Efectos de la exposición al arsénico en Corbicula fluminea: Evaluación de las respuestas histológicas, histoquímicas y bioquímicas

Effects of exposure to arsenic in Corbicula fluminea: Evaluation of the histological, histochemical and biochemical responses

MS Diniz^1*, HM Santos², PM Costa¹, I Peres¹, MH Costa¹, S Alves³, JL Capelo-Martinez²

¹ IMAR-Instituto do Mar, Departamento de Ciências e Engenharia do Ambiente, Faculdade de Ciências e Tecnología da Universidade Nova de Lisboa, Quinta da Torre-2829-516 Caparica, Portugal. * E-mail: mesd@fct.unl.pt

³ Centro de Química Estrutural, Instituto Superior Técnico da Universidade Técnica de Lisboa, Avenida Rovisco Pais, 1049-001 Lisboa, Portugal.

Recibido en febrero de 2008.
Aceptado en julio de 2008.

Resumen

El arsénico (As) es un elemento común en los ambientes acuáticos y se origina de procesos tanto antropogénicos como naturales. Es un metaloide tóxico, especialmente en su forma trivalente (arsenito) para los organismos vivos, incluidos los humanos. La contaminación por As de los recursos hídricos, especialmente el agua subterránea y potable, es un problema serio de salud pública en varias regiones del mundo, particularmente en Asia, donde ha sido identificado como promotor de cáncer y otros tipos de patologías. El objetivo principal del presente estudio fue evaluar los efectos toxicológicos, la bioacumulación y la capacidad reguladora del bivalvo Corbicula fluminea expuesto a diferentes concentraciones de este elemento en el agua. Cien individuos de C. fluminea de agua dulce (1.6 ± 0.3 g) del Río Miño (Portugal) fueron distribuidos aleatoriamente en 10 tanques de 20 L y expuestos a diferentes concentraciones nominales de As (100, 300, 500 y 1000 μg L^-1) por 28 días. Se utilizó como control un tanque con el mismo tipo de agua (libre de cloruros), pero sin As. El experimento se realizó por duplicado, a una temperatura constante de 20 ± 1°C. Los resultados mostraron un aumento significativo (P < 0.01) del As en la concentración total y en la fracción citosólica después de 28 días de exposición en todos los tratamientos. También se detectó un incremento significativo (P < 0.01) en la concentración de metalotioneínas en los bivalvos expuestos a las diferentes concentraciones de As, en comparación con los controles. La evaluación histológica e histoquímica proporcionó clara evidencia de que el As es acumulado en los tejidos, especialmente en la glándula digestiva, y que causó alteraciones de los tejidos en 50% de los organismos.

Palabras clave: acumulación, arsénico, biomarcadores, Corbicula fluminea, histopatología.

Arsenic (As) is a common element in aquatic environments and it is originated from both anthropogenic and natural processes. It is a toxic metalloid, especially in the trivalent form (arsenite), to humans and wildlife, and consequently its contamination of aquatic environments (especially groundwater and drinking water) is a serious public health problem in several regions around the globe, particularly in Asia, since it is known to cause cancer and other types of pathologies. The main goal of the present study was to assess the toxicological effects, bioaccumulation and ability to regulate As in Corbicula fluminea (Muller 1744), exposed to different concentrations of As in the water. One hundred fresh-water bivalves (1.6 ± 0.3 g) from the Minho River (Portugal) were randomly distributed in ten 20-L tanks and exposed to different nominal concentrations of As (100, 300, 500, and 1000 μg L^-1) for 28 days. A tank with tap water free of chlorine was used as control. The assay was performed in duplicate, at a constant temperature of 20 ± 1°C. The results showed a significant increase (P < 0.01) of As in the total concentration and cytosolic fraction after 28 days of exposure in all treatments. A significant increase (P < 0.01) in metallothionein concentration was also detected in bivalves exposed to the different concentrations of As, in comparison with the controls. The histological and histochemical evaluation provided clear evidence that As accumulated in tissues, especially in the digestive gland, and caused tissue alterations in 50% of the organisms.

