distintos de todos los planctónicos conocidos hasta el momento (López García et al. 2001a).

Los análisis de secuencias de ADNr a partir de muestras ambientales han revelado que las arqueas son ubicuas y mucho más abundantes de lo que se suponía (Stein y Simon 1996, Karner et al. 2001, DeLong 2003). Las técnicas independientes de cultivo basadas en el análisis de ADNr 16S demostraron la existencia de Archaea en el mar abierto, en sedimentos marinos, en suelos y en sedimentos de lagos de agua dulce (Massana et al. 2000, Schleper et al. 2005, Galand et al. 2009, Bartossek et al. 2010). Se ha demostrado que en particular, las arqueas marinas habitan aguas costeras, aguas templadas de alta mar así como aguas frías de todo el mundo (DeLong 1992, Fuhrman et al. 1992, Massana et al. 1997, Galand et al. 2010). Karner et al. (2001) encontraron que las crenarqueotas pelágicas del giro del Pacífico Norte comprenden más del 30% de las células microbianas totales encontradas entre los 200 a 5000 m. Herndl et al. (2005) estimaron que, en la profundidad de 100 m, Euryarcheota contribuye con alrededor del 17% de la abundancia de picoplancton del mar del Atlántico Norte, mientras que la contribución de Crenarchaeota fue de alrededor del 18.5%. Los cebadores usados para detectar secuencias de Archaea por la metodología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés:polymerase chain reaction) se conocen como "universales" y han sido diseñados o bien para amplificar todos los genes ADNr 16S de procariotas (DasSarma y Fleischmann 1995, Reysenbach y Pace 1995, Vetriani et al. 1999, Baker et al. 2003, http://bioinfo.unice.fr/454/VC/archaea_primers_sorted_by_Fsequences.html) o para la detección de determinados taxa (Baker et al. 2003). López-García et al. (2001a, 2001b) encontraron secuencias de Euryarchaeota pertenecientes a los grupos marinos II y III en el agua del mar Antártico Polar diseñando y utilizando diversos cebadores para la amplificación del ADNr 16S de dicho grupo.

Según nuestro conocimiento, no existen registros sobre la detección de Archaea en el océano Atlántico sudoccidental. En este estudio, se informa la presencia de secuencias de ADNr de Archaea detectadas en muestras de agua superficial del mar Argentino, y se constituye el inicio de estudios que se deberían continuar para entender la contribución de los procariotas a los ciclos biogeoquímicos de los ecosistemas marinos.

Recolección de las muestras

Las muestras de agua fueron recolectadas durante campañas mensuales realizadas a bordo del B/I Capitán Cánepa (INIDEP). Las muestras de agua superficial se recolectaron en septiembre, octubre y noviembre en la Estación Permanente de Estudios Ambientales (EPEA) en el mar Argentino (38°28' S, 57°41' O; 27 millas náuticas al sur de Mar del Plata, Argentina). Las características ambientales del sitio de muestreo (radiación fotosintéticamente activa, temperatura y salinidad) fueron descritas por Silva et al. (2009). Las muestras de agua (2.5 L) fueron recolectadas de la superficie, prefiltradas a través de filtro con tamaño de poro de 25 μm para eliminar los componentes del microplancton, pasadas a través de una membrana de policarbonato de poro de 3 μm (Nuclepore) para eliminar los componentes del nanoplanc-ton, y finalmente filtrada a través de un filtro de membrana de poro de 0.2 μm (Durapore). Los filtros fueron transferidos a tubos aptos para congelación (crioviales), congelados inmediatamente en nitrógeno líquido y almacenados a -80 °C hasta la extracción de ácidos nucleicos.

