Evaluación de la calidad del sedimento en puertos españoles mediante un bioensayo con algas verdes

Assessing sediment quality in Spanish ports using a green alga bioassay

C Morales-Caselles ^1,3*, A Rico², F Abbondanzi², T Campisi², A Iacondini², I Riba^1,3, A DelValls³

¹ Instituto de Ciencias Marinas de Andalucía CSIC, 11510 Puerto Real, Cádiz, Spain. *E-mail: carmen.morales@uca.es

³ Cátedra UNESCO/UNITWIN/WiCop. Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales, Universidad de Cádiz, Polígono Río San Pedro s/n, 11510 Puerto Real, Spain.

Recibido en febrero de 2008.
Aceptado en agosto de 2008.

Resumen

En la actualidad las áreas costeras están sometidas a una presión ambiental por parte de las actividades humanas y los puertos son las zonas que probablemente presentan los mayores niveles de contaminantes en sus sedimentos. En el presente estudio se han combinado datos químicos y efectos biológicos para determinar la calidad ambiental de los sedimentos de seis puertos españoles. Se llevó a cabo el análisis de metales traza y contaminantes orgánicos además de un ensayo de toxicidad con la microalga marina Dunaliella tertiolecta. El parámetro toxicológico utilizado fue el EC50, calculado a partir de una exposición a distintas concentraciones de lixiviado de sedimento durante 72 h. El desarrollo de este alga verde puede verse afectado con la presencia ambiental de xenobióticos de forma que la inhibición del crecimiento de la población puede ser cuantificada y relacionada con los niveles de contaminantes en el sedimento con el fin de determinar su calidad. Los resultados demostraron que tanto la presencia de metales (Cd, Cr, Hg y Zn) como de contaminantes orgánicos (PAHs y PCBs) en el sedimento afectaron al crecimiento normal del alga mientras que no se detectaron alteraciones por la presencia de Cu. La principal desventaja observada fue el fenómeno de hormesis que ocurre con concentraciones elevadas de materia orgánica en el sedimento enmascarando la toxicidad de los xenobióticos.

Palabras clave: bioensayo, Dunaliella tertiolecta, microalga, toxicidad.

Coastal zones are under environmental pressure due to human activities, and ports are the areas that probably present the highest levels of contaminants in their sediments. In the present study we have combined chemical data and biological effects to determine the sediment quality of six Spanish ports. Trace metals and organic contaminants have been analyzed, and an acute bioassay was carried out in sediment elutriate using the unicellular green alga Dunaliella tertiolecta. The toxicological parameter employed was EC50, which was estimated after exposure to different concentrations of elutriates during 72 h. The development of this alga may be affected when there is a xenobiotic in the environment, and growth inhibition can be quantified and linked to the levels of contaminants in the sediment in order to determine its quality. The results showed that the metals (Cd, Cr, Hg, and Zn) and organic contaminants (PAHs and PCBs) bound to the sediments reduced the normal growth of the alga, but no alterations were detected due to the presence of Cu. The main disadvantage observed was the hormesis produced by the presence of high levels of organic material in the sediment that might hide the toxicity of xenobiotics.

Key words: bioassay, Dunaliella tertiolecta, microalga, toxicity.

Introducción

Ciertos sedimentos de puertos tienen una concentración de contaminantes que, en caso de dragado y vertido libre al mar, podrían representar un riesgo ambiental para la biota. Con el fin de regular los procesos de dragado, la Comisión Europea (Decisión 2000/532/CE modificada por la Decisión 2001/ 118CE) determinó qué materiales pueden ser considerados peligrosos en función de las concentraciones de contaminantes químicos (Casado-Martínez et al. 2006). En España actualmente se está revisando una directiva que regule los procesos de disposición de los dragados de puertos que incluye tanto la caracterización fisicoquímica de los sedimentos como su evaluación ecotoxicológica.

Los bioensayos o pruebas de toxicidad se diseñaron para evaluar la toxicidad potencial de contaminantes de distinta naturaleza. Estas pruebas se basan en la respuesta de organismos vivos frente a xenobióticos (Streb et al. 2002) y muchas de ellas utilizan la inhibición de la tasa de crecimiento como parámetro toxicológico. El efecto de una sustancia química en un organismo depende en gran medida de factores abióticos, de forma que el desarrollo de ensayos de toxicidad bajo condiciones controladas de laboratorio permite estandarizar y adecuar la prueba para caracterizar la toxicidad de sedimentos. Además, estos ensayos son relativamente fáciles de realizar y de bajo costo. Las algas son organismos apropiados para realizar pruebas de toxicidad dada su sensibilidad a la contaminación ambiental y su abundancia en ecosistemas acuáticos (Millán de Kuhn et al. 2006). Se han realizado estudios de inhibición del crecimiento en microalgas expuestas a sedimentos con metales traza (Moreno-Garrido et al. 2003) y, en particular a Cu en el agua (e.g., Nikookar et al. 2005, Stauber et al. 2005, Levy et al. 2007). Para cuantificar la respuesta de las microalgas a determinados contaminantes a menudo se han empleado las curvas de concentración efectiva (EC) a partir de series de dilución, utilizando como parámetro toxicológico la EC50, o concentración de muestra que produce una inhibición del efecto máximo (Millán de Kuhn et al. 2006).