Key words: accumulation, arsenic, biomarkers, Corbicula fluminea, histopathology.

Introducción

Los bivalvos han sido reconocidos como organismos centinelas de ecosistemas acuáticos porque dan información precisa y global sobre el impacto ambiental y la biodisponibilidad de compuestos químicos (Bilos et al. 1998). Corbicula fluminea (Muller 1744) es un bivalvo de agua dulce del sureste de Asia que se ha dispersado progresivamente a nivel mundial, colonizando varios países fuera de su biota original, incluyendo los Estados Unidos de Norteamérica y, más recientemente, algunos de Europa, done fue observado por primera vez alrededor de 1980 en Francia (Río Dordoña) y Portugal (Río Tajo) (Mouthon 1981). Presenta una dinámica invasiva al colonizar ríos, canales y lagos, donde vive semienterrado en las capas superficiales del sedimento (Mouthon 2001) y se alimenta de fitoplancton y seston, pero también es capaz de recolectar material orgánico del sedimento (Mouthon 2003), lo cual contribuye a que C. fluminea sea un serio candidato para ser utilizado como molusco centinela de agua dulce en programas de monitoreo ambiental (Vidal et al. 2002). Según Baudrimont et al. (1997), desde un punto de vista ecotoxicológico, C. fluminea es un modelo muy interesante ya que vive enterrado en los sedimentos superficiales, filtrando grandes volúmenes de agua (cerca de 10 L almeja^-1 día^-1), y consecuentemente puede bioacumular grandes cantidades de metales.

El arsénico (As) es un elemento que se puede encontrar en distintas regiones geográficas alrededor del mundo, contaminando los recursos hídricos y, por tanto, representa un riesgo potencial para la salud humana y la fauna silvestre. En algunas regiones de Asia, como Bangladesh, el envenenamiento crónico por As constituye un serio problema de salud pública asociado con varios tipos de patologías, como por ejemplo el cáncer (WHO 2001, Vahter 2002). Además, las actividades antropogénicas y descargas puntuales de contaminantes, como las ocurridas sobre la plataforma continental del Atlántico NE por el transporte del petróleo y sus derivados, han vertido grandes cantidades de metales (e.g., Cd, Cu, Pb, Mo, Ni) y metaloides (As) al ambiente marino (Fernández et al. 2006, Prego et al. 2006). En Portugal existen algunas localidades donde los niveles de As exceden los estándares para el agua potable (e.g., Alpiarga, Valbom, Vila Flor, Ponte de Sor) (IRAR 2005). En algunos estudios se han encontrado niveles elevados de As en bivalvos marinos como ostiones y mejillones (Valette-Silver 1999), poliquetos marinos (Waring and Maher 2005), cangrejos (Martín-Díaz et al. 2006) y peces (Mason et al. 2000, Besada et al. 2006). Aunque este metaloide ha sido sujeto de muchos estudios toxicológicos, aún existen incógnitas en cuanto a sus efectos en organismos vivos, especialmente en los que viven en ecosistemas de agua dulce.

La resistencia de los bivalvos a la toxicidad causada por los metales es atribuida normalmente a la acción de mecanismos de destoxificación (Couillard et al. 1993). Una respuesta celular específica del organismo a un ambiente contaminado por metales es la inducción de metalotioneínas (MTs). Esta hipótesis aún está en discusión (Romero-Isart y Vasák 2002) ya que existen otros contaminantes que pueden inducir la producción de MTs (e.g., especies reactivas del oxígeno, estrés físico, o una infección). No obstante, la producción de MTs causada por otros agentes generalmente es menor que la causada por los metales (Kagi 1993), por lo que se ha propuesto el uso de las MTs como un biomarcador potencial en el monitoreo ambiental de organismos acuáticos expuestos a metales (Roesijadi 1999, Oliver y Fisher 1999, Domouhtsidou et al. 2004). La producción de MTs fue descrita por primera vez por Margoshes y Vallee (1957) en la corteza renal de equinos; desde entonces ésta ha sido identificada en otros organismos como peces, moluscos y crustáceos, con las siguientes propiedades comunes: bajo peso molecular, alto contenido de residuos de cisteína, ausencia de aminoácidos aromáticos, y estabilidad térmica y ácida (Carpéne 1993, Stillman 1995, Bebianno et al. 2004).

