Determinación de la toxicidad de un vertido de petróleo mediante el uso de bioensayos con el pez Solea senegalensis

Evaluation of the toxicity of an oil spill conducted through bioassays using the fish Solea senegalensis

MJ Salamanca^1,2*, N Jiménez-Tenorio^2,3, ML González de Canales³, TA DelValls²

¹ Instituto de Ciencias Marinas de Andalucía, CSIC Polígono Río San Pedro s/n, 11510 Puerto Real (Cádiz), Spain.

³ Departamento de Biología, Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales, Universidad de Cádiz, Polígono Río San Pedro s/n, 11510 Puerto Real (Cádiz), Spain.

Recibido en febrero de 2008.
Aceptado en junio de 2008.

Resumen

Se evaluó la toxicidad que producen los contaminantes presentes en un fuel mediante un bioensayo con el pez plano Solea senegalensis (lenguado). Se expusieron juveniles de esta especie durante 21 días a distintas diluciones realizadas mezclando fuel extraído del buque Prestige y un sedimento procedente de una zona limpia de la Bahía de Cádiz. Tras la exposición se analizaron tres biomarcadores de exposición (actividad enzimática de 7-etoxiresorufin-O-deetilasa [EROD], glutatión S-transferasa [GST] y glutatión reductasa [GR]) junto a la histopatología de dos de los principales órganos diana (branquias e hígado). Los resultados obtenidos mostraron inducciones significativas (P < 0.05) en los biomarcadores de exposición analizados en los peces el día 21 respecto del control del día 0 en los peces. Asimismo, se detectaron lesiones en los dos órganos estudiados. El órgano más afectado fue el hígado. La frecuencia de aparición de lesiones fue mayor en las muestras con mayores concentraciones de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs, por sus siglas en inglés) y metales. Los resultados obtenidos en este trabajo mostraron correlaciones significativas entre las concentraciones de PAHs totales y la actividad enzimática EROD, GST y GR, obteniéndose coeficientes de correlación de R = 0.60 para EROD, R = 0.96 para GST y R = 0.82 para GR.

Palabras clave: bioensayo, biomarcadores, ecotoxicología, fuel, lenguado, sedimento.

The toxicity produced by fuel pollutants was evaluated through bioassays using the Senegalese sole Solea senegalensis. Juveniles were exposed for 21 days to different dilutions obtained by mixing fuel extracted from the Prestige oil tanker and sediment from a clean area of Cádiz Bay. After the exposure period, three biomarkers were analyzed (7-ethoxyresorufin-O-deethylase [EROD], glutathione S-transferase [GST], and glutathione reductase [GR] enzymatic activity), as well as the histopathology of two of the main target organs (gills and liver). Significant (P < 0.05) biomarker inductions were observed in the exposed fish analyzed on day 21 relative to the control group (day zero). Lesions were detected in both organs studied, but the liver was the most affected. The frequency of appearance of the lesions was greater in the samples containing higher concentrations of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and metals. The results showed significant correlations between the total PAH concentrations and GST, GR, and EROD enzymatic activity, with correlation coefficients of R = 0.96 for GST, R = 0.82 for GR, and R = 0.60 for EROD.

Key words: bioassay, biomarkers, ecotoxicology, fuel, sediment, sole.