El presente estudio pretendió determinar las ventajas e inconvenientes del uso de la microalga verde Dunaliella tertiolecta para caracterizar la calidad ambiental de dragados de sedimentos portuarios. Esta especie crece en un amplio rango de salinidad (3-50) (Ginzburg et al. 1990) y su uso en ensayos de toxicidad ha tenido éxito en estudios previos realizados con distintos contaminantes (Gaggi et al. 1995) y aguas residuales (Walsh y Alexander 1980, Walsh et al. 1980, Walsh y Merril 1984, Sbrilli et al. 1990) por lo que podría ser una herramienta útil para llevar a cabo gestión de calidad ambiental de sedimentos.

Material y métodos

Para realizar este estudio se seleccionaron 22 muestras de sedimento de seis puertos localizados en el norte y sur de España (fig. 1): B1, B2, B3 y B4 en Barcelona, puerto de gran importancia para el transporte marítimo; BI1, BI2 y BI3 en Bilbao, localizado en las proximidades de industrias del metal; PA1, PA2, PA3 en Pasajes, puerto caracterizado por la contaminación orgánica de sus sedimentos; H1, H2, H3 y H4 en Huelva, donde destaca la presencia de metales; C1, C2, C3 y C4 en Cartagena, influenciado por fuerte actividad minera en las últimas decadas; y CA2, CA3 y CA4 en Cádiz, con ausencia de fuentes de contaminación destacables. Se utilizó como referencia sedimento de una zona de la bahía de Cádiz (CA1) que presentaba baja contaminación y ausencia de toxicidad en estudios previos con otros organismos (Riba et al. 2003).

Toma de muestras y análisis fisicoquímicos

Los sedimentos se recolectaron utilizando una draga Van Veen con una superficie efectiva de muestreo de 0.024 m². La penetración máxima de la draga se estimó en 10 cm y se descartaron todas aquellas muestras que no alcanzaran un mínimo de 2/3 del volumen de la draga. El transporte de las muestras se realizó en contenedores de plástico herméticamente cerrados, y en oscuridad, los cuales fueron almacenados a 4°C antes de ser utilizados. El tiempo de conservación no excedió en ningún caso los 14 días. Una vez en el laboratorio, el sedimento fue tamizado (excepto una parte destinada a la caracterización granulométrica) a través de una malla de 1 mm de tamaño de poro; se tomaron alícuotas para llevar a cabo la caracterización físicoquímica y el resto del sedimento tamizado fue almacenado para la realización de los ensayos de toxicidad. El proceso de tamizado fue realizado con el fin de eliminar posibles interferencias como restos de conchas, depredadores, residuos en general, etc. Se determinó la granulometría y el contenido de carbono orgánico en las muestras (Gaudette et al. 1974, El Rayis 1985). Los análisis químicos se llevaron a cabo en el Centro de Estudios y Experimentación de Obras Públicas, siguiendo sus recomendaciones (CEDEX 1994); los metales traza fueron analizados por espectrofotometría de absorción atómica (Loring y Rantala 1992, Prego et al. 2006), los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS; Soriano-Sanz et al. 2006, Fernández et al. 2006), y los bifenilos policlorados (PCBs) por cromatografía de gases acoplada a un detector de captura de electrones (USEPA SW-846 Method 827C78082) (USEPA 1994).