El objetivo de este trabajo fue determinar la bioacumulación de As total en los tejidos blandos de C. fluminea después de cuatro semanas de exposición a diferentes concentraciones de este elemento en agua. Además, se estudió la distribución de As en los tejidos blandos y las fracciones citosólicas procesadas para la cuantificación de las MTs a fin de determinar la correlación entre la inducción de proteínas similares a las MTs y las concentraciones de As en ambas fracciones. También se evaluó la capacidad de C. fluminea para regular este metaloide y neutralizar su potencial tóxico.

Procedimiento experimental

El material biológico usado para realizar los experimentos fue el molusco de agua dulce C. fluminea. Los individuos de esta especie se recogieron del Río Miño (norte de Portugal) en diciembre de 2005 y se llevaron al laboratorio donde se mantuvieron en tanques de agua con recirculación, filtrada y continuamente aireada, a una temperatura constante de 20 ± 1°C. Después de un periodo de aclimatización de dos semanas, 100 individuos (masa de tejido = 1.6 ± 0.3 g; longitud de concha = 1.9 ± 0.2 cm) se distribuyeron al azar en 10 tanques de polivinilo de 20 L y fueron expuestos a diferentes concentraciones nominales de As (III) (0, 100, 300, 500 y 1000 μg L^-1), añadido al principio de cada experimento. Las soluciones de As fueron preparadas a partir de una solución de As inórganico trivalente estándar Aldrich (St. Louis, MO, EUA), diluida con agua destilada hasta una concentración final de 100 mg L^-1. Se agregaron alícuotas de esta solución a los tanques experimentales según las concentraciones nominales requeridas. El experimento fue estático, y se realizó por duplicado a 20 ± 1°C, durante 28 días usando agua potable sin cloro y un fotoperiodo constante (12 h luz:12 h oscuridad). Se usaron dos tanques con agua de la llave (sin cloro) como control, en los que diariamente se monitorearon temperatura y pH con un potenciómetro Orion 290 (Orion Research Inc., EUA), y conductividad eléctrica mediante un medidor de conductividad y salinidad Orion 140 (Orion Research Inc., Alemania). Los bivalvos fueron alimentados diariamente con ración para peces (Dibaq, España). Después de 28 días de exposición al As, los organismos se sacaron de los tanques y, después de usar un bisturí para cortar los músculos aductores y abrirlos, se les etxrajeron los tejidos blandos. Estos fueron pesados (peso húmedo) y secados en una estufa de aire forzado a 60°C durante cinco días (peso seco), y luego se almacenaron a -80°C hasta su posterior análisis. Se registró la longitud de la concha de cada individuo y se tomaron muestras de agua de cada tanque al principio y al final del experimento para determinar la concentración total de As.

Histología e histoquímica

Se fijaron submuestras del tejido de C. fluminea en una solución de Bouin-Hollande por 48 h, que fueron tratadas usando los procedimientos histológicos estándares descritos por Martoja y Martoja (1967). Después de su inclusión en parafina, se tiñeron secciones de 5 a 7 μm de espesor con hematoxilina y eosina, y se montaron para su observación al microscopio. La histoquímica se realizó siguiendo el método de Castel según lo descrito por Lillie (1965) para observar los gránulos de As en los tejidos. La investigación histológica e histoquímica de los efectos del As en los tejidos se hizo usando un microscopio óptico (Leica-ATC 2000, Wetzlar, Alemania).