Introducción

Los bioensayos crónicos, que incorporan respuestas más sensibles que los agudos, se han convertido en una herramienta común para realizar evaluaciones de la calidad de sedimento mediante numerosos biomarcadores. Por ejemplo, la inducción de isoenzimas del citocromo P450 es una respuesta adaptativa que puede utilizarse en muchas especies como alerta temprana de contaminación, por lo que en este estudio se eligió la actividad enzimática 7-etoxiresorufin-O-deetilasa (EROD) como biomarcador de exposición. Se evaluaron también otras enzimas de las distintas fases de detoxificación (glutatión S-transferasa (GST) y glutatión reductasa (GR)) cuya actividad se ve alterada en presencia de contaminantes orgánicos. La actividad enzimática EROD es un mecanismo de defensa de la primera fase del metabolismo de detoxificación que estima la inducción del citocromo P4501A (Reynolds et al. 2003) y cuyo incremento ha sido observado en numerosas especies de peces después de ser expuestos a contaminantes orgánicos, incluyendo los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) (Van der Ost et al. 2003). La GST es una enzima de la segunda fase de detoxificación que, aunque no tiene un papel tan claro en la exposición de contaminantes orgánicos como la actividad EROD, se ha demostrado que es un mecanismo de defensa efectivo contra el daño oxidativo y los productos peroxidativos (George 1994). La GR es una enzima de estrés oxidativo que interviene en la homeostasis de los niveles de glutatión reducido y oxidado en condiciones de estrés oxidativo (Winston y Di Giulio 1991) y cuya inducción se ha observado en peces expuestos a contaminantes orgánicos en numerosos estudios (Van der Ost et al. 2003).

La capacidad de muchos contaminantes de alterar diferentes células, tejidos u órganos ha dado lugar al empleo de técnicas histopatológicas para evaluar los efectos de la contaminación (DelValls 1999, Riba et al. 2005). La histopatología se convierte así en una herramienta válida para el estudio del efecto biológico de los contaminantes en el medioambiente ya que es capaz de detectar y caracterizar los efectos de la exposición a sustancias tóxicas y carcinogénicas (Reynolds et al. 2003) . En este trabajo se usaron juveniles de una especie comercial, Solea senegalensis, para evaluar la toxicidad de los PAHs y otros contaminantes presentes en un fuel en condiciones de laboratorio con un bioensayo en fase sólida. Existen numerosos trabajos (Mariño-Balsa et al. 2003, Evangelista et al. 2005, Fernández et al. 2006b, Morales-Caselles et al. 2007), realizados bajo condiciones de laboratorio y de campo, relacionados con vertidos accidentales de petróleo; sin embargo, se han realizado muy pocos estudios con vertebrados que incluyan inducción de biomarcadores de exposición y daño histopatológico tras una exposición de larga duración a distintas concentraciones de fuel. En este estudio los organismos fueron expuestos durante 21 días a diferentes diluciones de fuel del buque Prestige, realizadas mezclando éste con sedimento recogido en una zona limpia de la Bahía de Cádiz (Riba et al. 2004) . Los parámetros de medida que se estudiaron fueron tres biomarcadores de exposición (actividad EROD, GST y GR) y daño histológico en branquias e hígado, con el fin de evaluar sus respuestas en un pez plano tras la exposición a distintas proporciones de fuel.

Material y métodos

Test de toxicidad

Se seleccionaron juveniles de S. senegalensis con un peso medio de 125 g. Los ejemplares procedían de una planta de cultivos marinos y fueron transportados hasta el laboratorio para su aclimatación durante dos semanas antes del comienzo del experimento. Para el bioensayo se utilizó un sistema de acuarios de 25 L en circuito cerrado, con aireación continua, que contenían la mezcla fuel-sedimento y agua de mar en una proporción 1:4 (v/v). Cada dilución se realizó por triplicado y en cada acuario se dispusieron 10 individuos. Se controlaron los valores de salinidad (35 ± 2), temperatura (19 ± 2°C), pH (8.0-8.5), oxígeno disuelto (>80% de saturación) y amonio (<0.001 mg L^-1) para asegurar que éstos se encontraban en los niveles adecuados para la realización del bioensayo. El fotoperiodo fue el natural (14:10, para el sur de la Península Ibérica a finales de primavera). Los individuos fueron alimentados diariamente con pienso (aproximadamente 0.2 g por pez) "Mar Perla T". La renovación del 33% del agua de los tanques se realizó mediante bombas peristálticas, una o dos veces por semana, para mantener los patrones de calidad.