Extracción de ácidos nucleicos

El ADN genómico fue extraído a partir de las muestras de agua de mar (cuatro submuestras en cada tiempo de muestreo) de acuerdo con protocolos estándares (Sambrook y Russell 2001). La extracción de ácidos nucleicos se inició con la adición de lisozima (1 mg mL^-1) a la unidad de filtro y la incubación a 37 °C durante 30 min. Posteriormente se añadieron proteinasa K (0.5 mg mL^-1) y dodecil sulfato sódico (SDS, 1%), y el filtro fue incubado durante 2 h a 55 °C. El lisado se recuperó del filtro, que a su vez fue lavado con 1 mL de solución tamponada de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8; 40 mM EDTA, pH 8; sacarosa 0.75 M; agua libre de nucleasas) con lisozima (1 mg mL^-1). Todas las centrifugaciones se realizaron a 13,000 rpm y a 4 °C. Después de la centrifugación durante 7 min, la fase superior se transfirió a un tubo limpio. Los lisados fueron extraídos dos veces con un volumen igual de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1; pH 8) y una vez con cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Después de eliminar el fenol residual por centrifugación, la fase acuosa se transfirió a un tubo de 1.5 mL con 750 μL de isopropanol frío y 1/10 volumen de acetato de sodio (0.3 M de concentración final, pH 5.2). Los tubos se colocaron en un congelador a -20 °C durante la noche. Después de una centrifugación durante 30 min, el sobrenadante fue eliminado y el precipitado de ADN fue lavado con 200 μL de etanol al 70% frío (conservado a -20 °C). El precipitado de ADN fue secado y resuspendido en 50 μL de agua PCR y almacenado a -20 °C hasta su uso. La concentración de ADN obtenida se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm.

Amplificación por PCR, clonado y secuenciación

El ADN extraído se utilizó como molde en las reacciones de PCR con cebadores específicos para eucariotas (ADN ribosomal (ADNr) 18S), EukA 5'-AACCTGGTTGATCCT-GCCAGT-3' y EukB 5'-TGATCCTTCTGCAGGTTCACC-TAC-3' (Medlin et al. 1988). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: desnaturalización inicial del ADN a 94 °C durante 3 min, seguido por 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 45 s, hibridación a 55 °C durante 1 min, extensión a 72 °C durante 3 min, y una elongación final a 72 °C durante 10 min. El volumen de reacción de 25 μL contenía 50 ng de ADN y 5 pmol de cada cebador. Luego de la amplificación, los productos de PCR fueron analizados por electro-foresis en gel de agarosa al 0.8% y los fragmentos de ADN se visualizaron con bromuro de etidio. El ADN se extrajo del gel de agarosa utilizando un kit de extracción QIAGEN Min-Elute Gel. Los productos de PCR purificados fueron ligados al vector pGemTeasy (Promega). El plásmido recombinante se introdujo en células competente de Escherichia coli DH5a, que fueron crecidas en medio LB a 37 °C durante 20 min. Luego, el cultivo fue sembrado homogéneamente en medio sólido LB/ampicilina/IPTG X-Gal (1 mL de 100 mg mL^-1 ampicilina, 0.12 g isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) en 5 mL agua deionizada; 0.10 g 5-bromo-4-chloro-3-indoly--D-galactoside (X-gal) en 2 mL N,N-dimethylfor-mamida) con un asa de Dygraski. Veinte colonias de cada muestra (un total de 100 colonias positivas blancas) fueron cultivadas por separado (37 °C, durante la noche) en medio LB con ampicilina. La presencia de insertos de ADNr fue confirmada por PCR a partir de cada colonia, utilizando los mismos cebadores y las condiciones de amplificación especificadas anteriormente. Los productos de PCR fueron digeridos con la endonucleasa de restricción HaeIII. Todas las digestiones se realizaron de forma independiente y se realizó en 15 μL de volumen final con 3 μL de producto de PCR, solución tamponada 10X y 3 unidades de endonucleasa de restricción. La solución se incubó a 37 °C durante 1 h. Las muestras digeridas fueron sometidas a electroforesis (80 V, 3 h) en geles de agarosa (2.5%) (Meta Phor, Cambrex Bio Science Rockland Inc., Maine, EUA), que fueron teñidos con bromuro de etidio y los fragmentos de restricción polimórficos (RFLP) resultantes fueron visualizados por transiluminación UV. El tamaño de los insertos fue confirmado por digestión del plásmido con la enzima de restricción EcoR1 (Promega, Madison, Wisconsin, EUA). Se secuenciaron los insertos de 98 clones y 20 de ellos resultaron ser una secuencia ADNr 16S de Archaea (Macrogen, Corea del Sur), que fue depositada en el GenBank (HQ541865 no cultivada).