Cuantificación de las metalotioneínas

El procedimiento para determinar las MTs fue previamente descrito y utilizado por Olafson (1981) y Thompson y Cosson (1984). Brevemente, se extrajeron las MTs mediante la homogeneización del tejido blando de C. fluminea en Tris-HCl (0.02 M, pH = 8.6) en una propoción 1:4 (tejido:tampón), en un baño de hielo, usando un rotor equipado con un martillo TFE (Heidolph-RZR 2100, Heidolph Elektro GmbH & Co. KG, Kelheim, Alemania). Subsecuentemente se tomaron submuestras para las determinaciones de las razones de peso húmedo:seco y el análisis del As. Una fracción del homogeneizado (3 mL) de cada muestra se centrifugó (30,000 g a 4°C) durante 1 h. Se separó el citosol (sobrenadante) del sedimento y se colocó en un baño de agua a 80°C por 10 min para desnaturalizar las proteinas de alto peso molecular y las térmicamente inestables, seguido por centrifugación (30,000 g a 4°C) durante 1 h. La fracción citosólica así obtenida fue guardada a -80°C para la determinación de las MTs. La cuantificación de las MTs en la fracción citosólica tratada térmicamente fue hecha utilizando polarografía de pulso diferencial para los grupos tiólicos (-SH), usando la reacción de Brdička. La determinación fue realizada usando una base Metrohm 694 y un procesador 693 (Metrohm Ltd., Herisau, Suiza), con un electrodo de gota de mercurio, siguiendo los métodos descritos por Thompson y Cosson (1984) y Olafson y Olsson (1991). El sistema de triple electrodo estaba compuesto por un electrodo capilar de mercurio, un electrodo de platino, y un electrodo de referencia de Ag/ AgCl. El electrolito soporte de Brdička se preparó semanalmente siguiendo el método propuesto por Palecek y Pechan (1971) y Thompson y Cosson (1984), consistente en NH₄Cl 1M, NH₄OH 1 M y [Co(NH₃)₆]Cl₃ 2 mM, y se almacenó a 4°C. Se usó Triton x-100 (2.5 x 10^-2 % (v/v) Sigma, St. Louis, MO, EUA) para eliminar la línea máxima secundaria y la mínima y para eliminar la línea de base (Bebianno y Langston 1989). Debido a la falta de un estándar de MT específicamente de molusco, se utilizó como estándar MT de hígado de conejo (formas I y II, Sigma, St Louis, MO, EUA), preparada en agua desionizada a una concentración de 10 mg L^-1. Para realizar las mediciones se agregaron 20 mL del electrolito soporte directamente en la celda polarográfica, junto con 250 μL de Triton x-100 y alícuotas de la solución estándar de MT de conejo (250 μL) y de muestra (25-150 μL). La celda fue purgada con nitrógeno purificado por 120 seg antes del análisis (Thompson y Cosson 1984). Se determinaron las concentraciones de MTs mediante el método de adiciones estándar según Bebianno y Langston (1989), y los resultados se expresaron en mg g^-1 de peso seco del material homogeneizado.

Determinación del arsénico

Las muestras de tejido blando se secaron a 60°C por cinco días, siendo después disueltas en bombas de digestión presurizadas durante 24 h con ácido nítrico concentrado (5 mL de HNO₃-Suprapur, Merck, Darmstadt, Alemania) en celdas de Teflón a temperatura ambiente. Después las muestras se calentaron a 100°C por 4 h, antes de añadir 1 mL de H₂O₂ (Bryan et al. 1985). Después de esperar 1 h, las muestras fueron diluidas en 25 mL de agua ultrapura (Milli-Q plus).

Las muestras de agua (n = 3 por cada condición experimental) se recogieron en botellas de polietileno al principio y final de cada experimento y se acidificaron con 10 μL mL^-1 HNO₃ (Suprapur, Merck, Darmstadt, Alemania), almacenándose a 4°C. El As se determinó mediante espectrometría de absorción atómica electrotermal (GFAAS) con corrección por efecto Zeeman y modificación de matrices (Pd(NO₃)2.2H₂O, Fluka), usando un atomizador de tubo de grafito (AAS, Thermoptec M6Solaar), sin filtración, después de ser diluídas con agua ultrapura. Se prepararon soluciones estándar a partir de un estándar de As inorgánico comercial para absorción atómica (N 206962, 1 g L^-1, Aldrich, EUA). La concentración total de As se determinó mediante una curva de calibración estándar. Los límites de detección y cuantificación fueron 3.1 y 9.3 μg L^-1, calculados con los criterios de 3σ y 10σ, respectivamente.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con el test no paramétrico U de Mann-Whitney para determinar las diferencias entre las muestras y los controles. Las correlaciones se hicieron usando el test no paramétrico "Spearman Order Rank Correlations R". Para toda la estadística se usó el paquete Statistica 5.0 (StatSoft Inc., EUA, 1995), con un nivel de significancia de 0.01.