Biomarcadores medidos

El día 21 de exposición se recogieron seis individuos en cada una de las distintas diluciones para la medición de los biomarcadores de exposición en hígado (EROD, GST y GR) y los biomarcadores de efecto (alteraciones histológicas en branquias e hígado). Al comienzo del experimento también se tomaron muestras para usarlas como control (día cero). Los ejemplares fueron anestesiados con 2-fenoxietanol al 0.1% antes de su disección.

Los hígados extraídos en cada disección fueron divididos en dos para determinar biomarcadores de exposición e histopatologías. Las muestras destinadas a la medida de biomarcadores fueron conservadas a -80°C hasta su análisis. Las muestras fueron homogenizadas con un tampón Trisacetato antes de su análisis, siguiendo la metodología descrita por Lafontaine et al. (2000); posteriormente fueron centrifugadas a 10000 g durante 30 min y a una temperatura de 4°C para la extracción de la fase citosólica. Además de los biomarcadores de exposición nombrados anteriormente, se midieron los contenidos de proteínas totales de cada muestra, con el fin de normalizar los datos obtenidos. La concentración de proteínas fue evaluada utilizando el método descrito por Bradford (1976) utilizando albúnima de suero bovino (Sigma Aldrich) como estándar.

La actividad enzimática EROD se midió siguiendo el protocolo descrito por Gagné y Blaise (1993). Los resultados obtenidos se normalizaron frente a la concentración de proteínas totales, expresando la actividad EROD en ^mol mg^-1 min^-1 de proteínas totales. Las enzimas GST y GR se analizaron siguiendo los protocolos descritos por Martín-Díaz et al. (2004a, b; 2005).

Para el análisis del daño histopatológico, las muestras de órganos diana se fijaron en formol al 10% tamponado con fosfato 0.1 M (pH 7.2) y se montaron en bloques de parafina, para realizar cortes histológicos de 6 a 8 de μm de grosor. Los cortes histológicos se tiñeron con hematoxilina de Harriseosina y hematoxilina de Harris-VOF (Gutiérrez 1967) y se observaron al microscopio para su estudio histopatológico. Las alteraciones histopatológicas fueron evaluadas semicuantitativamente en los peces expuestos a las diferentes diluciones usando la frecuencia de aparición de la lesión en un total de seis individuos en cada dilución (Jiménez-Tenorio et al. 2007). Se calcularon los índices generales de lesión en branquias (IGG) y en hígado (IGL).

Análisis químicos

Al comienzo del experimento se tomaron muestras para los análisis químicos. En las mezclas de sedimento y fuel se analizaron los Σ16PAHs recomendados por la Agencia de Protección Ambiental de los EUA (Keith y Telliard 1979). Resumidamente, la muestra seca fue sujeta a extracción con una mezcla de hexano/acetona en horno microondas, después se cambió el solvente por hexano y se concentró la muestra. Posteriormente la muestra resultante se purificó con alúmina y finalmente se determinó su concentración de PAHs mediante CG/MS, usando material de referencia NRC-CNRC HS-6 para comprobar el procedimiento analítico. Los resultados se expresaron en mg kg^-1 de peso seco.

Para evaluar los metales traza (Ni, V, Cd, Pb, Cr, Co), los sedimentos fueron digeridos como describen Loring y Rantala (1992) y se cuantificaron por espectrometría de absorción atómica de grafito (Perkin-Elmer 4100 ZL) (Cobelo-García et al. 2005). Los resultados se expresaron en mg kg^-1 de peso seco. El procedimiento analítico fue comprobado usando material de referencia MESS-1 NRC y CRM 277 BCR. Todos los resultados mostraron valores de confianza entre 90% y 110%.