Ensayo de toxicidad

La prueba de toxicidad se llevó a cabo con el microalga marina D. tertiolecta y se basó en el estudio de la inhibición del crecimiento debida a la presencia de sustancias tóxicas en el lixiviado. Para realizar el bioensayo se siguió un protocolo similar a los ya estandarizados con otras especies de algas (Chiaudani y Vighi 1978; APHA-AWWA-WPCF 1980; Elnabarawy y Welter 1984; EPA 1988, 1991, 1994; ARPAT 1998) así como a los realizados por otros autores con D. tertiolecta para caracterizar aguas residuales y contaminantes de referencia (Walsh y Alexander 1980, Walsh et al. 1980, Walsh y Merril 1984, Sbrilli et al. 1990, Gaggi et al. 1995). Para preparar el lixiviado de sedimento se tomaron 5 g de peso seco de muestra húmeda la cual se agitó con agua marina artificial (1:4) durante 1 h. Pasado ese tiempo la muestra se centrifugó durante 20 min a 3200 rpm y se realizaron seis diluciones (1:2) con el sobrenadante extraído. Estas diluciones de lixiviado fueron los medios donde se desarrolló el bioensayo. Antes de realizar los ensayos de toxicidad se determinó que el crecimiento exponencial para la población del alga se daba en los primeros 3-4 días (fig. 2) por lo que se seleccionó este periodo para obtener el inóculo que sería utilizado en la exposición a los lixiviados de los sedimentos. Siguiendo las recomendaciones de estudios previos (Sbrilli et al. 1990, Gaggi et al. 1995) a cada concentración y sus respectivas réplicas (cuatro) se añadió una cantidad conocida de células de Dunaliella en fase exponencial de crecimiento, y se incubaron en placas de 6 × 4 pocillos durante 72 h tras las cuales se estimó la densidad celular. Estos procedimientos se desarrollaron bajo campana de flujo laminado en condiciones estériles. Durante el periodo de incubación se mantuvo una agitación a 90 rpm, luz continua y una temperatura en torno a 20°C. El recuento de las microalgas se realizó mediante observación al microscopio usando una camara de Bürker.

A partir de los resultados obtenidos se calculó EC50 mediante Probit-Analysis-Program, versión 1.5. Los resultados de los análisis fiscoquímicos del sedimento y los valores de toxicidad fueron normalizados para realizar un análisis de factores. El objetivo era explicar de forma simple y gráfica las relaciones observadas entre un número inicial de variables utilizando un número menor de factores, mediante el método de componentes principales (PCA).

Resultados

Análisis químicos

La estación CA1 seleccionada en el saco interno de la bahía de Cádiz presentó los niveles más bajos de metales y ausencia de contaminación orgánica (tabla 1). Por otro lado, las estaciones CA2, CA3 y CA4 presentaron un tamaño de grano variable (59-99%) y un mayor contenido en carbono orgánico (13.824.3%). El puerto de Huelva se encuentra en la Ría de Huelva, formada en el estuario de los ríos Tino y Odiel, y se caracteriza por una gran contaminación metálica debido a la proximidad de la Faja Pirítica Ibérica (Casado-Martínez 2006). Los sedimentos de las estaciones de Huelva (H#) presentaron altos niveles de contaminación por metales, especialmente de Cu (1.9-1938 mg kg^-1), Zn (20.9-2458 mg kg^-1), Ni (0.8-34.6 mg kg^-1) y el metaloide As (4.7-840 mg kg^-1). Sin embargo, los puntos de muestreo de Cartagena (C#) presentaron una mayor concentración en metales (e.g., Cd: 6.8-98.5 mg kg^-1, Hg: 21.6-136 mg kg^-1, Pb: 487-1397 mg kg^-1, Zn: 901-8661 mg kg^-1) ya que además de su intensa actividad marítima, el puerto se ha visto influenciado por las actividades industriales relacionadas con la minería desarrollada en la zona durante décadas. Por otra parte los puertos de Bilbao (BI#), Pasajes (PA#) y Barcelona (B#), en el norte de España, presentaron una importante concentración de contaminantes orgánicos en sus sedimentos (PCBs: 49.2-273, 22.1-256 y 240-740 μg kg^-1 en Barcelona, Bilbao y Pasajes; PAHs: 0.3-1.8, 0.6-66.7 y n.d-1.1 mg kg^-1 en Barcelona, Bilbao y Pasajes, respectivamente) debida a la actividad marítima y/o pesquera que en ellos se desarrolla.

Prueba de toxicidad

En la figura 3 se muestran los resultados de EC50 obtenidos en los ensayos de toxicidad con Dunaliella. Algunos de los tratamientos no mostraron toxicidad sino que se observó una inducción considerable del crecimiento de la población, en concreto CA1 y CA2 (Cádiz), B1 y B2 (Barcelona) y H3 (Huelva). Tampoco se observó toxicidad en las poblaciones de microalga expuestas a los sedimentos de CA3 (Cádiz), C4 (Cartagena) y H4 (Huelva). Por otra parte las muestras C2 (Cartagena), B4 (Barcelona), BI1 (Bilbao), PA3 (Pasajes) y H1 (Huelva) mostraron los valores más bajos de EC50, es decir una mayor toxicidad.