Las comparaciones de secuencias nucleotídicas de los ADNr se realizaron utilizando las bases de datos públicas disponibles del National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Los alineamientos de las secuencias se realizaron utilizando el software CLUSTAL W. Los árboles filogenéticos fueron evaluados estadísticamente con el análisis de bootstrap no paramétrico (número de repeticiones = 1000). La representación gráfica del árbol filogenético se realizó utilizando el software MEGA4 (Tamura et al. 2007). Los análisis de RNAr se hicieron primeramente con la base de datos SILVA (http://www.arb-silva.de), y luego se predijeron las estructuras secundarias utilizando LocARNA, herramientas para RNA de Freiburg (http://rna.informatik.uni-freiburg.de:8080/LocARNA.jsp). LocARNA permite realizar el alineamiento y plegado simultáneo al estilo Sankoff, y genera alineamientos de alta calidad que toman en cuenta la similitud estructural (Smith et al. 2010).

Resultados y discusión

En nuestro estudio sobre la diversidad del picofitoplancton en el mar Argentino se utilizó el par de cebadores EukA/ EukB (Medlin et al. 1988) para amplificar por PCR los genes de la subunidad ribosomal menor de eucariotas a partir del ADN extraído de muestras recolectadas durante la primavera en la superficie del mar Argentino. Díez et al. (2001) habían demostrado la especificidad de este par de cebadores EukA/ EukB para la construcción de bibliotecas de clones de eucariotas y la capacidad de estos cebadores para recuperar secuencias de eucariotas filogenéticamente distantes (estramenofilos, alveolados, prasinofíceas, crisomonados, cercomonas y hongos), en aguas superficiales de mares del Atlántico Norte, la Antártida y el Mediterráneo. Por otra parte, los cebadores también fueron utilizados con éxito en estudios posteriores de biodiversidad de picoeucariotas marinos (Groisillier et al. 2006, Guillou et al. 2008, Hoppenrath et al. 2009, Not et al. 2009). El análisis de los productos de amplificación por PCR usando el par EukA/EukB después de la separación por electroforesis en gel de agarosa reveló que en todas las muestras estaba presente un fragmento de ADN del tamaño esperado para eucariotas (1700 pb) y que se visualizaba una banda adicional de 1460 pb sólo en las muestras recogidas en septiembre y octubre (fig. 1a). Alrededor del 66% de las muestras analizadas mostraron la segunda banda inferior. Los dos fragmentos de ADN amplificados se purificaron por separado y se clonaron en células de E. coli (fig. 1b). Los insertos de los clones recolectados en cada mes mostraron el mismo tamaño. Además, la secuenciación de los insertos reveló que las secuencias de los nucleótidos de 1700 pb (bandas superiores) correspondían a organismos eucariotas. En el caso de las muestras recolectadas en septiembre, las secuencias se correspondieron principalmente con secuencias disponibles de estramenofilos (e. g., Bolidomonas sp.) y alveolados (e. g., Laboea sp.). Las secuencias de los nucleótidos de 1700 pb de las muestras recolectadas en octubre coincidieron con las secuencias pertenecientes a los estramenofilos (e. g., Pedinella sp.) y clorófitas prasinofíceas (e. g., Bathycoccus sp.). Las amplificaciones de ADN correspondientes a las muestras recolectadas en noviembre produjeron sólo una banda de alrededor de 1700 pb (fig. 1a) y las secuencias obtenidas coincidieron con las secuencias pertenecientes a los alveolados (e. g., Noctiluca sp.). Sorprendentemente, las secuencias de nucleó-tidos de los insertos de 1460 pb correspondieron a ADNr de Archaea, cuyos patrones de RFLP fueron similares entre sí y diferentes de las secuencias de los eucariotas (fig. 2). Las secuencias de los insertos coincidieron con arqueas marinas no cultivadas, agrupadas con el grupo marino II de Euryarchaeota (fig. 3).

Los alineamientos de las secuencias del ADNr 16S obtenido de Archaea y los cebadores universales EukA/EukB utilizados para la amplificación por PCR del ADNr 18S de eucariotas confirmó que dicho par de cebadores tiene 100% de identidad con fragmentos del ADNr 16S de Archaea obtenido. Los análisis con la base de datos SILVA para ADNr (http://www.arb-silva.de) indicaron que los cebadores EukA y EukB sólo amplificarían un pequeño número de las secuencias disponibles de Archaea (2 de 11,954 secuencias de Archaea). Por lo tanto, el hecho de que una secuencia de Archaea pudo ser recuperada a partir del ADN ambiental con cebadores diseñados para amplificar secuencias de eucariotas sugiere que algunas cepas de Archaea del grupo marino II serían muy abundantes, por lo menos durante septiembre y octubre, lo que evidenciaría en la hibridación una competencia de los cebadores entre las secuencias de Archaea y de eucariotas presentes en el ADN extraído de las muestras recolectadas.