Los análisis estadísticos se realizaron con el software SPSS 15.0. Se aplicaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y de Levene para comprobar la normalidad y la homocedasticidad de los datos. Se aplicó un análisis de varianza (ANOVA) para evaluar las diferencias entre los valores de los distintos biomarcadores en los controles y en las diferentes diluciones. Se utilizó la matriz de Pearson para determinar la correlación entre las concentraciones de contaminantes y los biomarcadores medidos.

Resultados

La tabla 1 muestra los resultados resumidos para los contaminantes (PAHs totales e individuales y metales traza expresados en mg kg^-1 de peso seco) que fueron calculados en las diluciones de fuel (0.5%, 2%, 8% y 16%) y el sedimento control (Ca). En el control negativo no se detectaron concentraciones de PAHs (límite de detección 0.1 μg kg^-1), por lo que el contenido de PAHs en las diluciones depende únicamente del fuel, mientras que la concentración de metales pesados se encontró muy por debajo de los valores guías con los que fueron comparados (DelValls et al. 2004).

En general, los biomarcadores de exposición, así como los daños histopatológicos analizados, mostraron una inducción significativa (P < 0.05) respecto al control negativo, con una tendencia creciente conforme aumenta la concentración de fuel (fig. 1). La tabla 2 muestra los resultados obtenidos para la actividad enzimática (EROD, GST y GR) y los índices de lesión calculados a partir de la evaluación semicuantitativa de la frecuencia de aparición de lesiones en hígado y branquias. Los organismos analizados el día cero no presentaron en ningún caso daños histopatológicos y fueron tomados como organismos control. Las lesiones más frecuentes observadas en branquias fueron la descamación de las células epiteliales de las laminillas secundarias, hipertrofia e hiperplasia, extravasación sanguínea en las laminillas secundarias y acortamientos en dichas laminillas (fig. 2a). Las lesiones más frecuentes observadas en hígado son la alteración y vacuolización de los hepatocitos (fig. 2b).

La matriz de correlación de Pearson mostró correlaciones significativas entre las concentraciones de PAHs y los biomarcadores de exposición (tabla 3). Se correlacionaron las concentraciones de PAHs totales con la actividad enzimática EROD, GST y GR, obteniéndose coeficientes de correlación R = 0.60 para EROD (significativo a nivel de 0.05), R = 0.96 para GST (P < 0.05) y R = 0.82 para GR (significativo a nivel de 0.01). La mortalidad registrada a lo largo del experimento osciló entre un 30% para la dilución más pequeña (0.5%) y 50% para la dilución del 16%.

Discusión

Los PAHs individuales predominantes en el fuel son pireno (461 mg kg^-1), fenantreno (347.5 mg kg^-1), naftaleno (317 mg kg^-1), criseno (93.5 mg kg^-1), fluoreno (114.6 mg kg^-1) y acenafteno (59.3 mg kg^-1). Los PAHs de mayor peso molecular tienden a permanecer asociados al sedimento (Mariño-Balsa et al. 2003), mientras que los PAHs de bajo peso molecular (2-4 anillos), predominantes en el fuel de este trabajo, presentan una mayor toxicidad aguda debido a su mayor solubilidad (Fernández et al. 2006a, b). Cabe esperar entonces que una fracción de los PAHs del fuel fuera pasando a la fase acuosa, produciendo la toxicidad observada. Estudios previos realizados por Albaigés y Bayona (2003) revelaron que el naftaleno puede acumularse en la biota y que concentraciones de naftaleno en sedimento superiores a 34.6 mg kg^-1 (en peso seco) pueden producir efectos negativos en los organismos bentónicos. El antraceno, fluoranteno y pireno mostraron toxicidad aguda en larvas y embriones de invertebrados marinos (Pelletier et al. 1997, 2000). En general, la exposición a altas concentraciones de PAHs produce daños en los organismos expuestos, que además bioacumulan en sus tejidos estos contaminantes (Laffon et al. 2006, Soriano-Sanz et al. 2006).