Resultados

Independientemente del nivel de As estudiado no se registró mortandad en los ensayos a lo largo del periodo experimental de 28 días. Los parámetros fisicoquímicos se mantuvieron estables con buenos valores durante todo el experimento (temperatura, 20 ± 2°C; pH, 7.0 ± 0.2; conductividad, 545 ± 10 μS cm^-1. En la tabla 1 se presentan las medidas de As total en las muestras objeto de estudio al principio y final del experimento.

Los resultados obtenidos para la acumulación de As total en los tejidos blandos de C. fluminea se muestran en la figura 1. El mayor valor medio (145 ± 26 μg g^-1 p.s.) fue obtenido en los tejidos blandos de organismos expuestos a 1000 μg As L^-1. El menor valor medio (0.7 ± 0.1 μg g^-1 p.s.) se midió en la fracción citosólica del grupo control. El análisis estadístico de los resultados mostró que las concentraciones de As total determinadas en los organismos expuestos en todos los tratamientos fueron significativamente diferentes (P < 0.01) a las de los organismos controles no expuestos. Este resultado se verificó para todo los niveles de As estudiados y para los dos tipos de muestra, tejido completo y fracción citosólica. En la figura 1 también se muestran los valores de MTs para los diferentes niveles de exposición al As. Las concentraciones medias de las MTs por experimento variaron de 6.8 ± 1.2 mg g^-1 (p.s.) en el grupo control, a 19.1 ± 3.7 mg g^-1 (p.s.) en los organismos expuestos a 100 μg As L^-1. Los análisis estadísticos mostraron que la inducción de MTs en las muestras problemas fue significativamente diferente (P < 0.01) de los controles en todos los tratamientos. Se encontró una correlación significativa (R = 0.6, P < 0.01) entre el As presente en la fracción citosólica y las MTs. No obstante, sólo se encontro una correlación marginalmente significativa (R = 0.3, P = 0.09) entre las muestras de tejido completo y las proteínas MTs. De cualquier manera se encontró una correlación significativa (R = 0.7, P < 0.01) entre el As presente en los tejidos y el As encontrado en la fracción citosólica. Los porcentajes de As total determinados en la fracción citosólica variaron de 5.5% en los controles a 17.3% en los organismos expuestos a 100 μg As L^-1 en relación con el As en los tejidos (fig. 2).

Los resultados de la evaluación son consistentes con el fenómeno de bioacumulación, encontrándose gránulos de As en los tejidos de individuos de C. fluminea expuestos a diferentes concentraciones de As, principalmente en las células de la glándula digestiva (fig. 3). Las observaciones histológicas también mostraron que los bivalvos, especialmente los expuestos a 1000 μg As L^-1, presentaron degeneración de las células de la glándula digestiva.

Discusión

Las concentraciones de As total encontradas en los tejidos de los organismos control son del orden de las encontradas por otros autores en las mismas especies (Johns y Luoma 1990), y también en otras especies de bivalvos tales como ostras, almejas y otro tipo de bivalvos (Suñer et al. 1999, Valette-Silver et al. 1999, Argese et al. 2005, Orescanin et al. 2006, Santos et al. 2007). Las concentraciones de As encontradas en las muestras de tejido mostraron un incremento significativo (P < 0.01) después de 28 días de exposición según los diferentes tratamientos estudiados. De igual manera, los niveles de As total encontrados en las fracciones citosólicas indicaron un incremento significativo (P < 0.01) y mostraron una buena correlación con el As presente en las muestras de tejidos (R = 0.7, P < 0.01). Los niveles de As encontrados en el agua mostraron una disminución al final del periodo experimental para todas las concentraciones estudiadas. Esta diferencia puede atribuirse a la bioacumulación del As y, eventualmente, a la adsorción del As en las paredes de los tanques.