La identificación de secuencias de Archaea nos llevó a analizar los cebadores registrados como específicos para recuperar secuencias de estos organismos. Para ello, se compararon las secuencias de los cebadores EukA y EukB con otros registrados para Archaea y con la secuencia más abundante y completa de Archaea que se obtuvo en este estudio (HQ541865) (tabla 1). Mientras que algunos de los cebadores analizados se alinearon con la secuencia HQ541865 en posiciones más internas que EukA y EukB, otros presentaron escasa o nula complementación con HQ541865. Baker et al. (2003) propusieron dos nuevos pares de oligonucleótidos (A571F 5'-GCYTAAAGSRICCG-TAGC-3'/UA1204R 5'-TTMGGGGCATRCIKACCT-3' y A751F 5'-CCGACGGTGAGRGRYGAA-3'/UA1406R 5'-ACGGGCGGTGWGTRCAA-3') para amplificar secuencias de Crenarchaeote y Euryarchaeota. También Gantner et al. (2011) registraron dos nuevos cebadores para Archaea (340F 5'-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3' y 1000R 5'-GGCCATG-CACYWCYTCTC-3'), que fueron diseñados a partir de 8500 alineamientos de secuencias disponibles de Archaea mediante el uso de la base de datos SILVA. Los autores reportaron que los cebadores diseñados presentaron alta especificidad para Archaea (<1% de amplificación bacterias), que abarca 93% y 97% de las secuencias disponibles para Crenarchaeota y Euryarchaeota, respectivamente. Sin embargo, estos oligonucleótidos tienen un alto nivel de degeneración, lo que podría llevar a amplificar otros genes o dominios que no son objeto de estudio. De los cebadores no degenerados utilizados para la comparación en este estudio (tabla 1), sólo uno alineó con uno de los oligonucleótidos utilizados. El cebador eucariota-específico EukA coincide en parte con el cebador EK4F, diseñado por Robb et al. (1995) y posteriormente también usado por Baker et al. (2003) por presentar alta especificidad para secuencias metanógenas del grupo de Archaea, pero con ningún otro grupo. Sorprendentemente, el cebador EukA tiene cuatro bases más que el EK4F, lo que permitió la recuperación específica de las secuencias de una arquea perteneciente al grupo marino II de Euryarchaeota.

Se ha documentado que los dos principales grupos planctónicos de Archaea (Crenarchaeota y Euryarchaeota) dan cuenta de aproximadamente un tercio de todas las células procariotas que se encuentran en los océanos del mundo (Karner et al. 2001). Secuencias del grupo marino II de Euryarchaeota han sido encontradas tanto en el canal de Santa Bárbara, California, de 0 a 200 m (Massana et al. 1997), así como en las aguas superficiales del Ártico y de la Antártida (Murray et al. 1999, Bano et al. 2004). A pesar de que fueron registrados como más abundantes en las aguas superficiales del Pacífico y del mar de Beaufort, su presencia se registró también en diferentes regiones oceánicas a profundidades de entre 5 y 200 m (Massana et al. 2000, Karner et al. 2001, Herndl et al. 2005, DeLong et al. 2006, Galand et al. 2009). En aguas del Atlántico Sur, sin embargo, la presencia de Archaea no había sido registrada hasta el presente trabajo.

Conclusión

Las secuencias de Euryarchaeota pertenecientes al grupo marino II están ampliamente distribuidas en los océanos de todo el mundo (Stein y Simon 1996, DeLong 2003). Este estudio contribuye a la identificación de la primera secuencia de ADNr 16S correspondiente a una Euryarchaeota del grupo marino II, recolectada en aguas superficiales del mar Argentino. Este grupo de Archaea podría desempeñar un papel importante en los ciclos biogeoquímicos. La forma casual en que se arribó a los resultados reportados pone en evidencia la abundancia relativa de este grupo en ciertos meses del año, y lo improbable que hubiera sido detectarlas utilizando la información disponible para la identificación molecular de Archaea.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado por la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, proyecto PICT 2002 No. 12233), el Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo Pesquero (INIDEP), el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET) y la Fundación para las Investigaciones Biológicas Aplicadas (FIBA).

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