La actividad enzimática evaluada en S. senegalensis presentó un incremento significativo respecto a los controles. Se han observado aumentos en la actividad de estas tres enzimas al exponer distintas especies de peces, crustáceos y bivalvos a PAHs y PCBs (Van de Oost et al. 2003, Martín-Díaz 2004). Martínez-Gómez et al. (2006) obtuvieron resultados similares con los peces Lepidorhombus boscii y Callionymus lyra.

Este estudio confirma el carácter tóxico del fuel vertido por el Prestige, lo cual queda comprobado con los efectos adversos demostrados aquí mediante los biomarcadores de exposición y las alteraciones histopatológicas en S. senegalensis. Se demuestra así que concentraciones altas de hidrocarburos no sólo afectan a organismos de tamaño pequeño, como los anfípodos (Morales-Caselles et al. 2006b), o al éxito de la embriogénesis de distintos organismos acuáticos como equinodermos (Fernández et al. 2006a, b) y bivalvos (Mariño-Balsa et al. 2003), sino que también producen efectos negativos en organismos de mayor tamaño como los peces (Marigómez et al. 2006, Martínez-Gómez et al. 2006), quienes además bioacumulan en sus tejidos parte de los contaminantes presentes en el fuel. Los resultados obtenidos en este trabajo son consistentes con los resultados de bioensayos similares con sedimentos procedentes de la zona impactada (Morales-Caselles et al. 2006a, 2007; Jiménez-Tenorio et al. 2007) utilizando también peces, y con otras simulaciones realizadas con mezclas de sedimento y fuel en laboratorio, sugiriendo también la posible reversibilidad de los efectos adversos observados a nivel celular (biomarcadores de exposición). No obstante, existe más reserva respecto a la reparación de las lesiones en tejidos, por lo que se proponen estudios con periodos de recuperación mayores (Salamanca et al. en prensa).

Agradecimientos

Este trabajo se realizó dentro del proyecto de investigación financiado por el Ministerio de Educación y Ciencia de España VEM2003-20563/INTER y CTM2005-07282-C03-01/TECNO. La primera autora agradece al programa i3p del CSIC su beca predoctoral.

Referencias

Albaigés J, Bayona JM. 2003. La huella del fuel. In: Ensayos sobre el Prestige. Fundación Santiago Rey Fernández-LaTorre, Spain, pp. 80-103.         [ Links ]

Bradford MB. 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.         [ Links ]

Cobelo-García A, Labandeira A, Prego R. 2005. Two opposite cases of metal accumulation in ria sediments: Ferrol and Corme-Laxe (Galicia, NW Iberian Peninsula). Cienc. Mar. 31: 653-659.         [ Links ]

DelValls TA. 1999. La histopatología como componente de un método integrado para evaluación de la calidad ambiental en sistemas litorales. In: Sarasquete C, González de Canales ML, Muñoz-Cueto JA (eds.), Patología, Fisiología y Biotoxicología en especies acuáticas. CSIC, Spain, pp. 77-91.         [ Links ]

DelValls TA, Andrés A, Belzunce MJ, Buceta JL, Casado-Martínez MC, Castro R, Riba I, Viguri JR, Blasco J. 2004. Chemical and ecotoxicological guidelines for managing disposal of dredged material. Trends Anal. Chem. 23: 819-828.         [ Links ]

Evangelista AJA, Nascimiento IA, Pereira SA, Lopes MBNL, Martins LKP, Fillman G. 2005. Assessing the potential toxicity of marine sediments found in petroleum industry areas: A new approach based on responses of postlarval shrimp. Cienc. Mar. 31: 43-55.         [ Links ]

Fernández N, Cesar A, González M, DelValls TA. 2006a. Nivel de contaminación de sedimentos afectados por el vertido del Prestige y sus efectos sobre el desarrollo embrionario del erizo de mar. Cienc. Mar. 32: 421-427.         [ Links ]