Análisis multivariante

Se realizó un análisis de factores con el fin de correlacionar las variables de contaminación y toxicidad y a su vez conocer la influencia de estas correlaciones en cada una de las estaciones de los puertos en estudio. De esta forma se obtuvieron tres factores que agrupan las variables originales (tabla 2). El primer factor (factor 1) explica 31% de la varianza y relaciona la presencia de los metales Cd, Cr, Hg, Pb y Zn con la toxicidad observada en el bioensayo con Dunaliella. El peso del factor 1 en cada una de las estaciones de estudio (fig. 4) demuestra que los sedimentos del puerto de Cartagena (C1 > C3 > C2) presentarían la mayor toxicidad por metales, seguidos de B4 (Barcelona), H2 (Huelva) y PA1 y PA2 (Pasajes). El factor 2 (23%) correlacionó el contenido de finos y de carbono orgánico en el sedimento con la contaminación orgánica de los mismos (PAHs y PCBs) y la toxicidad producida a la microalga. Este factor explica principalmente la situación de las estaciones de Bilbao y Pasajes, con mayor contaminación orgánica. En el caso de la estación CA4, ésta presenta peso positivo para este factor y ausencia de contaminación orgánica.

Discusión

A partir de los resultados químicos obtenidos se observó que los niveles de contaminación de los puertos son, en general, mayores a los niveles ambientales comunes, lo que es debido a las diferentes actividades que se desarrollan en estas zonas y repercute de manera muy notable en los sedimentos. De las zonas seleccionadas podemos destacar los puertos de Cartagena y Huelva como los afectados por contaminación metálica en mayor grado (con valores máximos de As: 840 mg kg^-1; Cd: 98.5 mg kg^-1; Cu: 1938 mg kg^-1; Hg: 136 mg kg^-1; Ni: 129 mg kg^-1; Pb: 1397 mg kg^-1; Zn: 8661 mg kg^-1), mientras que los que presentan niveles más elevados de compuestos orgánicos en sus sedimentos son Bilbao y Pasajes (PCBs: 740 μg kg^-1; PAHs: 66.7 mg kg^-1). El contenido de arena no parece estar relacionado con los contaminantes mientras que el porcentaje de finos se vincula con el contenido de carbono orgánico y la contaminación orgánica. Ambos tipos de contaminación (metálica y orgánica) han demostrado tener efectos tóxicos en el ensayo con D. tertiolecta, y tanto el Cd, Cr, Hg, Zn, PAHs y PCBs parecen inhibir el crecimiento de D. tertiolecta. En el caso de la estación CA4, se considera que el alto contenido en carbono orgánico en los sedimentos localizados en la dársena pesquera produce la toxicidad observada. Además, en el análisis estadístico se observa contaminación por As, Cu y Ni en las estaciones de Huelva (H1, H2 y H3) y que no está asociada a efectos tóxicos sobre el organismo estudiado. Por otro lado el contenido de carbono orgánico también puede afectar el desarrollo del alga. No se han detectado correlaciones entre el alto contenido de Cu, As y Ni de los sedimentos de varios de los puertos estudiados, aunque es conocido que D. tertiolecta es menos sensible al Cu que otras especies de microalgas (Nikookar et al. 2005, Levy et al. 2007). Es posible que el metal, a pesar de aparecer en elevadas concentraciones en los sedimentos, no se encontrara biodisponible. Una desventaja que hemos observado en el uso de esta especie con muestras ambientales de sedimento consiste en el efecto de hormesis que se ha observado en algunos de los tratamientos y que puede enmascarar los efectos tóxicos de los contaminantes asociados. Este fenómeno se ha observado en este tipo de ensayos con otras microalgas (Hall et al. 1996, Adams y Stauber 2004), presumiblemente por la presencia de nutrientes en el sedimento. Una posible solución a tal problema sería medir el contenido de nutrientes de los sedimentos y establecer una limitación del método en función de la concentración de los mismos; eliminar los nutrientes antes del ensayo de toxicidad podría modificar el estado de biodisponibilidad de los contaminantes y alterar la composición inicial de los sedimentos.

En general, la prueba de toxicidad con D. tertiolecta representa una herramienta útil al trabajar con lixiviados de sedimentos portuarios donde generalmente hay altos niveles de xenobióticos. El estudio multivariante que determina las correlaciones entre contaminantes y efectos tóxicos permite conocer la bioreactividad de las sustancias de una forma sencilla, económica y eficaz. Aún así consideramos que es una prueba que debe realizarse dentro de una batería de bioensayos que incluya otras vías de exposición a los sedimentos.

Agradecimientos

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