Las MTs han sido usadas como biomarcadores de exposición a niveles elevados de metales, donde su inducción normalmente se asocia con elevaciones en la concentración de metales en los tejidos, lo que sugiere una correspondencia entre los metales bioacumulados y la inducción en la producción de MTs (Bebianno y Langston 1993, Roesijadi 1994). La detección e identificación de MTs en tejidos de C. fluminea es un procedimiento frecuente y ya ha sido citada en estudios anteriores (Baudrimont et al. 1997, Marie et al. 2006, Diniz et al. 2007), en los cuales se muestra que este bivalvo es capaz de producir MTs cuando es expuesto a altas concentraciones de metales. Nuestros resultados muestran un incremento significativo en la producción de MTs en todos los experimentos en comparación con los controles, pero no se encontró ninguna diferencia significativa entre los diferentes tratamientos que sugiera que la capacidad para secuestrar As disminuya como resultado de un exceso de As total, como ha sido sugerido por Baudrimont et al. (2003). El aumento en las concentraciones de As total en los tejidos blandos estuvo acompañado por una inducción significativa de MTs en comparación con los controles. De cualquier manera, la mejor correlación se encontró entre el As de la fracción citosólica y las MTs (R = 0.6, P < 0.01), lo que indica una fuerte relación entre el metaloide presente en el citosol y la inducción de MTs. Estos resultados sugieren que, muy probablemente, hay otros mecanismos de destoxificación involucrados en la neutralización de los efectos tóxicos del As, al reducir la disponibilidad intracelular del metal. Algunos de estos mecanismos pueden estar relacionados con el almacenaje intracelular y el secuestro de metales por gránulos pegados a la vesícula y a otras proteínas no MTs citosólicas (Roesijadi y Robinson 1994, Baudrimont et al. 1999, Cecílio et al. 2006). Sebesvari et al. (2005) mostraron que esta especie es capaz de regular el As, y Marie et al. (2006) demostraron que C. fluminea posee mecanismos de destoxificación más eficaces que otro bivalvo de agua dulce, Dreissena polymorpha, incluso en el caso de altas concentraciones de metales (Cd y Zn), probablemente debido a una respuesta adaptativa más eficaz. El bajo porcentajes de As total encontrado en el citosol avala esta hipótesis, sugiriendo que para las concentraciones probadas, C. fluminea es capaz de regular el exceso del metaloide, por lo menos en algún grado, empleando diferentes mecanismos de destoxificación que pueden trabajar en conjunto para este propósito. Debe considerarse también que variables tales como tamaño, peso, diferencias fenotípicas, sexo, condiciones fisiológicas y reproductivas pueden influenciar la bioacumulación de metales (Martín-Díaz et al. 2006).

La histoquímica reveló la presencia de gránulos de As acumulados en los tejidos blandos de los bivalvos, principalmente en las células del tracto digestivo, lo que concuerda con los altos niveles de As total determinados en dichos tejidos, y que a su vez estuvieron directamente relacionados con las diferentes concentraciones a las que fueron expuestos.

El presente trabajo muestra que C. fluminea bioacumula As de acuerdo a las diferentes concentraciones de este metal en el agua. El aumento en la producción de MTs puede ser interpretado como una respuesta de destoxificación a la presión de la presencia de altas cantidades de As en solución. La concentración de As total encontrada en la fracción citosólica es mucho menor que la encontrada en el tejido blando, lo que confirma la hipótesis de que otros mecanismos de destoxificación diferentes a la producción de MTs tienen un papel importante en el proceso de dsetoxificación, ya que estas últimas son proteínas citosólicas. Este trabajo refuerza la posibilidad de utilizar C. fluminea como un potencial bioindicador de la contaminación por As, por lo que se hace necesario desarrollar más estudios usando, por ejemplo, otros tipos de biomarcadores como especies reactivas del oxígeno (ERO), glutatión-S-transferasa o lipídos peroxidados, para complementar el estudio ecotoxicológico del As hecho hasta la fecha en este bivalvo.

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