Fernández N, Cesar A, Salamanca MJ, DelValls TA. 2006b. Toxicological characterisation of the aqueous soluble phase of the Prestige fuel-oil using the seaurchin embryo bioassay. Ecotoxicology 15: 593-599.         [ Links ]

Gagné F, Blaise C. 1993. Hepatic metallothionein level and mixed function oxidase activity in fingerling rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) after acute exposure to pulp and paper mill effluents. Water Res. 27: 1669-1682.         [ Links ]

George SG. 1994. Enzymology and molecular biology of phase II xenobiotic-conjugating enzymes in fish. In: Malins DC, Ostrander GK (eds.), Aquatic Toxicology, Molecular, Biochemical and Cellular perspectives. Lewis Publishers, CRC press, pp. 37-85.         [ Links ]

Gutiérrez M. 1967. Coloración histológica para ovarios de peces, crustáceos y moluscos. Inv. Pesq. 31: 265-271.         [ Links ]

Jiménez-Tenorio N, Morales-Caselles C, Kalman J, Salamanca MJ, González de Canales ML, Sarasquete C, DelValls TA. 2007. Determining sediment quality for regulatory proposes using fish chronic bioassays. Environ. Int. 33: 474-480.         [ Links ]

Keith LH, Telliard WA. 1979. Priority pollutants. I-A perspective view. Environ. Sci. Technol. 13: 416-423.         [ Links ]

Laffon B, Aldao I, Pérez-Cadahíz B, Pásaro E, Méndez J. 2006. First step in the evaluation of the effects of Prestige oil on the shore environment: Availability, bioaccumulation and DNA damage. Cienc. Mar. 32: 389-399.         [ Links ]

Lafontaine Y, Gagné F, Blaise C, Costan G, Gagnon P, Chan HM. 2000. Biomarkers in zebra mussels (Dreissena polymorpha) for the assessment and monitoring of water quality of the St. Lawrence River (Canada). Aquat. Toxicol. 50: 51-70.         [ Links ]

Loring DH, Rantala RTT. 1992. Methods for the geochemical analyses of marine sediments and suspended particulate matter. Earth-Sci. Rev. 32: 235-283.         [ Links ]

Marigómez I, Soto M, Cancio I, Orbea A, Garmendia L, Cajaraville M. 2006. Cell and tissue biomarkers in mussel, and histopathology in hake and anchovy from Bay of Biscay after the Prestige oil spill (Monitoring Campaign 2003) Mar. Pollut. Bull. 53: 287-304.         [ Links ]

Mariño-Balsa JC, Pérez P, Estévez-Blanco P, Saco-Álvarez L, Fernández E, Beira R. 2003. Evaluación de la toxicidad de sedimento y agua de mar contaminados por el vertido de fuel del Prestige, mediante el uso de bioensayos con las almejas Venerupis pullastra, Tappes decussatus y Venerupis rhomboideus y la microalga Skeletonema costatum. Cienc. Mar. 29: 115-122.         [ Links ]

Martín-Díaz ML. 2004. Determinación de la calidad ambiental de sistemas litorales y de estuario de la Península Ibérica utilizando ensayos de campo y de laboratorio. Ph.D. thesis, Universidad de Cádiz, pp. 153-177.         [ Links ]

Martín-Díaz ML, Blasco J, De Canales ML, Sales D, DelValls TA. 2004a. Bioaccumulation and toxicokinetics of dissolved heavy metals from the Guadalquivir Estuary after the Aznalcóllar mining spill using Ruditapes philippinarum. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 48: 233-241.         [ Links ]

Martín-Díaz ML, Villena-Lincoln A, Bamber S, Blasco J, DelValls TA. 2004b. An integrated approach of biomarker responses using Carcinus maenas: Simulation of the Aznalcóllar mining spill. Chemosphere 58: 615-626.         [ Links ]

Martín-Díaz ML, Tuberty SR, McKenney CL, Sales D, DelValls TA. 2005. Effects of cadmium and zinc on Procambarus clarkii: Simulation of the Aznalcóllar mining spill. Cienc. Mar. 31: 197-202.         [ Links ]

Martínez-Gómez C, Campillo JA, Benedicto J, Fernández B, Valdés J, García I, Sánchez F. 2006. An assessment of the biological effects related to the Prestige oil spill applying biomarkers in demersal fish (Lepidorhombus boscii and Callionymus lyra) from the northem Iberian shelf. Mar. Pollut. Bull. 53: 305-314.         [ Links ]

Morales-Caselles C, Jiménez-Tenorio N, González de Canales ML, Sarasquete C, DelValls TA. 2006a. Ecotoxicity of sediments contaminated by the oil spill associated with the tanker Prestige using juveniles of the fish Sparus aurata. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 51: 652-660.         [ Links ]

Morales-Caselles C, Kalman J, Riba I, DelValls TA. 2006b. Comparing sediment quality in Spanish littoral areas affected by acute (Prestige, 2002) and chronic (Bay of Algeciras) oil spills. Environ. Pollut. 146: 233-240.         [ Links ]

Morales-Caselles C, Jiménez-Tenorio N, Riba I, DelValls TA. 2007. Kinetic of biomarker responses in juveniles of the fish Sparus aurata exposed to contaminated sediments. Environ. Monit. Assess. 131: 211-20.         [ Links ]

Pelletier MC, Burgess RM, Ho KT, Khun A, McKinney RA, Ryba SA. 1997. Phototoxicity of individual polycyclic aromatic hydrocarbons and petroleum to marine invertebrate larvae and juveniles. Environ. Toxicol. Chem. 16: 2190-2199.         [ Links ]

Pelletier MC, Burgess RM, Cantwell MG, Serbst JR, Ho KT, Ryba SA. 2000. Importance of material transfer of the photoreactive polycyclic aromatic hydrocarbon fluoranthene from benthic adult bivalves to their pelagic larvae. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2691-2698.         [ Links ]

Reynolds WJ, Feist SW, Jones GJ, Lyons BP, Sheahan DA, Stentiford GD. 2003. Comparison of biomarker and pathological responses in flounder (Platichthys flesus L.) induced by ingested polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) contamination. Chemosphere 52: 1135-1145.         [ Links ]

Riba I, Casado-Martínez MC, Forja JM, DelValls TA. 2004. Sediment quality on the Atlantic coast of Spain. Environ. Toxicol. Chem. 23: 271-282.         [ Links ]

Riba I, Blasco J, Jiménez-Tenorio N, González de Canales ML, DelValls TA. 2005. Heavy metal bioavailability and effects. II. Histopathology-bioaccumulation relationships caused by mining activities in the Gulf of Cádiz (SW Spain). Chemosphere. 58: 671-682.         [ Links ]

Salamanca MJ, Jiménez-Tenorio N, F-Reguera D, Morales-Caselles C, DelValls TA. An early approach for the evaluation of repair processes in fish after exposure to sediment contaminated by an oil spill. J. Environ. Sci. Heal. A. A43(14).         [ Links ]

Soriano-Sanz JA, Franco-Hernández A, Viñas-Diéguez L, Cambeiro-Cambeiro B, González-Fernández JJ. 2006. Preliminary data on polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in wild mussels from the Cantabrian coast (N Spain) following the Prestige oil spill. Cienc. Mar. 32: 457-463.         [ Links ]

Van der Oost R, Beyer J, Vermeulen NPE. 2003. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment. Environ. Toxicol. Pharmacol. 13: 57-149.         [ Links ]

Winston GW, DiGiulio RT. 1991. Prooxidant and antioxidant mechanisms in aquatic organisms. Aquat. Toxicol. 19: 137-161.         [ Links ]